Presenteren we een methode voor het analyseren van de 4-hydroxy-tamoxifen-afhankelijke oestrogeen receptor Alfa ligand-bindend domein dimerisatie activiteit met behulp van de zoogdieren twee-hybride assay.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Opsporen van de Ligand-bindend domein dimerisatie activiteit van oestrogeen Receptor-Alpha met behulp van de zoogdieren twee-hybride Assay
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Oestrogeen receptor-alpha (ERα) is een oestrogene ligand-afhankelijke transcriptie regulator. De volgorde van ERα eiwit wordt zeer behouden tussen de soorten. Het heeft gedacht dat de functie van de mens en de muis ERαs identiek is. We tonen het effect van de differentiële 4-hydroxy-tamoxifen (4OHT) op de muis en de menselijke ERα ligand-bindend domein (LBD) dimerisatie activiteit met behulp van de zoogdieren twee-hybride (M2H) bepaling. De assay M2H kan aantonen dat de efficiëntie van LBD homodimerization activiteit in zoogdiercellen, gebruik makend van de transfectie van twee eiwit expressie plasmiden (GAL4 DNA-bindende domein [DBD] fusie LBD en VP16 transactivation domein [VP16AD]-fusie LBD) en een GAL4-responsief element (GAL4RE) gesmolten luciferase verslaggever plasmide. Wanneer de GAL4DBD fusion LBD en de VP16AD-fusion LBD een dimeer in de cellen, dit complexe eiwit bindt aan de GAL4RE en vervolgens activeert een luciferase genexpressie via de VP16AD afhankelijk transcriptie activiteit. De 4OHT-gemedieerde luciferase activering is hoger in de HepG2 cellen die waren met de muis ERα LBD fusion eiwit expressie plasmiden dan in de menselijke ERα LBD fusion eiwit expressie plasmide transfected cellen transfected. Dit resultaat wijst erop dat de werkzaamheid van de 4OHT-afhankelijke muis ERα LBD homodimerization activiteit hoger dan menselijke ERα LBD. In het algemeen, is het gebruik van de M2H-test niet ideaal voor de evaluatie van nucleaire receptor LBD dimerisatie activiteit, omdat agonistic liganden het basale niveau van de activiteit LBD verbeteren en dat de detectie van LBD dimerisatie activiteit belemmert. We vonden dat 4OHT doet niet verhogen, ERα LBD basale activiteiten. Dat is een belangrijke factor om te kunnen bepalen en op te sporen van de 4OHT-afhankelijke LBD dimerisatie activiteit voor het met succes gebruik van de M2H-bepaling. ERα LBD gebaseerde M2H tests kunnen worden toegepast om te bestuderen van de activiteit van de partiële agonist van selectieve oestrogeen receptor modulatoren (bijvoorbeeld, 4OHT) in verschillende zoogdieren celtypes.
Inleiding
Oestrogeen receptor-alpha (ERα) is een oestrogene ligand-afhankelijke transcriptie regulator. Het aminozuur sequenceof ERα is zeer bewaard tussen de soorten. Vanwege de hogere homologie tussen mens en muis ERα, de functie van deze receptoren als identiek is gedacht en de differentiële activiteit van oestrogene stoffen (b.v., tamoxifen) in deze soorten wordt veroorzaakt door de soort verschillen in chemische stofwisseling in plaats van de structurele verschillen van ERα. ERα heeft zeer domeinstructuren die onder de superfamilie van nucleaire receptor (NR gelden), aangewezen van A tot F domeinen behouden. Het E-domein of de ligand-bindend domein (LBD) omvat de ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. voorbereiding van plasmiden, de zoogdieren twee-hybride Assay
- Gebruik de volgende plasmiden: pG5-Luc, pBIND-ERαEF en pACT-ERαEF.
Opmerking: De plasmiden zijn beschikbaar vanaf de auteurs op verzoek en worden verzonden op filterpapier. pG5-Luc is de verslaggever plasmide dat bevat vijf herhalingen van GAL4 responsieve elementen gefuseerd met de luciferase expressie eenheid(Figuur 1). pBIND-ERαEF is het eiwit expressie plasmide voor GAL4DBD-gesmolten ERα LBD eiwitten. pBIND-ERαEF bevat een Renilla luciferase expressie eenheid voor het normaliseren van de transfectie efficiëntie (Figuur 1....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 3 toont de regeling van mogelijke reacties in de combinatie (i) en (ii) plasmide-transfected cellen van de combinatie. De experimentele resultaten worden weergegeven in Figuur 4. De activiteit van de combinatie (i) (pBIND-mERαEF, pG5-Luc + pACT) toont stimulatie door 10 nM E2 (Figuur 4A), omdat de ERα LBD de ligand-afhankelijke transactivation domein met het domeinfunctionalit.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hierin, beschreven we het protocol voor de M2H assay, zich te concentreren op de voorwaarden van de assay voor het opsporen van de activiteit van de homodimerization van ERα LBD als voorbeeld. In het algemeen, is de M2H-test niet populair voor de beoordeling van de ligand-afhankelijke ERα LBD dimerisatie activiteit. Dit is te wijten aan de ERα LBD bezitten een transcriptionele activering functie; waarvan de activiteit stoort, in sommige gevallen, de resultaten van de M2H-bepaling. Zoals we hier laten zien, kan de M2H bep.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te verklaren.
Dankbetuigingen
De auteurs bedanken voor hun kritische lezing van het manuscript en Tanner Jefferson Drs. Sueyoshi en Wang op het National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) voor het uitvoeren van de procedures op de video. Dit werk werd gesteund door de nationale instituten van gezondheid Grant 1ZIAES070065 (naar KSK) vanuit de divisie van intramurale onderzoek naar de NIEHS.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| pG5-Luc | Promega | E249A | Component van CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| pBIND | Promega | E245A | Component van CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| pACT | Promega | E246A | Component van CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| One Shot TOP10 Chemisch Competente E. coli | Invitrogen | C404010 | |
| Centrifuge Rotor | SORVALL | 75006445 | |
| Swing Buckets | SORVALL | 75006441 | |
| Cell Resuspension Solution (CRA) | Promega | A7112 | |
| Cell Lysis Solution (CLA) | Promega | A7122 | |
| Neutralization Solution (NSA) | Promega | A7131 | |
| Column Wash Solution (CWB) | Promega | A8102 | |
| Wizard Midipreps DNA Purification Resin | Promega | A7701 | |
| Wizard Midicolumns | Promega | A7651 | |
| MEM, geen glutamine, geen fenol rood | Gibco | 51200038 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | A2916801 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15400054 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| BenchMark foetaal bovien serum (FBS) | Gemini-Bio | 100-106 | Heat inactivated |
| Charcoal:dextran stripping foetaal bovien serum | Gemini-Bio | 100-119 | Heat inactivated |
| DMEM, hoge glucose, geen glutamine, geen fenol rood | Gibco | 31053028 | voor transfectie |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | |
| Passive Lysis 5X Buffer | Promega | E1941 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1980 | |
| SpectraMax L microplate reader | Molecular Devices | ||
| SoftMax Pro Software | Molecular Devices |
Referenties
- Arao, Y., Korach, K. S. The F domain of estrogen receptor α is involved in species-specific, tamoxifen-mediated transactivation. Journal of Biological Chemistry. 293 (22), 8495-8507 (2018).
- Brzozowski, A. M., et al. Mo....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
