Mechanische micronisatie voor Lipoaspirates voor regeneratieve therapie

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om te verkrijgen stromale vasculaire breuk van adipeus weefsel door middel van een reeks van mechanische processen, waaronder membraanemulsificatie en meerdere centrifugations.

Samenvatting

Stromale vasculaire breuk (SVF) is uitgegroeid tot een regeneratieve instrument voor verschillende ziekten; wetgeving regelt echter strikt de klinische toepassing van cel-producten met behulp van collagenase. Hier presenteren we een protocol voor het genereren van een injecteerbare mengsel van SVF cellen en inheemse extracellulaire matrix uit vetweefsel langs zuiver mechanische weg. Lipoaspirates zijn een centrifuge gestoken en gesponnen op 1.200 x g gedurende 3 minuten. De middenlaag wordt verzameld en gescheiden in twee lagen (hoge dichtheid onderaan) en lage dichtheid vet op de top. De bovenste laag is direct geëmulgeerd door intersyringe verschuift, met een snelheid van 20 mL/s voor 6 x tot 8 x. Het geëmulgeerd vet wordt gecentrifugeerd bij 2.000 x g gedurende 3 minuten, en de kleverige substantie onder de olie laag is verzameld en gedefinieerd als de extracellulaire matrix (ECM) / SVF-gel. De olie in de bovenste laag wordt verzameld. Ongeveer 5 mL olie is toegevoegd aan 15 mL high-density vet en geëmulgeerde door intersyringe verschuift, met een snelheid van 20 mL/s voor 6 x tot 8 x. Het geëmulgeerd vet wordt gecentrifugeerd bij 2.000 x g gedurende 3 minuten, en de kleverige substantie is ook ECM/SVF-gel. Na de transplantatie van de ECM/SVF-gel in naakt muizen, is de prothese geoogst en beoordeeld door histologische onderzoek. Het resultaat geeft aan dat dit product heeft het potentieel om te regenereren in normale adipeus weefsel. Deze procedure is een eenvoudige, effectieve mechanische dissociatie te condenseren van de cellen van de FØROYA ingebed in hun natuurlijke ondersteunende ECM voor regeneratieve doeleinden.

Inleiding

Stamcel-therapieën bieden een paradigmaverschuiving voor weefselherstel en regeneratie zodat zij een alternatieve therapeutische regime voor verschillende ziekten^{1 bieden kunnen}. Stamcellen (b.v., geïnduceerde pluripotente stamcellen en embryonale stamcellen) hebben een groot therapeutisch potentieel maar zijn beperkt als gevolg van cel regelgeving en ethische overwegingen. Adipeus afkomstige mesenchymale stromale/stamcellen (ASC's) zijn eenvoudig te verkrijgen van lipoaspirates en niet onderworpen aan dezelfde beperkingen; het is dus een ideale celtype voor praktische regeneratieve geneeskunde²geworden. Bovendien, ze zijn nonimmunogenic en hebben overvloedige hulpbronnen van autologe vet³.

ASC's zijn op dit moment verkregen voornamelijk door collagenase-gemedieerde vertering van het vetweefsel. De stromale vasculaire breuk (SVF) van vetweefsel bevat ASC's, Endotheel progenitor cel, pericytes en immuuncellen. Hoewel het verkrijgen van een hoge dichtheid van SVF/ASC's enzymatisch bleek te hebben gunstige effecten, regelt de wetgeving in verschillende landen strikt de klinische toepassing van cel-gebaseerde producten met behulp van collagenase⁴. Het vetweefsel met collagenase voor 30 min tot 1 h te verkrijgen van SVF cellen verteren verhoogt het risico van zowel exogene materiaal bij de voorbereiding en de biologische verontreiniging. De aanhangend cultuur en de zuivering van ASC's, die dagen tot weken duurt, vereisen specifieke laboratoriumapparatuur. Bovendien, in de meeste studies, SVF cellen en ASC's worden gebruikt in suspensie. Zonder de bescherming van de extracellulaire matrix (ECM) of een andere vervoerder, vrije cellen zijn kwetsbaar, veroorzaken een slechte cel bewaren na injectie en compromis de therapeutische resultaat⁵. Al deze redenen beperken de verdere toepassing van stamcel therapie.

Voor het verkrijgen van ASC's uit vetweefsel zonder collagenase-gemedieerde spijsvertering, verschillende mechanische processing procedures, met inbegrip van centrifugeren, mechanische hakken, versnipperen, pureren en hakken, geweest ontwikkelde^{6,7 , 8 , 9}. deze methoden worden verondersteld te condenseren weefsel en ASC's door mechanisch verstoren volwassen adipocytes en hun olie-bevattende blaasjes. Deze preparaten, hoge concentraties van ASC's, toonde bovendien aanzienlijk therapeutisch potentieel als regeneratieve geneeskunde in dierlijke^{8,9,10 modellen}.

In 2013 introduceerde Tonnard et al. de nanofat enten techniek, waarbij de overlegging van de geëmulgeerd lipoaspirates van intersyringe verwerking van¹¹. De shearing kracht gemaakt door de intersyringe verschuiven kan selectief volwassen adipocytes breken. Op basis van hun bevindingen, ontwikkelde we een zuiver mechanisch verwerkingsmethode die verwijdert de meeste van de lipide en vloeistof in de lipoaspirates, verlaten alleen SVF cellen en gespreide ECM, oftewel ECM/SVF-gel¹². Hierin beschrijven we de details van de mechanische proces van mens-afgeleide adipeus weefsel te produceren van de ECM/SVF-gel.

Protocol

Dit onderzoek werd goedgekeurd door de ethische Review Board in Nanfang ziekenhuis, Guangzhou, China. Adipeus weefsel werd bijeengezocht uit gezonde donoren die gaf schriftelijke geïnformeerde toestemming deel te nemen aan de studie. Alle dierproeven werden goedgekeurd door het Nanfang ziekenhuis institutionele Animal Care en gebruik Comité en uitgevoerd volgens de richtlijnen van de National Health and Medical Research Council (China).

1. ECM/SVF-gel voorbereiding

1. Oogst de vet.
   1. Liposuctie uitvoeren op een mens met een 3-mm MPS canule, waarin diverse scherpe kant gaten van 1 mm in diameter, aan de-0.75 atm voor zuigdruk.
   2. 200 mL lipoaspirates in een steriele zak verzamelen.
2. Coleman vet te bereiden.
   1. Breng de lipoaspirates in vier 50 mL tubes en laat de geoogste vet zich nog steeds voor 10 min.
   2. Het vet op de bovenste laag in twee 50 mL tubes verzamelen met behulp van een pipet wide-tip over te dragen, en werp het vloeibare gedeelte op de onderste laag.
   3. Met behulp van 50 mL buizen, centrifugate de vetlaag bij 1.200 x g bij kamertemperatuur (RT) gedurende 3 minuten.
   4. De bovenste laag (ongeveer 80 mL) definiëren als Coleman vet.
   5. De bovenste 2/3 van de Coleman vet overbrengen in een tube 20 mL met behulp van een pipet wide-tip, en dit gedeelte definiëren als low-density vet.
   6. De lagere 1/3 van de Coleman vet overbrengen naar een andere tube van 20 mL met behulp van een pipet wide-tip, en dit gedeelte definiëren als high-density vet.
3. Het produceren van ECM/SVF-gel van low-density vet.
   1. Met behulp van twee 20 mL spuiten verbonden door een vrouw-naar-vrouw Luer-Lock connector (met een inwendige diameter van 2,4 mm), 20 mL van low-density vet intershift.
   2. Houd de verschuivende snelheid stabiel (bij 20 mL/s) en herhaal voor 6 x tot 8 x.
   3. Centrifugate het mengsel bij 2.000 x g bij RT gedurende 3 minuten.
   4. Het gedeelte van de olie bij de top in een tube 10 mL verzamelen met behulp van een pipet wide-tip op RT voor verder gebruik.
   5. Verzamelen van de kleverige substantie in de middenlaag, oftewel ECM/SVF-gel(Figuur 1),met behulp van een pipet wide-tip, en gooi de vloeistof op de onderste laag.
4. Het produceren van ECM/SVF-gel van high-density vet.
   1. Voeg 5 mL olie (verzameld uit stap 1.3.4) tot 15 mL high-density vet.
   2. Intershift van het gemengde vet tussen spuiten 6 x tot 8 x tot een flocculate wordt waargenomen binnen de emulsie.
   3. Centrifugate het mengsel bij 2.000 x g bij RT gedurende 3 minuten.
   4. Werp het gedeelte van de olie op de top.
   5. De kleverige substantie in de middenlaag (ECM/SVF-gel) te verzamelen door met behulp van een precisiepipet wide-tip en gooi de vloeistof op de onderste laag.
   6. Meng de ECM/SVF-gel uit stap 1.3.5 en 1.4.5.

2. naakt muismodel ECM/SVF-gel Graft

1. Anesthetize van de naakte muizen (8 weken oud, vrouwelijke) met Isofluraan (1% - 3%) inademing verdoving op een dierlijke operatie kamer.
2. De ECM/SVF-gel overbrengen in een 1 mL spuit.
3. Sluit de 1 mL spuit met een botte infiltratie canule.
4. Invoegen de canule subcutaan elke flank van de muis.
5. Injecteren 0.3 mL van de ECM/SVF-gel.

3. de weefsels oogsten op 3, 15 en 90 dagen na ECM/SVF-gel injectie

1. Anesthetize van de muizen met Isofluraan (1% - 3%) inademing verdoving.
2. Offeren de muizen door de cervicale dislocatie methode.
3. Maak een incisie op de middellijn van de muis de dorsale huid met chirurgische schaar.
4. Ontleden en oogst de vet enten aan beide zijden van de muis. Het vet enten 's nachts in de paraformaldehyde 4% op RT insluiten.
5. Uitdrogen van het weefsel in de toenemende concentraties van ethanol: 70% ethanol, twee wijzigingen, 1 h elke; 80% ethanol, een verandering, 1 h; 95% ethanol, een verandering, 1 h; 100% ethanol, drie wijzigingen, 1,5 h elke; xyleen, drie wijzigingen, 1,5 h elk.
6. Het weefsel met paraffine (58-60 ° C), twee wijzigingen, elke 2U te infiltreren.
7. Het weefsel inbedden in paraffineblokken. Secties bij een dikte van ongeveer 4 µm snijden en leg ze op dia's.

4. de haematoxyline en eosine-kleuring

1. Deparaffinize de paraffine blok dia's door inweken hen in xyleen I, II en III (elke 10 min).
2. De weefselsecties hydrateren door hen door dalende concentraties (100%, 100%, 95%, 80%, 70%) van ethanol baden voor elke 3 min.
3. Spoel de weefselsecties in gedistilleerd water (5 min).
4. Vlek de weefselsecties in Haematoxyline gedurende 5 minuten.
5. Spoel de weefselsecties in stromend kraantjeswater voor 20 min. Decolorize in 1% zuur alcohol (1% HCl in 70% alcohol) voor 5 s. spoeling in stromend kraantjeswater totdat de secties zijn blauw weer.
6. Voeg twee tot drie druppels van eosine Y kleurstof rechtstreeks op de dia's Pipetteer, en laat de kleurstof instellen voor 10 min.
7. Het wassen van de dia's in leidingwater voor 1-5 min.
8. Uitdrogen van de dia's in de toenemende concentraties (70%, 80%, 95%, 100%, 100%) van ethanol voor elke 3 min.
9. Schakel de dia's in xyleen I en II voor elke 5 min.
10. Monteer de dia's in de montage van de media.

5. immunefluorescentie kleuring

1. Deparaffinize de weefselsecties in xyleen I, II en III (elke 5 min).
2. De weefselsecties hydrateren door hen door verschillende concentraties (100%, 100%, 95%, 95%, 70%) van alcohol baden voor elke 3 min.
3. Incubeer de secties in een 3% H₂O₂ oplossing in methanol op RT gedurende 10 minuten.
4. Spoel de dia's 2 x met gedestilleerd water, 5 minuten elk.
5. Drop de dia's in een dia mand. Voeg 300 mL 10 mM citraat buffer (pH 6.0) en de dia's bij 95-100 ° C gedurende 10 minuten uit te broeden.
6. De dia's in RT gedurende 20 minuten afkoelen.
7. Spoel de dia's 2 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), 5 minuten elk.
8. Voeg 100 µL van 10% foetale runderserum op de dia's, en broeden in een bevochtigde ruimte bij RT gedurende 1 uur.
9. Incubeer de secties met primair antilichaam oplossing (cavia anti-muis Perilipin, 1:400) bij 4 ° C's nachts.
10. Spoel de dia's met PBS 3 x, 5 minuten elk.
11. Incubeer de secties met secundair antilichaam oplossing (geit anti-guinea pig-488 IgG) voor 2 h op RT.
12. Spoel de dia's met PBS 3 x, 5 minuten elk.
13. Het water rond de sectie met een schoon papieren zakdoekje vegen.
14. 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) en Alexa Fluor 488-geconjugeerd isolectin in de cirkel ter dekking van de sectie op de dia vallen.
15. Monteren van de coverslips en laat ze drogen in het donker.
16. Het observeren van de dia's met een fluorescente microscoop.

Resultaten

Na het verwerken van het vet van de Coleman op ECM/SVF-gel, neemt het volume van de weggegooide olie 80% van het uiteindelijke volume, en slechts 20% van het vetweefsel onder de olie laag bewaard wordt beschouwd als ECM/SVF-gel(Figuur 1). ECM/SVF-gel heeft een gladde vloeistof-achtige textuur die het mogelijk maakt om te gaan via een fijne naald van 27 G; echter, Coleman vet bestaat uit een integraal obesitas structuur met grote vezels en kan...

Discussie

Stamcel-based regeneratieve therapie blijkt een grote potentiële voordelen in verschillende ziekten. ASC's zijn uitstekende therapeutische kandidaten omdat ze gemakkelijk te verkrijgen en de capaciteit voor weefselherstel en de regeneratie van nieuwe weefsels¹⁵. Er zijn echter beperkingen aan het uitbreiden van de klinische toepassing ervan, omdat het vereist gecompliceerde procedures om cellen en collagenase voor de verwerking van⁶te isoleren. Het is dus essentieel voor he...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Alexa Fluor 488-geconjugeerd isolectin GS-IB4	Molecular Probes	I21411
guinea pig anti-muis perilipin	Progen	GP29
DAPI	Thermofisher	D1306
pipet met brede punt	Celltreat	229211B
confocale microscoop	Leica	TCS SP2
nude muis	Southern Medical University	/
lichtmicroscoop	Olympus	/
50 mL buis	Corning	430828
steriele zak	Laishi	/
microtoom	Leica	CM1900
centrifuge	Heraeus