Een plaat competitie Assay als een snelle voorafgaande beoordeling van de onderdrukking van de ziekte

Samenvatting

Gepresenteerd is een protocol voor een plaat competitie test om te bepalen of een specifieke compost is waarschijnlijk bevatten bacteriën en schimmels die onderdrukken van de groei van Rhizoctonia solani.

Samenvatting

Het doel was om te ontwikkelen en optimaliseren van een eenvoudige, betaalbare en effectieve bioassay op te sporen ziekte onderdrukkende capaciteit van een specifieke compost tegen soilborne schimmel Rhizoctonia solani. R. solani is een ziekteverwekker van een breed scala van plant hosts wereldwijd. De schimmel in de bodem als een saprophyte overleeft en groeit snel op eenvoudige water agarmedia. De bepaling van de plaat is een snelle methode om te vergelijken compost voor hun vermogen om te vertragen de groei van R. solani. De assay correleert ook goed met onderdrukking van andere soilborne schimmel ziekteverwekkers die als saprofyten in de bodem zoals Alternaria vroege vergalt, verwelken Fusarium, Phytophthora wortelrot en Pythium wortelrot overleven.

Inleiding

Rhizoctonia vertegenwoordigt een brede complex van schimmels, van welke Thanatephorus cucumeris (Frank) Donk (anamorph = Rhizoctonia solani Kühn) is de verwekker veroorzaken wortelrot en demping-off¹. Rhizoctonia solani is een agressieve pathogenen en een saprophyte dat als sclerotia onder ongunstige milieu omstandigheden^{1 overleven kan}. Dientengevolge, het heeft een wereldwijde distributie en ziekte kan veroorzaken op breed scala van plant gastheren met inbegrip van Solanaceae, Fabaceae, Asteraceae en Brassicaceae tot ernstige economische verliezen.

Compost heeft de capaciteit om de haven biocontrol agenten voor bepaalde fabriek ziekteverwekkers². Echter niet alle compost zijn gelijk, noch zijn zij van invloed op alle ziekteverwekkers op dezelfde manier³. Hout gebaseerde koolstof heeft hogere lignine cellulose verhouding dan hooi of stro-koolstof compost gebaseerde. R. solani verkiest beschikbaar koolstof gevonden in stro. Biologische bestrijding schimmels, zoals Trichoderma spp., zijn daarentegen effectiever wanneer koolstof minder gemakkelijk beschikbaar is. Heilzaam schimmels en bacteriën tot compost kunnen onderdrukken plantenziekten door middel van competitie, antagonisme of het reguleren van de plant groei³. De voorgestelde bepaling detecteert voornamelijk antagonisme gemaakt door productie van antibiotica, ecoenzymes of chelatoren die schadelijk voor het pathogene agens oplevert zijn.

Plant bioassays zijn een goudstandaard te bepalen of de compost gunst of plant groei⁴afschrikken. Plant bioassays zijn echter tijdrovend (weken tot maanden) om uit te voeren die mogelijk langer dan gewenst en meer arbeid vereist te uittreksel van planten met wortels te kwantificeren van de ernst van het wortelstelsel. Relatief robuust, maar sneller (dagen) testen zou ideaal zijn voor kwaliteitscontrole-programma's. Het doel van deze paper is om aan te tonen van een relatief snelle en nauwkeurige test om te voorspellen onderdrukkende potentieel van compost. De methode was patroon na Alfano et al. ⁵ twee uitzonderingen na, compost extracten werden verdund en water agar werd gebruikt in plaats van aardappel dextrose agar (PDA). R. solani groeit snel op eenvoudige water agarmedia overwegende dat PDA bevorderd de groei van bacteriën en andere schimmels die de cultuur⁶besmet.

Deze test van de plaat dient als indicator voor onderdrukking die geldt voor een aantal plant ziekteverwekkers die overleven in de bodem als saprofyten met inbegrip van R. solani⁷, Alternaria vroege vergalt verwelken Fusarium, Phytophthora wortelrot en Pythium wortelrot. De plaat concurrentie bepaling is nuttig om een aantal van de compost producten bevatten gemeenschappen van microben die als biologische bestrijders van ziekteverwekkers van de bodem dienen van het scherm. De test was een van de meest consistente indicatoren van ziekte onderdrukking in commerciële compost producten^6,8. Producten werden gekozen voor hun variatie in recept, vervaldatum en productieproces.

Protocol

1. voorbereiden op voorhand

1. Master schimmel cultuur (testorganisme)
   1. Bestellen bij de American Type Culture Collection, microbiologie collectie⁹, door zijn teleomorph Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) of MYA 4031.
   2. Alternatief: Verzamelen lokale isolaten, zoals gedaan door de auteurs. Zaailingen van rode radijs (Raphanus sativus) goed werken als een aas plant; bodem van een locatie die bekend is dat hebben een geschiedenis van demping-off of wortel rot veroorzaakt door R. solaniverzamelen. Zaaien van zaden in de bodem en isoleren van wortel laesies wanneer zaailingen 3 tot 4 weken oud zijn.
      1. Verwijderen van zaailingen uit bodem en spoel met leidingwater. Kijk voor bruine weefsel in het gebied van de hypocotyl tussen de bladeren en de wortel (Figuur 1).
      2. Gebruik een enkele scherpe scheermesje te snijden 1 cm segmenten van de hypocotyl of de hoofdmap die een bruine kleur hebben. Het gebruik van vlam-gesteriliseerde pincet dip van de segmenten in de 10%-oplossing van huishoudelijk bleekmiddel voor 1 min, gevolgd door een 10 s spoeling in steriel water.
         Opmerking: De boven- en onderkant van een steriele petrischaal zijn bruikbaar recipiënten voor deze stap.
      3. Gebruik vlam-gesteriliseerde pincet te dragen van de plant stukken aan de binnenkant van een keukenrol om pat droog en plaats op het oppervlak van een petrischaal met water agar (15 g in 1 L).
      4. Plaats de petrischaal in een plastic container met een deksel en Incubeer bij kamertemperatuur (ongeveer 20 ° C). Veeg de binnenkant van de container met 10% bleekwater of 75% ethanol en laat het droge lucht voordat u de schotel.
      5. Houd de isolaten in langdurige opslag op een minimale media maïsmeel agar (17 g in 1 L) schuin (bij 5 ° C).

Figuur 1: ziekte symptomen. Bodem met R. solani resulteert in fragmentarisch kieming en vestiging (links). Symptomen op radijs zaailingen optreden als bruine laesies op de hypocotyl (rechts). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

2. Aardappel dextrose agar platen (39 g in 1 L) voor entmateriaal voor deze plaat assay gebruiken.
   1. Stellen van een cultuur van de dochter van Rhizoctonia cultuur op aardappel dextrose agar een of twee dagen voor de bepaling, om te verzekeren het is reeds lang gevestigd op de plaat van de cultuur voor de bepaling. Start de dochter cultuur door overdracht van een klein stukje R. solani (10 mm doorsnede) van de master cultuur naar het midden van een verse plaat aardappel dextrose agar (Figuur 2).
      Opmerking: Werken in een laminaire flow-kap of veeg naar beneden een laboratorium bankje met 10% bleekwater of 75% ethanol om risico van besmetting te minimaliseren.
3. Autoclaaf 25 mL reageerbuisjes met 10 mL aliquots gedestilleerd water (2 x aantal monsters).

2. bereiding van de monsters op proef

1. Twee onafhankelijke 0,5 g monsters van elk monster compost aan 10 mL gesteriliseerde met autoclaaf water in proefbuizen 25 mL toevoegen. Schud de reageerbuisjes 's nachts.
   1. Label de reageerbuisjes met unieke sample nummers, en elk lid van het paar als een (verwijzing) of B (voorbeeld).
2. Toevoegen na 24 h, 1.5 g van gewone agar aan 90 mL gedestilleerd water in twee 125 mLconical kolven.
3. Autoclaaf beide erlenmeyers met agar en het A monster van elk paar voor 20 min met de instelling van een langzame uitlaat.
4. Na de autoclaaf, plaatst u de erlenmeyers met agar in een waterbad van 45 ° C totdat ze evenwicht (ongeveer 30 min bereiken). Zet elke steekproef slurries niet in het waterbad, totdat het is afgekoeld tot 45 ° C.

Figuur 2: illustratie van protocol. Stekkers van R. solani worden geplaatst op de petrischaaltjes met compost water extract. De diameter van de mycelial groei wordt gemeten na 1-2 dagen met de hulp van een stereo microscoop aan de resolutie en het contrast verbeteren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

5. Giet de A monster (gesteriliseerde met autoclaaf referentie) compost drijfmest in de gesmolten agar van de A agar kolf. Swirl het verspreiden van compost in de agar.
6. Giet de B monster (levende voorbeeld) compost drijfmest in de gesmolten agar van de B agar kolf. Swirl het verspreiden van compost in de agar.
7. Giet het mengsel van elke kolf in vijf plastic petrischaaltjes die 100 mm diameter.
8. Laat de platen koel 's nachts zodat de agar verhardt.

3. Voeg de Rhizoctonia -uitdaging

1. Stukken van gelijke grootte van R. solani overbrengen met behulp van aseptische techniek in elk paar monster agar platen (3 tot 5 mm corkborer werkt goed om gelijke grootte stukken). Neem stukjes van de kolonie van de buitenmarge van de kolonie te verzekeren mycelium groeit actief.
   Opmerking: Werken in een laminaire flow-kap of veeg naar beneden een laboratorium bankje met 10% bleekwater of 70% ethanol.
2. Incubeer de platen bij kamertemperatuur gedurende 1-2 dagen totdat de kolonie groei ongeveer halverwege aan de rand van de A-platen bereikt.

4. meten van R. solani groei

1. Het meten van de straal van het mycelium in elke plaat tot de dichtstbijzijnde 1 mm met een duidelijk platte liniaal met behulp van een stereo microscoop met doorvallend verlichting.
   Opmerking: Schuine of donker veld verlichting zal gemakkelijker te zien en te meten van de transparante schimmeldraden. Zones van remming zijn op dit moment zichtbaar rond compost fragmenten in de B-plaat als de compost onderdrukkende is.
2. Opnemen van de straal op drie plaatsen per plaat en berekenen van een gemiddelde van de drie om te dienen als een representatieve maatregel.
3. Het gemiddelde van de B-platen aan de platen A aftrekken. Als B < A dan er zijn microben in de B-platen die onderdrukkende aan de R. solani pathogeen zijn.
4. Verdeel de gemiddelde straal door het aantal dagen van de uitdaging om de maateenheden van relatieve onderdrukking als een percentage, mm mycelium per dag.

Resultaten

Resulterende compost moet stabiel en volwassen, twee termen die vaak uitwisselbaar zijn, dus het kan veilig worden verpakt en vervoerd, en niet oorzaak bijwerkingen tijdens haar eindgebruik⁴. Stabiliteit is een weerstand tegen afbraak en wordt meestal bepaald met behulp van indexcijfers van de microbiële activiteit. Algemene maatregelen van microbiële ademhaling kunnen compost stabiliteit maar niet noodzakelijkerwijs ziekte onderdrukking van een agressieve...

Discussie

We weten uit eerder onderzoek, dat bepaalde compost zijn effectief in het onderdrukken van R. solani en dat de onderdrukkende effecten zijn te wijten aan de microben leven in de compost, niet de abiotische eigenschappen van compost^6,8. Het gebruik van autoclaaf als een middel om te 'doden' microbiota is bekritiseerd, omdat het van invloed is op de koolstof-chemie van de media-¹⁰. Wij vergeleken het gebruik van de autoclaaf te vacu...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
autoclavable narrow-neck glass conical flask	Fisher Scientific	10-040D	125-mL
autoclavable glass testtubes	Fisher Scientific	14-925J	25-mL
dehydrated granulated agar	Fisher Scientific	DF0145-17-0	500 g hoeveelheid
hittebestendige handschoenen	Fisher Scientific	MEMGG1314WL	meerdere merken beschikbaar
Parafilm (stroken van 2-3 cm breed)	Fisher Scientific	PM992 13-374-16	5 of 10 cm breedtes werken
wegwerpbare polystyreen petrischalen	Fisher Scientific	R80116	komt in sleeves van 20/st of dozen van 500
gedehydreerd aardappeldextrose-agar	Fisher Scientific	DF0013-15-8	komt in hoeveelheden van 100, 500 en 2000 gram
tafeltop reciprocal shaker	Thomas Scientific	1227Y31	andere modellen zullen werken
waterbad	ThermoScientific	S37363	5L algemeen doel
heldere liniaal, plat, minimaal 10 cm	Elk		gebruik metrische regel
ATCC-cultuur	American Type Culture Collection	ATCC 10154	teleomorf Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) of MYA 4031;
lab tape	Fisher Scientific	15935	autoclaveerbaar en verwijderbaar, 1" breed bij voorkeur
waterbestendige marker	kantoor of wetenschappelijke leverancier	Sharpie fine tip	schrijf monstersnummer op tape