Methodenartikel

Meningsuiting en zuivering van de TRPC3 mens lipide-gevoelige catie kanaal voor structurele bepaling door Single-deeltje Cryo-elektronenmicroscopie

DOI:

10.3791/58754

⸱

7 januari 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Van Andel Institute, 2Vollum Institute, 3Janelia Research Campus

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft technieken gebruikt om te bepalen van ion kanaal structuren door cryo-elektronenmicroscopie, met inbegrip van een systeem van de baculovirus gebruikt om genen in zoogdiercellen met minimale inspanning en toxiciteit, eiwit winning, zuivering, efficiënt en kwaliteit controleren, Raster monstervoorbereiding en screening, evenals gegevensverzameling en verwerking.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voorbijgaande receptor mogelijke kanalen (TRPCs) van de canonieke TRP onderfamilie zijn opvangfaciliteiten catie kanalen die een essentiële rol bij de calcium-homeostase, met name op de winkel bediende calcium ingang, die is van cruciaal belang spelen voor het behoud van de goede werking van Synaptic vesikel release en intracellulaire signaalroutes. Dienovereenkomstig, TRPC kanalen zijn betrokken in een verscheidenheid van ziekten bij de mens met inbegrip van cardiovasculaire aandoeningen zoals hypertrofie van het hart, neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Parkinson en neurologische aandoeningen zoals spinocerebellar ataxie. Daarom, TRPC kanalen vertegenwoordigen een potentieel farmacologische doelwit in ziekten bij de mens. De moleculaire mechanismen van het gating in deze kanalen zijn echter nog onduidelijk. De moeilijkheid in het verkrijgen van grote hoeveelheden van stabiele, homogene en gezuiverde proteïne is een beperkende factor in structuur vastberadenheid studies, met name voor zoogdieren membraaneiwitten zoals de ionenkanalen TRPC geweest. Hier presenteren we een protocol voor de grootschalige uitdrukking van zoogdieren ion kanaal membraaneiwitten met behulp van een gemodificeerde baculovirus systeem voor de overdracht van de genen en de zuivering van deze proteïnen door affiniteit en grootte-uitsluiting chromatografie. Verder presenteren we een protocol voor het verzamelen van single-deeltje cryo-Elektron microscopie beelden van gezuiverde eiwit en deze om beelden te gebruiken om te bepalen van de eiwitstructuur. Structuurbepaling is een krachtige methode voor het begrijpen van de mechanismen van gating en functie in ionenkanalen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Calcium is betrokken bij de meest cellulaire processen, waaronder signalering cascades, transcriptie controle, neurotransmitter release en hormoon molecuul synthese1,2,3. De homeostatische onderhoud van cytosolische vrij calcium is essentieel voor de gezondheid en functie van cellen. Een van de belangrijkste mechanismen van intracellulair calcium-homeostase is calcium winkel bediende ingang (SOCE), een proces waarin uitputting van calcium in het endoplasmatisch reticulum (ER) triggers de opening van de ionenkanalen op het plasma-membraan opgeslagen te vergemakkelijken de aanvulling ER calcium, die vervolgens kunnen worden gebruikt in de verdere signalering4,5,6. Voorbijgaande receptor mogelijke kanalen (TRPCs), die calcium-permeabele kanalen die behoren tot de superfamilie TRP, hebben geïdentificeerd als een belangrijke deelnemer in SOCE7,8,9 .

Onder de zeven leden in de familie van de TRPC, TRPC3, TRPC6 en TRPC7 vormen een deelgroep van de homologe en ze zijn uniek in de mogelijkheid om te worden geactiveerd door de lipide secundaire messenger diacylglycerol (DAG), een afbraakproduct van de Lipide signalering phosphatidylinositol 4,5-difosfaat (PIP2)10,11. TRPC3 is sterk uitgedrukt in gladde spieren en in de cerebrale en cerebellaire gebieden van de hersenen, waar het essentiële rol in het calcium signalering die van invloed zijn transmissie en neurogenese12,13speelt. Dysfunctie van TRPC3 is gekoppeld aan het centrale zenuwstelsel-stoornissen, cardiovasculaire aandoeningen en bepaalde kankers zoals ovariële adenocarcinoom14,15,16. Daarom, TRPC3 houdt belofte als farmaceutische doel voor de behandeling van deze ziekten. De ontwikkeling van gerichte geneesmiddelen op TRPC3 heeft is beperkt door een gebrek aan begrip van de activering van de moleculaire mechanismen, met inbegrip van lipide bindende sites17,18. Biedt belangrijke inzichten in deze mechanismen19, hebben we de eerste atomaire resolutie structuur van het menselijke TRPC3 kanaal (hTRPC3) en haar twee lipide bandplaatsen in een gesloten toestand, gemeld.

De belangrijkste factor voor het bepalen van de structuur van een membraan eiwit op hoge resolutie is voor eiwitten van hoge kwaliteit. De overeenkomstige screening van expressie en zuivering voorwaarden tot het verkrijgen van hoge kwaliteit proteïne kan een tijdrovende en dure inspanning. Hier presenteren we een protocol beschrijft in detail hoe wij de optimale omstandigheden voor de expressie en de zuivering van hTRPC3, die zich slecht in onze eerste screening gedragen te identificeren. Wij presenteren verschillende belangrijke punten over het oplossen en optimaliseren van het gedrag van de eiwitten, die een solide basis voor onze cryo-Elektron microscopie (cryo-EM) studies leggen. We gebruiken een gemodificeerde baculoviral vector (pEG), ontwikkeld door Gouaux en collega's, dat is geoptimaliseerd voor screening tests en efficiënte generatie baculovirus in zoogdiercellen20genereren. Deze expressie-methode is geschikt voor snelle en kostenefficiënte overexpressie van eiwitten in de celmembraan van zoogdieren. Wij combineren het gebruik van deze vector met een fluorescentie-detectie grootte-uitsluiting chromatografie-gebaseerde (FSEC) methode21prescreening. Deze methode maakt gebruik van een tag van de groen fluorescente proteïne (GFP) gefuseerd tot de constructie van belang en verbetert de visualisatie van de doel-proteïne in kleine, hele-cel ontbindend monsters. Dit zorgt voor screening van eiwitstabiliteit in aanwezigheid van verschillende detergentia en additieven, met thermostabilizing mutaties, en maakt het gebruik van een klein aantal cellen uit kleinschalige voorbijgaande transfectie. Op deze manier kan een veelheid van voorwaarden snel worden gescreend alvorens tot een grootschalige eiwitreiniging. Naar aanleiding van meningsuiting, screening en zuivering presenteren we een protocol voor het verkrijgen en verwerken van beelden uit cryo-EM voor het genereren van een DOVO structurele bepaling van het eiwit. Wij zijn van mening dat de hier beschreven aanpak als een gegeneraliseerd protocol voor structurele studies van TRP kanaal receptoren en andere membraaneiwitten dienen zal.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. de transformatie van de bevoegde cellen van de DH10α voor de productie van Bacmid DNA

  1. Synthetiseren van het gen van belang en subclone het in een gewijzigde versie van de pEG vector met een twin strep-tag, een His8-tag en GFP met een trombine breukzijde op de N-terminus (pFastBacI)20.
  2. Bevoegde cellen transformeren door toevoeging van 5 ng van plasmide met een gewenste gen in pFastBacI tot 50 μl van DH10α cellen in een 1,5 mL tube en incubeer gedurende 10 min op ijs. Warmte schok de cellen voor 45 s bij 42 ° C. Voeg 200 μL van super optimale bouillon met katabole onderdrukker (SOC) medium op de buis en incubeer gedurende 4-8 uur bij 37 ° C in een roteerschudapparaat bij 225 t/min.
  3. Plaat 5 μL van cellen op een bacmid LB agarplaat (50 μg/mL kanamycine, 7 μg/mL gentamicine, tetracycline, 100 μg/mL Bluo-gal en 40 μg/mL isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside [IPTG], agar van 10 μg/mL).
  4. Incubeer de plaat gedurende 48 uur bij 37 ° C.
    Opmerking: De Bluo-gal indicator vlekken koloniën, die nog steeds uiten lacZ (vector invoeging mislukte), waardoor voor selectie van witte (met succes getransformeerd) koloniën.
  5. Selecteer zorgvuldig een geïsoleerde witte kolonie, het vermijden van eventuele witte koloniën die in contact met blauwe kolonies, en groeien van cellen overnachting in 6 mL bacmid LB voedingsbodem (50 μg/mL kanamycine, 7 μg/mL gentamicine, 10 μg/mL tetracycline) bij 37 ° C in een roteerschudapparaat bij 225 t/min.

2. bacteriële voorbereiding voor isolatie van Bacmid DNA

  1. Isoleren bacmid DNA, spin down Escherichia coli cellen gedurende 10 minuten bij 2880 x g.
  2. Gooi het supernatant en resuspendeer de pellet in 200 µL van cel resuspensie oplossing van de miniprep (Zie Tabel van materialen) door pipetteren Kit. Zorg ervoor dat de pellet is volledig en homogeen opgeschort. Pipetteer vervolgens de celsuspensie in 1,5 mL tubes.
  3. Voeg 200 µL van de oplossing van de lysis van de cel uit de miniprep kit en meng door het omkeren van de buis een paar keer. Incubeer gedurende maximaal 5 minuten bij kamertemperatuur (RT) Lyse de cellen. 200 µL van neutralisatie oplossing toevoegen vanuit de miniprep kit en meng door het omkeren van de buis een paar keer om te stoppen met de lysis van de reactie.
  4. Spin down voor 10 min op 21,130 x g in een centrifuge tafelblad. Verzamelen van 600 μL van de bovendrijvende substantie in een tube van 2 mL. Toevoegen van 600 μL fenol: chloroform: isoamyl alcohol oplossing (Zie Tabel van materialen) en meng grondig om het DNA uit de rest van de producten van de lysis van de cel.
    Let op: Fenol: chloroform: isoamyl alcohol oplossing is vergiftig bij inademing, aanraking met de huid en opname door de mond. Het chemische brandwonden kan veroorzaken en is mogelijk kankerverwekkend. Draag handschoenen en een dichtgeknoopt laboratoriumjas. Werken in een zuurkast. Verwijdering van deze gevaarlijke afvalstoffen op de juiste manier.
  5. Draai de buis gedurende 10 minuten bij 21130 x g in een centrifuge tafelblad. Twee verschillende vloeibare fasen zullen zichtbaar zijn. Zorgvuldig overbrengen 300 μL van de bovenste waterfase een nieuwe buis. Voeg 600 l 100% ethanol te wassen van het DNA. Voorzichtig omkeren de buis te mengen.
    Opmerking: Doe niet vortex, zoals dit bacmid DNA kunt schuintrekken.
  6. Cool buizen door ze te plaatsen in een vriezer van-20 ° C gedurende 10 minuten Spin down voor 10 min op 21,130 x g in een centrifuge tafelblad. Verwijder het supernatant en behouden van de DNA-pellet.
  7. Voeg vervolgens 1 mL van 70% ethanol te wassen de pellet. Voorzichtig omkeren de buis te mengen. Spin voor 10 min op 21,130 x g in een centrifuge tafelblad. Verwijder het supernatant en laat de pellet in de lucht droog gedurende ongeveer 5 minuten of totdat er geen vloeistof is zichtbaar in de buis en de DNA-pellet wordt doorzichtig.
  8. Resuspendeer de pellet droog in 50 µL van steriele, DNase-vrije, gedeïoniseerd water. Het meten van de concentratie van DNA.
    Opmerking: Bacmid DNA niet invriezen. Bewaren bij 4 ° C voor maximaal enkele dagen.

3. de transfectie van Sf9 Insect cellen met Bacmid voor de productie van P1 Baculovirus

  1. Zaad 0.9 x 106 Sf9 cellen per putje in 2 mL zuiver geschikte voedingsbodem (Zie Tabel van materialen) in elk putje van de plaat van een 6-well weefselkweek. Incubeer de cellen bij 27 ° C gedurende 20 min ter bevordering van de gehechtheid aan de plaat.
    Let op: Celculturen zijn een potentiële biohazard. Werken in een erkende laminaire flow kap met behulp van aseptische technieken en controleren van institutionele en gouvernementele richtsnoeren voor aanbevolen beschermende kleding en correcte afvoer van de afvalstoffen voorafgaand aan het uitvoeren van experimenten.
  2. Na bijlage, voeg 8 µL van transfectiereagens (Zie Tabel van materialen) naar 100 µL van media voor elk putje van de 6 goed plaat wordt transfected in een steriele buis. 6 μg van bacmid DNA aan 100 µL van medium in een aparte steriele buis toevoegen. Incubeer 5 min op RT. combineren de twee oplossingen en incubeer gedurende 45 min op RT.
  3. Het medium in de 6 putten vervangen door 2 mL verse voedingsbodem. Voeg het mengsel uit de vorige stap aan elk goed ontkleuring (200 µL per putje). Zachtjes rock de plaat zodat vermenging van de transfectie oplossing in het medium.
    Opmerking: Niet swirl of schudden van de plaat omdat dit zal leiden tot cellen om los te maken.
  4. Incubeer de cellen voor 5 d (120 h) in een 27 ° C bevochtigde incubator. Controleren van GFP fluorescentie vóór de oogst om te controleren dat virus wordt geproduceerd in een groot aantal cellen; Als het percentage laag is, breiden de incubatietijd als dit nodig is (Zie Figuur 1 c).
  5. Verzamelen het supernatant met P1 virus (ongeveer 2 mL van elk putje). Filteren van het medium met P1 virus in 2 mL buizen met behulp van een spuit met 3 mL en kleine 0,2 µm filter. Steriele foetale runderserum (FBS) toevoegen om een eindconcentratie van 1%.
    Opmerking: Deze voorraad van P1 virus bij 4 ° C moet worden bewaard en worden beschermd tegen licht.

4. infectie van Sf9 Insect cellen met P1 Baculovirus tot P2 Baculovirus

  1. Bereiden van 200 mL (of gewenste volume) van Sf9 cellen bij een concentratie van 0.8 - 0.9 x 106 cellen/mL in geschikte voedingsbodem (Zie Tabel van materialen) in een erlenmeyer cultuur van platte bodem van voldoende grootte.
    Opmerking: Voor schorsing cultuur, het volume dat wordt gebruikt mag niet meer dan 40% van de totale capaciteit van de kolf.
  2. 1:2500 verhouding (v/v) van P1 virus voorraad uit 3.5 toevoegen aan de cultuur van de opschorting van de cel van Sf9. Incubeer gedurende de tijd van optimale virus expressie (meestal 48-120 h afhankelijk van de structuur van de proteïne) bij 27 ° C in een roteerschudapparaat bij 115 t/min.
    Opmerking: De relatieve virus expressie kan worden bepaald door het bekijken van het GFP-fluorescentie van het virus in een monster van de cultuur.
  3. De celsuspensie voor 40 min bij 11,520 x g centrifugeren en verzamel het supernatant met P2-virus. De bovendrijvende vloeistof met behulp van wegwerp 0,2 µm filters filteren. FBS toevoegen om een eindconcentratie van 0,5%.
    Opmerking: Deze voorraad van P2 virus bij 4 ° C moet worden bewaard en worden beschermd tegen licht.
  4. Het verkrijgen van een titer voor de P2-virus met behulp van Sf9easy cellen of een virus-teller.

5. infectie van zoogdiercellen van het HEK293 met P2 Baculovirus voor grootschalige eiwit expressie

  1. Bereiden van een gewenst volume van HEK293 zoogdieren schorsing celkweek (4-6 L is aanbevolen voor de bereiding van bevroren rasters) met een concentratie van 3.5-3.8 x 106 cellen/mL in het medium van expressie (Zie Tabel van materialen) aangevuld met 1% (v / v) steriele FBS in verbijsterd-onderkant kolf cultuur maatkolven van voldoende grootte.
    Opmerking: Voor schorsing cultuur, het volume dat wordt gebruikt mag niet meer dan 40% van het totale volume van de kolf.
  2. 8% (v/v) van P2 virus stockoplossing uit stap 4.3 toevoegen aan de cultuur van de opschorting van de cel van HEK293. Incubeer bij 37 ° C in een roteerschudapparaat bij 135 t/min.
  3. Voeg 10 mM natrium butyraat 12-18 h na infectie. Incubeer gedurende de tijd van optimale eiwit expressie (meestal 36-72 h) bij 30 ° C.
  4. Oogsten van cellen door gedurende 20 minuten bij 2,880 x gcentrifugeren. Wassen cellen door resuspending in ongeveer 100 mL tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) per liter cellen geoogst. Centrifugeer nogmaals gedurende 20 min op 2,880 x g en het verzamelen van de cel-pellet.
    Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Cel pellets kunnen worden module-ingevroren in vloeibare stikstof en opgeslagen bij-80 ° C tot zuivering.
    Let op: Vloeibare stikstof kan cryogene brandwonden of letsel veroorzaken. Bevriezing kan veroorzaken. Het kan verdringen van zuurstof en snelle verstikking veroorzaken. Draag cold isolerende handschoenen en gelaatsscherm.
  5. Verzamelen van kleine 1 mL oogsten op wisselende tijdstippen en solubilize gedurende 2 uur bij 4 ° C met schommelen of roeren in aanwezigheid van verschillende detergentia en/of additieven. Deze kleine geheel-ontbindend celsteekproeven kunnen worden verduidelijkt door ultracentrifugatie bij 235.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 ° C en uitvoeren als een monster 30 μL op een grootte-uitsluiting chromatography (SEC) kolom (Zie Tabel van materialen) om te bepalen van de beste tijd voor expressie en de beste voorwaarden voor solubilisatie.
    Opmerking: In het geval van hTRPC3, deze voorstelling opgenomen verschillende buffers met pH-waarden van 4.0-9.5 en zout concentraties van 50-500 mM; verschillende Ionische composities (zoals MgCl2 of NaCl); verschillende detergentia conform zijn aan de kritische micel (CMC) concentraties van 0,1 - 20 mM; vermindering van de additieven, zoals dithiothreitol, tris(2-carboxyethyl) Fosfine en β-mercaptoethanol; en de calcium-chelaat additieve ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA).

6. de zuivering van hTRPC3 eiwit uit de cel bevroren Pellet

  1. Ontdooi de pellet in buffer met 20 mM Tris (pH 8,0), 500 mM NaCl, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 0,8 μM aprotinin, 2 μg/mL leupeptin, 2 mM pepstatin A, en 1% digitonin, met behulp van 100 mL buffer per liter cellen geoogst. Eenmaal ontdooid, zorgen voor homogeniteit van de oplossing door pipetteren of roeren. Laat gedurende 2 uur bij 4 ° C in een bekerglas van ondergedompeld in ijs met een roer bar roterende solubilize.
  2. Verwijderen van puin van de cel door ultracentrifugatie bij 235.000 × g gedurende 1 uur bij 4 ° C. Controleren van de hoeveelheid eiwit door eenmonstervan 30 μL op een SEC-kolom (Zie Tabel van materialen) door hoge prestatie vloeibare chromatografie (HPLC) en visualiseren van de doel-eiwit door het GFP-signaaluitgang.
  3. Incubeer de ontbindend proteïne (bezinken) met kobalt affiniteit hars gedurende 1-2 uur bij 4 ° C. Controleer of binding aan eiwitten om de hars door een 30 μL monster uit te voeren op een kolom SEC.
    Opmerking: Als binding aan eiwitten heeft plaatsgevonden, het GFP tagged eiwit doel zal worden bewaard op de kolom niet gevonden in de doorstroming. Daarom geen GFP-signaal zullen aanwezig zijn op de positie die overeenkomt met de doelgrootte eiwit wanneer de doorstroming op HPLC wordt uitgevoerd.
  4. Wassen van de hars met 10 kolom hoeveelheid in de buffer (20 mM Tris, pH 8.0, 500 mM NaCl, 15 mM imidazool en 0,1% digitonin). Selectievakje voor eiwit verlies door een 30 μL monster uit te voeren op een kolom SEC.
    Opmerking: Als eiwit verlies uit de kolom heeft voorgedaan, het GFP tagged eiwit doel zal worden gevonden in de wash-buffer via de kolom heeft doorgegeven. Daarom GFP signaal zullen aanwezig zijn op de positie die overeenkomt met de doelgrootte eiwit wanneer de buffer wassen op HPLC wordt uitgevoerd. Als eiwit verlies zich heeft voorgedaan, kan de imidazool-concentratie van de buffer wassen moet worden verlaagd om te voorkomen dat zijn label binding aan de kolom affiniteit verstoren.
  5. Elueer de hars-gebonden hTRPC3 met buffer (20 mM Tris, pH 8.0, 500 mM NaCl, 250 mM imidazool en 0,1% digitonin). Trombine toevoegen om een 1:20 molaire verhouding (tot het klieven van het GFP-tag) en voeg van 10 mM EDTA (een hTRPC3 stabilisator) aan het eluted monster en incubeer gedurende 3 uur bij 4 ° C. Controleer dat eiwit heeft zijn geëlueerd door 90 μL van een monster verdunde 1:100 waarop een SEC-kolom en controleren van de aanwezigheid van een GFP-signaal op de positie die overeenkomt met het doelformaat voor eiwit.
    Opmerking: op dit punt, het tryptofaan signaal van totale proteïne in de elutie kan ook worden bekeken. Alleen het doel affiniteit-gezuiverd eiwit de elutie het GFP blijft en tryptofaan signalen zullen nabij identiek in profiel. Als het doel-eiwit niet in grote hoeveelheid in de elutie gezien wordt maar niet in de doorstroom of wassen verloren was, het eiwit gebleven waarschijnlijk gebonden aan de kolom en gebruik van hogere concentraties van imidazool in de buffer kan worden geëlueerd.
  6. Het concentreren van het eluaat tot 500 μL of minder in een 15 mL 100K centrifugaal filter tube (Zie Tabel van materialen) door spinnen bij 2,880 x g bij 4 ° C in stappen van 5 min. Resuspendeer de proteïne door pipetteren de oplossing op en neer tussen de draaiingen om te voorkomen dat overconcentrating.
    Opmerking: Centrifuge tijd kan worden verkort als het volume het gewenste eindvolume benadert.
  7. Het laden van het concentraat op een kolom van de SEC in de buffer (20 mM Tris, pH 8.0, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA en 0,1% digitonin). Run.
  8. Combineer piek breuken met de intacte TRPC3 tetrameer, als gevisualiseerde door UV extinctie signaal, en me weer concentreren om een eindconcentratie van ten minste 5 mg/mL.

7. screening van proteïne door negatieve-vlek-elektronenmicroscopie

  1. Inschakelen van de machine gloed-kwijting. Stel het programma voor het nakomen van een koolstof-gecoat rooster met behulp van argon en zuurstof voor 30 s. Run het programma om de koolstof-coating op koperen 400-mesh rasters hydrofiele vóór toevoeging van de eiwit-oplossing.
  2. Vijf 40 μl druppels steriel water en twee 40 μl druppels 1% uranyl formate oplossing instellen (op lab film, vetvrij papier of een soortgelijk oppervlak, Zie Tabel van materialen). Nemen van het raster uit stap 7.1 en 2.5 μL van eiwit sample 5 mg/mL (50-200 μM) toevoegen aan de donkere kant en laat het zitten voor 1 min.
  3. Droog na 1 minuut, het raster met filtreerpapier. Raak niet het koffiefilter rechtstreeks naar het raster oppervlak; in plaats daarvan, breng het papier tot aan de rand van de vloeibare druppel en capillaire toelaten te trekken van de vloeistof uit het raster in het koffiefilter.
  4. Dompel het raster in eerste druppel water. Drogen met filtreerpapier en herhaal met de overige druppels water en de eerste daling van uranyl formate. Laat de tweede daling van uranyl formate zitten voor 1 min en vervolgens drogen met filtreerpapier. Het toestaan van het raster aan volledig lucht droog (ongeveer 1 minuut) alvorens op te slaan.
    Opmerking: Dit kleuring protocol wellicht niet ideaal voor alle combinaties van de eiwit-wasmiddel. Verschillende concentraties van uranyl formate vlek en verschillende lengtes van tijd voor vlek blootstelling moeten worden getest als de bovenstaande stappen niet een vlek met goed contrast bieden.
  5. Afbeelding van de rasters op een elektronenmicroscoop (Zie Tabel van materialen) om de kwaliteit van het eiwit deeltjes te controleren. Te controleren of de microfoto talrijke deeltjes die in algemene verschijning en distributie homogeen, weer goed contrast en overeenkomen met de voorspelde grootte van de proteïne doel.
  6. Voorlopige genereren, met een lage resolutie, tweedimensionale (2D) classificaties gebruik van 50-100 microfoto (Zie gegevensverwerking – stap 10) om te controleren dat de deeltjes vertegenwoordigen verschillende weergaven van een enkele consistente structuur.
    Opmerking: Microfoto en voorlopige 2D klassen van voldoende kwaliteit, als hierboven, zijn een sterke indicator dat het protocol voldoende is geoptimaliseerd voor eiwitreiniging. Voorbereiding en screening van cryo-EM rasters gerechtvaardigd is op dit punt.

8. EM monstervoorbereiding

  1. Gloed-kwijting een gouden een koolstof-raster (Zie Tabel van materialen) zoals beschreven in stap 7.1.
  2. Toepassing van 2.5 μL van de eiwitSteekproef (5 mg/mL) van geconcentreerde hTRPC3 op het raster. Wissen van het raster voor 1.5 s met een vlek van kracht van 1 en een wachttijd van 5 s bij 100% vochtigheid en 4 ° C, duik dan het raster in vloeibaar ethaan gekoeld door vloeibare stikstof met behulp van een machine verglazing.
    Opmerking: De vochtigheid, temperatuur, vlek-force, vlek tijd en wachttijd hier vermeld werden gebruikt voor de auteurs hTRPC3 studie19. Ze wellicht worden gewijzigd om te produceren optimale glasvocht ijs voor andere eiwitten en detergenten.
  3. Scherm bevroren rasters voor optimale ijsgang met behulp van een Microscoop cryo-EM (Zie Tabel van materialen) en handmatig weergave regio's van dik ijs (vakjes fragmenten kleiner en donkerder), dun ijs (vakjes die groter en helderder verschijnen), en medium ice .
    Opmerking: Dikker ijs houdt vaak meer deeltjes, terwijl dunnere ijs vaak betere contrastverhouding en resolutie levert. Gebruik handmatige screening van beelden om te bepalen welke ijs voorwaarden resultaten in een groot aantal monodispersed deeltjes met een goed contrast en resolutie. Als goede omstandigheden zijn geverifieerd, verplaats naar foto collectie op een 300 kV cryo-EM Microscoop.

9. EM gegevensverzameling

  1. Afbeeldingsstapels met behulp van een geautomatiseerde acquisitie programma, opnemen in Super tellen resolutiemodus met een weggegooid pixelgrootte van 1.074 Å op elektronenmicroscoop geëxploiteerd op 300 kV met een nominale vergroting van 130.000 X directe elektron detector.
  2. Dosis-fractionate elk beeld naar 40 frames met een blootstellingstijd van de totale van 8 s, met 0,2 s per frame en een dosering van 6,76 e− Å−2 s−1 (nominale defocus waarden varieerde van 1.0 tot 2,5 μm in de auteurs experiment).

10. EM gegevensverwerking

  1. Uitvoering van de motie correctie van vatte film stapels22 en schatten defocus waarden23 met behulp van de software van de gegevensverwerking (Zie Tabel van materialen)24.
  2. Kies deeltjes uit de microfoto. Gebruik deze deeltjes geplukt voor de bouw van een eerste referentie-gratis 2D classificatie op basis van de software-24. Selecteer ideale 2D klasse gemiddelden te gebruiken als sjablonen voor geautomatiseerde deeltje picken voor de hele gegevensset.
  3. Handmatig controleren van de kwaliteit van de auto-geplukt deeltjes en slechte deeltjes te verwijderen. Gebruik meerdere rondes van 2D classificatie op te schonen geplukt deeltjes.
  4. Het genereren van een eerste model25. Onderwerp 2D geplukt deeltjes driedimensionale (3D) indeling (ongeveer 5 klassen) met behulp van C1 symmetrie en een eerste wederopbouw-laagdoorlaatfilter van 60 Å als een referentiemodel. Bepalen welke klassen high-resolution kenmerken vertonen en combineren van deeltjes binnen dergelijke een klasse.
  5. Verder verfijnen deeltjes met behulp van de lokale verfijning met symmetrie van de C4 (in het geval van hTRPC3) toegepast en een hoge resolutie limiet voor deeltje uitlijning instellen naar 4.5 Å26.

11. model gebouw

  1. Bouwen van een model (Zie Tabel van materialen voor de software die wordt gebruikt). Voor hTRPC3, gebruik de transmembrane domein (TMD) van de voorbijgaande receptor potentiële melastatin 4 (TRPM4) structuur protein data bank (PDB) 5wp6 als een gids-27. Gebruik omvangrijk residuen en secundaire structuur voorspelling bij DOVO gebouw.
  2. Het eerste model onverminderd de reële ruimte verfijning met secundaire structuur beperkingen28. Handmatig onderzoekt de verfijnde model en remodify zo nodig (Zie Tabel van materialen voor de software die wordt gebruikt).
  3. Fourier shell correlatie (FSC) bochten voor de berekening van het verschil tussen het uiteindelijke model en de EM-kaart voor de validatie van de verfijnde structuur van toepassing. Evalueren van de geometrie van de atomaire modellen (Zie Tabel van materialen voor de software die wordt gebruikt)29,30.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een schematisch overzicht van het protocol voor expressie en reiniging van hTRPC3 wordt getoond in figuur 1A. Een afbeelding van de hTRPC3 bacmid plaat met ideale witte kolonies, vergelijkbaar met degene geselecteerd voor de zuivering van de DNA van de bacmid, wordt getoond in figuur 1B. We vonden dat 48u is ideaal voor duidelijke Bluo-gal kleuring met behoud van de aanwezigheid van geïsoleerde kolonies. Piek productie van P2 vir...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Structurele bepaling van eiwitten door cryo-EM heeft een revolutie teweeggebracht in het gebied van structurele biologie in de afgelopen jaren, dankzij de ontwikkeling van nieuwe camera's en algoritmen waarmee u aanzienlijk sneller kunt de structuurbepaling van proteïnen toe die niet gemakkelijk crystalize, met name membraaneiwitten. Ondanks al de recente vooruitgang in de cryo-EM-techniek blijft de voorbereiding van gezuiverde eiwitten voldoende kwaliteit en kwantiteit te vergemakkelijken van hoogwaardige imaging vaak u...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken G. Zhao en X. Meng voor de ondersteuning bij het verzamelen van de gegevens op de David Van Andel geavanceerde Cryo-Elektron microscopie Suite. Wij waarderen de VARI High-Performance Computing team voor computationele steun. Wij geven onze dankbaarheid aan N. Clemente, D. contributie, J. Floramo, Y. Huang, Y. Kim, C. Mueller, B. Roth en Z. Ruan voor opmerkingen die sterk verbeterd dit manuscript. Wij danken D. Nadziejka voor redactionele ondersteuning voor dit manuscript. Dit werk werd gesteund door interne VARI financiering.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
pEG BacMam vector (pFastBacI)addgene31488
DH10α cellenLife Technologies10361-012
S.O.C. mediaCorning46003CRvoor transformatie van DH10α cellen voor Bacmid
Bacmam kweekplatenTeknovaL5919voor kweek van getransformeerde DH10α cellen
Incubatieschuddel voor bacteriële cellenInfors HTMultitron standard
Incubeerbare orbitale schuddel voor insectencellenThermo-FisherSHKE8000
CO2 tafelincubator voor zoogdiercellenThermo-Fisher3951
Orbische tafelschuddelThermo-FisherSHKE416HPgebruikt in CO2 tafelincubator voor zoogdiercellen
IncubatorVWR1535voor bacteriële platen
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106voor plasmida extractie en zuivering
Fenol:Chloroform:Isoamyl alcoholInvitrogen15593031voor DNA extractie
Sf9 cellenLife Technologies12659017insectencellen voor virusproductie
Sf-900 mediaGibco12658-027insectencel media
FBSAtlanta BiologicalsS11550
Cellfectin IIGibco10362100voor het transfecteren van insectencellen
lipofectamine 2000Invitrogen11668-027voor het transfecteren van zoogdiercellen
0,2 mm spuitfilterVWR28145-501voor het filteren van P1 virus
0,2 mm filterkolven 500ml reservoirCorning430758voor het filteren van P2 virus
erlenmeyer kweekkolf (platte bodem 2L)Gene MateF-5909-2000voor het kweken van insectencellen
erlenmeyer kweekkolf (met roerwerk 2L)Gene MateF-5909-2000Bvoor het kweken van zoogdiercellen
nanodrop 2000 spectrofotometerThermo-FisherND-2000voor het bepalen van DNA- en eiwitconcentraties
HEK293ATCCCRL-3022zoogdiercellen voor het produceren van eiwitten
Freestyle 293 expressie MediumGibco1238-018zoogdiercel media voor eiwitexpressie
Butyric Acid Sodium SaltAcros263195000om eiwitexpressie te versterken
PMSFAcros215740500proteaseremmer
Aprotinin uit runderlongSigma-AldrichA1153-100MGproteaseremmer
Leupeptin hydrochlorideSigma-Aldrich24125-16-4proteaseremmer
pepstatine AFisher ScientificBP2671-250proteaseremmer
digitonineEMD Millipore300410detergens - om eiwitten uit membranen op te lossen
imidazoolSigma792527om eiwitten uit resin kolom te elueren
TALON resinClonetech635504voor affiniteitszuivering door His-tag
superose6 incease kolommenGE29091596; 29091597voor HPLC en FPLC
Prominence Modular HPLC SysteemShimadzuZie hieronder
Controller Module"CBM20A
Solvent Delivery System"LC30AD
Fluorescentie Detector"RF20AXS
Autosampler met Koelsysteem"SIL20ACHT
Pure FPLC Systeem met FractiecollectorAkta
thrombine (alfa)Haematologic Technologies IncorporatedHCT-0020 Human alfavoor het afsnijden van GFP tag
Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugale filterbuisMilliporeUFC910008voor het concentreren van eiwitten
EDTAFisherE478500voor het stabiliseren van eiwitten
400 mesh koolstof gecoate koperroostersTed Pella Inc.01754-Froosters voor negatieve kleuring
Quantifoil gaatjeskoolstof rooster (goud, 1,2/1,3 μm grootte/gat afstand, 300 mesh)Electron Microscopy SciencesQ3100AR1.3roosters voor Cryo-EM
Vitrobot Mark IIIFEIvoor het voorbereiden van roosters door vloeibare ethaan bevriezing
vloeibare stikstofDura-CylUN1977
ethaan gasAirgasUN1035
Solarus Plasma SysteemGatanModel 950voor het schoonmaken van roosters voordat monsters worden bevroren
Tecnai Spirit elektronenmicroscoopFEIvoor negatieve kleuring EM beeldvorming
Talos Arctica elektronenmicroscoopFEIvoor screening en laag resolutie beeldvorming van Cryo-EM roosters
Titan Krios elektronenmicroscoopFEIvoor hoge resolutie Cryo-EM beeldvorming
Software
Gautomatch softwarehttp://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/om deeltjes uit micrografieën te selecteren
Relion 2.1 softwarehttps://github.com/3dem/relionom 2D en 3D classificatie te construeren
CryoSPARC softwarehttps://cryosparc.com/om een ​​initieel structuurmodel te genereren
Frealign softwarehttp://grigoriefflab.janelia.org/frealignom deeltjes te verfijnen
Coot softwarehttps://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/om een ​​model te bouwen
MolProbity softwarehttp://molprobity.biochem.duke.edu/om de geometrie

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
  2. Kumar, R., Thompson, J. R. The regulation of parathyroid hormone secretion and synthesis. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (2), 216-224 (2011).
  3. Sudhof, T. C. Calcium control of neurotransmitter release. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (1), a011353(2012).
  4. Ong, H. L., de Souza, L. B., Ambudkar, I. S. Role of TRPC Channels in Store-Operated Calcium Entry. Advances in Experimental Medicine and Biology. 898, 87-109 (2016).
  5. Smyth, J. T., et al. Activation and regulation of store-operated calcium entry. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (10), 2337-2349 (2010).
  6. Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiological Reviews. 95 (4), 1383-1436 (2015).
  7. Liu, X., Singh, B. B., Ambudkar, I. S. TRPC1 is required for functional store-operated Ca2+ channels. Role of acidic amino acid residues in the S5-S6 region. Journal of Biological Chemistry. 278 (13), 11337-11343 (2003).
  8. Zhu, X., Jiang, M., Birnbaumer, L. Receptor-activated Ca2+ influx via human Trp3 stably expressed in human embryonic kidney (HEK)293 cells. Evidence for a non-capacitative Ca2+ entry. Journal of Biological Chemistry. 273 (1), 133-142 (1998).
  9. Zhu, X., et al. trp, a novel mammalian gene family essential for agonist-activated capacitative Ca2+ entry. Cell. 85 (5), 661-671 (1996).
  10. Itsuki, K., et al. Voltage-sensing phosphatase reveals temporal regulation of TRPC3/C6/C7 channels by membrane phosphoinositides. Channels (Austin). 6 (3), 206-209 (2012).
  11. Tang, J., et al. Identification of common binding sites for calmodulin and inositol 1,4,5-trisphosphate receptors on the carboxyl termini of trp channels. Journal of Biological Chemistry. 276 (24), 21303-21310 (2001).
  12. Gonzalez-Cobos, J. C., Trebak, M. TRPC channels in smooth muscle cells. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 15, 1023-1039 (2010).
  13. Li, H. S., Xu, X. Z., Montell, C. Activation of a TRPC3-dependent cation current through the neurotrophin BDNF). Neuron. 24 (1), 261-273 (1999).
  14. Becker, E. B., et al. Candidate screening of the TRPC3 gene in cerebellar ataxia. Cerebellum. 10 (2), 296-299 (2011).
  15. Kitajima, N., et al. TRPC3 positively regulates reactive oxygen species driving maladaptive cardiac remodeling. Scientific Reports. 6, 37001(2016).
  16. Yang, S. L., Cao, Q., Zhou, K. C., Feng, Y. J., Wang, Y. Z. Transient receptor potential channel C3 contributes to the progression of human ovarian cancer. Oncogene. 28 (10), 1320-1328 (2009).
  17. Oda, K., et al. Transient receptor potential cation 3 channel regulates melanoma proliferation and migration. Journal of Physiological Sciences. 67 (4), 497-505 (2017).
  18. Xia, M., Liu, D., Yao, C. TRPC3: A New Target for Therapeutic Strategies in Chronic Pain-DAG-mediated Activation of Non-selective Cation Currents and Chronic Pain (Mol Pain 2014;10:43). Journal of Neurogastroenterology and Motility. 21 (3), 445-447 (2015).
  19. Fan, C., Choi, W., Sun, W., Du, J., Lu, W. Structure of the human lipid-gated cation channel TRPC3. Elife. 7, e36852(2018).
  20. Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
  21. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay to identify membrane protein expression and crystallization conditions. Structure (London, England: 1993). 20 (8), 1293-1299 (2012).
  22. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  23. Zhang, K. Gctf: Real-time CTF determination and correction. Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).
  24. Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  25. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  26. Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
  27. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  28. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
  29. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).
  30. Scheres, S. H. W., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature Methods. 9 (9), 853-854 (2012).
  31. Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  32. Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
  33. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 12-21 (2010).
  34. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).
  35. Green, E. M., Au, Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. Journal of Visualized Experiments. (117), e54792(2016).
  36. Mesa, P., Deniaud, A., Montoya, G., Schaffitzel, C. Directly from the source: endogenous preparations of molecular machines. Current Opinion in Structural Biology. 23 (3), 319-325 (2013).
  37. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane Protein Assembly into Nanodiscs. FEBS letters. 584 (9), 1721-1727 (2010).
  38. Winkler, P. A., Huang, Y., Sun, W., Du, J., Lü, W. Electron cryo-microscopy structure of a human TRPM4 channel. Nature. 552, 200-204 (2017).
  39. Autzen, H. E., et al. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359 (6372), 228-232 (2017).
  40. Guo, J., et al. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552 (7684), 205-209 (2017).
  41. Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1860 (2), 378-383 (2018).
  42. Gulati, S., et al. Detergent-free purification of ABC (ATP-binding-cassette) transporters. Biochemical Journal. 461 (2), 269-278 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

TRPC3 ExpressionProtein PurificationAffinity ChromatographySize Exclusion ChromatographyBaculovirus SystemHEK293 CellsDetergent SolubilizationIon Channel

Gerelateerde artikelen