Evaluatie van de virulentie en pathogenese van Aeromonas infectie in een Model Caenorhabditis elegans

Samenvatting

Hier introduceren we drie verschillende experimenten te studeren Aeromonas infectie in C. elegans. Met behulp van deze handige methoden, is het gemakkelijk om te evalueren van de toxiciteit tussen en binnen soorten Aeromonas .

Samenvatting

De menselijke pathogenen Aeromonas is klinisch aangetoond dat het veroorzaken van gastro-enteritis, wond infecties, sepsis en urineweginfecties. Meest menselijke ziekten zijn gemeld te worden geassocieerd met vier soorten bacteriën: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veroniien Aeromonas caviae. De model-organisme Caenorhabditis elegans is een Bacterivoor waarmee een uitstekende infectie model voor het bestuderen van de bacteriële pathogenese van Aeromonas. Hier introduceren we drie verschillende experimenten te studeren Aeromonas infectie met behulp van een C. elegans -model, met inbegrip van overleven, vloeibare toxiciteit en spier necrose testen. De resultaten van de drie methoden voor het bepalen van de virulentie van Aeromonas waren consistent. A. dhakensis bleek te zijn de giftigste onder de 4 grote Aeromonas soorten klinische infecties veroorzaken. Deze methoden worden weergegeven als een handige manier om de evaluatie van de toxiciteit tussen en binnen soorten Aeromonas en bijdragen aan ons begrip van de pathogenese van Aeromonas infectie.

Inleiding

De menselijke pathogenen, Aeromonas, is klinisch aangetoond dat het veroorzaken van gastro-enteritis, wond infecties, bloedvergiftiging en^1,2van de infecties van de urinewegen. Meest geassocieerde ziekten bij de mens zijn gemeld te worden geassocieerd met vier bacteriële soorten: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veroniien Aeromonas caviae ^{2,3 , 4 , 5}. onder Aeromonas besmettelijke ziekten, infecties van het zachte weefsel kunnen leiden tot ernstige morbiditeit en mortaliteit bij de mens. Van de nota is spieren necrose de meest ernstige vorm van weke delen-infectie⁶. Observatie van de overleving, spieren necrose van Caenorhabditis elegans na infectie is een handige methode om te speculeren op de toxiciteit van Aeromonas.

Wetenschappers hebben al talrijke modelorganismen om te bestuderen van bacteriële infecties ontwikkeld. In eerdere studies, werden muizen, zebrafishes en nematoden gebruikt als diermodellen om de pathogenese en de virulentie van Aeromonas^6,7,8te studeren. Elke diermodel heeft haar ' voordelen en toepassingen. De model-organisme, Caenorhabditis elegans, is een nematode bacterivorous welke inname bacteriën als foodnaturally. C. elegansheeft ontwikkeld een ingewikkeld ingeboren immune systeem tegen bacteriële infecties in de loop van de evolutie. Onder de stress van een bacteriële infectie, heeft C. elegans bewezen een uitstekende infectie model te bestuderen van de bacteriële pathogenese van Aeromonas^6,7,9 en andere ziekteverwekkers Als de schimmel¹⁰ en enterohemorragische Escherichia coli O157:H7¹¹. Er is echter nog steeds geen publicatie die zich op de methodologie richt bij het gebruik van C. elegans als een model voor het bestuderen van de virulentie van Aeromonas.

Hier introduceren we drie verschillende experimenten te studeren Aeromonas infectie met C. elegans als een dierlijk model: testen voor overleving, vloeibare toxiciteit en spier necrose. Deze methoden zijn een handige manier voor evaluatie van de toxiciteit tussen en binnen soorten Aeromonas en verbetering van het inzicht van de pathogenese van Aeromonas.

Protocol

1. voorbereiding van de voedingsbodem

Opmerking: Zie tabel 1 voor de voorbereiding van de oplossing.

1. Los om te bereiden M9 middellange¹², 1.5 g van KH₂PO₄, 5.66 g nb₂HPO₄en 2,5 g NaCl in 500 mL gedeïoniseerd water. Autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 minuten wachten tot afgekoeld tot kamertemperatuur en Voeg 0,5 mL 1 M MgSO₄ vóór eerste gebruik.
2. Los om te bereiden nematode groei medium (NGM)¹², 3 g NaCl, 2,5 g bacteriële pepton en 20 gram agar in 1 L gedeïoniseerd water. Autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 min. wacht totdat afgekoeld tot 55 ° C in een waterbad en voeg vervolgens 1 mL van de 1 M CaCl₂, 1 mL van de 1 M MgSO₄, 1 mL 5% cholesterol in ethanol en 25 mL fosfaatbuffer. Swirl aan meng goed.
3. Giet ongeveer 5 mL NGM in elk 6 cm petrischaal. Vermijd zeepbel productie op het oppervlak van de plaat. Laat de platen bij kamertemperatuur voor 1 nacht en pakket te slaan bij 4 ° C. Breng terug op kamertemperatuur voordat gebruik.
4. Ter voorbereiding van verrijkte NGM (ENGM), Los 3 g NaCl, bacteriële pepton 5 g en 1 g gistextract 30 g agar in 1 L gedeïoniseerd water. Autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 min. wacht totdat afgekoeld tot 55 ° C in een waterbad en voeg 1 mL van de 1 M CaCl₂, 1 mL van de 1 M MgSO₄, 1 mL 5% cholesterol in ethanol en 25 mL fosfaatbuffer. Swirl aan meng goed.
5. Giet ongeveer 10 mL ENGM in elke 9 cm petrischaal. Vermijd zeepbel productie op het oppervlak van de plaat. Laat de platen bij kamertemperatuur voor 1 nacht en pakket te slaan bij 4 ° C. Breng op kamertemperatuur vóór gebruik.
6. Te bereiden S middellange¹²mix 40 mL S basale, 0.4 mL 1 M kaliumcitraat, metalen 0.4 mL trace oplossing, 0,12 mL 0,12 mL 1 M MgSO₄, 1 M CaCl₂, 40 µL van 5% cholesterol in ethanol en 1 mL van 8 mM FudR vóór gebruik.

2. synchronisatie van C. elegans^6,9,12

1. Wassen ongeveer 2.000 wormen in de fase van de gravid-volwassene met 10 mL steriel gedeïoniseerd water in een tube van 15 mL. Spoelen de bacteriën 3 x, de wormen houden aan de onderkant van de buis.
2. Centrifugeer het monster voor 1 min bij 500 x g te trekken van de wormen. Verwijder het supernatant en houden de wormen in 3,5 mL gedeïoniseerd water.
3. Voeg 1 mL NaOCl (10-15%) en 0,5 mL 5 M KOH in de buis. Mix gelijkmatig door schudden voor < 6 min lyse van de organen van de worm.
4. Nadat de eieren zijn vrijgesteld van de wormen, voeg toe 10 mL gedeïoniseerd water om te stoppen met de lysis. Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 1.200 x g pull-down de eieren en het verwijderen van het supernatans dat zo veel mogelijk. Wassen met 15 mL M9 middellange minstens 3 x.
   Opmerking: Zie stap 1.1 voor de samenstelling van M9 medium.
5. Eieren in 1 mL M9 medium houden. Transport van eieren naar een 3,5 cm schotel voor incubatie gedurende één nacht (ongeveer 12-18 h) bij 20 ° C.
   Opmerking: Na de incubatie, de eieren zullen uitkomen om de worm larve die wordt genoemd als eerste stadium van de larve (L1).
6. Pipetteer uit 10 µL van L1 wormen in M9 medium. Worm tellen en bereken dat de concentratie van L1 wormen in M9 medium.
7. Zaad hooguit 10.000 geïncubeerd L1 fase wormen met een pipet op een 9 cm ENGM plaat verspreid met Escherichia coli OP50.
   1. In deze stap gekweekt verspreiding 0,5 mL's nachts E. coli OP50 met Luria Bertani (LB) Bouillon op de plaat van de ENGM 9 cm. Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 16 tot 18 h
      Opmerking: Om besmetting te voorkomen, de verspreiding stap moet worden uitgevoerd in een laminaire flow-kap.
   2. Afkoelen tot kamertemperatuur alvorens het zaaien van L1 wormen. Zaad hooguit 10.000 geïncubeerd L1 fase wormen op de ENGM plaat met E. coli OP50.
8. Incubeer de wormen bij 20 ° C voor 44 h of totdat ze naar de 4^th larve (L4) fase groeien.
   Opmerking: Zie stap 1.3 voor de samenstelling van ENGM medium. Een worm is een witte stip in halve maan vorm in het midden van de kant van het lichaam in de L4-stadium.
9. Gebruik de gesynchroniseerde L4 fase in de volgende tests wormen. Wild type die N2 in de kwantitatieve analyse van C. elegans , overleven met Aeromonas dhakensis en de kwantitatieve analyse van C. elegans , vloeibare toxiciteit met Aeromonas dhakensis wormengebruiken. Gebruik RW1596 wormen (myo-3(st386); stEx30 [myo-3p::GFP::myo-3 + rol-6(su1006)]) in de C. elegans spier necrose assay met Aeromonas dhakensis.

3. C. elegans Survival Assay met Aeromonas^6,9

1. Kies een één kolonie van elk van de vier Aeromonas stammen of E. coli OP50 en cultuur met de pond-Bouillon 2 mL respectievelijk bij 37 ° C gedurende 16 uur op de dag van L1 wormen op het verspreiden met E. coli OP50 ENGM zaaien.
   Opmerking: Om besmetting te voorkomen, moet deze stap worden uitgevoerd in een laminaire flow-kap. Hier, de volgende bacteriestammen werden gebruikt: E. coli OP50, de normale voedselbron van C. elegans. A. dhakensis AAK1, de eerste gesequenced pathogene klinische A. dhakensis isoleren. A. hydrophila A2-066, A2-007 A. veronii en A. caviae A2-9307121 zijn representatief klinische isolaten van National Cheng Kung University Hospital.
2. Meet de extinctie van de₆₀₀ OD van bacteriële Bouillon en aanpassen van de bacteriële Bouillon OD₆₀₀ = 2.0 met de pond-Bouillon.
3. Ter plaatse en verspreid 30 µL van bacteriële Bouillon elke 6 cm NGM plaat. De platen bij kamertemperatuur 's nachts cultuur.
   Opmerking: Zie stap 1.2 voor de samenstelling van NGM medium.
4. Op de dag dat de L1 wormen naar het werkgebied L4 groeien, willekeurig plukken en 50 wormen overbrengen in een NGM plaat met elk van de vier Aeromonas stammen of E. coli OP50.
5. Incubeer de platen van de NGM bij 20 ° C, totdat de test is voltooid.
6. Elke dag tot de laatste worm dood is alle de levende wormen naar een nieuw bereid NGM plaat met bacteriën en tellen het aantal, dood leven, en sensor wormen overbrengen.
   Opmerking: Overbrengen van wormen naar een vers voorbereid NGM plaat elke dag voor het onderhoud van infectie, zelfs als met behulp van steriele wormen (b.v.glp-4, of met FudR).
7. De curven van de overleving gebaseerd op de dagelijkse berekening van de gegevens worden uitgezet.

4. C. elegans vloeibare toxiciteit Assay met Aeromonas⁷

Opmerking: Om besmetting te voorkomen, moeten stappen worden uitgevoerd in een laminaire flow-kap.

1. De dag na het zaaien van de L1 wormen op de plaat van de ENGM uitbreiden met E. coli OP50, kies een één kolonie van elk van de vier Aeromonas stammen E. coli OP50 en cultuur met 5 mL de pond-Bouillon elke bij 37 ° C gedurende 16 uur.
   Opmerking: In het protocol, werden de volgende bacteriën stammen gebruikt: E. coli OP50, de normale voedselbron van C. elegans. A. dhakensis AAK1, de eerste gesequenced pathogene klinische A. dhakensis isoleren. A. hydrophila A2-066, A2-007 A. veronii en A. caviae A2-9307121 zijn representatief klinische isolaten van National Cheng Kung University Hospital.
2. Meet de extinctie van de₆₀₀ OD van de bacteriën Bouillon.
3. Centrifugeer de bacteriële Bouillon bij 3500 x g gedurende 15 minuten te verwijderen van de pond-Bouillon. Resuspendeer de bacteriën en aanpassen van de bacteriële Bouillon OD₆₀₀ = 3.0 met S medium. Voeg 195 µL van bacteriële Bouillon in S middellange tot ten minste 8 wells van een 96-wells-plaat.
   Opmerking: Zie stap 1.6 voor de samenstelling van S medium.
4. De wormen L4 op de plaat van de ENGM met E. coli OP5 M9 medium met afwassen. Pas de worm oplossing tot een concentratie van 5 wormen per µL en 5 µL van de worm-oplossing toevoegen aan elk putje van de 96-wells-plaat. Ervoor zorgen dat er ongeveer 25 wormen per putje.
5. Incubeer de 96-wells-plaat op een shaker bij 200 t/min bij 25 ° C.
6. Het aantal levende wormen en dode wormen na 24, 48 en 72 h. de overlevingscijfers van elk putje met de volgende formule Bereken: (levende wormen/totaal worms) × 100%.
7. Teken een spreidingsgrafiek plot met de berekening van de dagelijkse gegevens.

5. C. elegans spier necrose Assay met Aeromonas⁶

Opmerking: Om besmetting te voorkomen, moeten deze stappen worden uitgevoerd in een laminaire flow-kap.

1. Op de dag de L1-wormen worden overgeënt op de ENGM verspreid met E. coli OP50, kies een één kolonie van elk van de vier Aeromonas stammen E. coli OP50 en cultuur met 2 mL LB Bouillon, elke bij 37 ° C gedurende 16 uur.
   Opmerking: Hier, de volgende bacteriën stammen werden gebruikt: E. coli OP50, de normale voedselbron van C. elegans. A. dhakensis AAK1, de eerste gesequenced pathogene klinische A. dhakensis isoleren. A. hydrophila A2-066, A2-007 A. veronii en A. caviae A2-9307121 zijn representatief klinische isolaten van National Cheng Kung University Hospital.
2. Meet de extinctie van de₆₀₀ OD van de bacteriën Bouillon en aanpassen van de bacteriën Bouillon OD₆₀₀ = 2.0 met de pond-Bouillon. Ter plaatse en verspreiden van 30 µL van bacteriële Bouillon op 6 cm NGM platen. De platen bij kamertemperatuur 's nachts cultuur.
3. Op de dag groeien de wormen van L1 naar de L4-fase, de 50 wormen overdracht aan elke NGM plaat met elk van de vier Aeromonas stammen of E. coli OP50. Incubeer de platen NGM bij 20 ° C. Wormen elke 24 h overbrengen in nieuw bereid NGM platen met bacteriën.
4. Het nemen van beelden van de spier met behulp van een fluorescentie Microscoop.
   1. Keuze willekeurig 10 wormen op een 2% agarose gel in M9 medium op een dia. De wormen met 2 µL van 1% natriumazide M9 medium op agarose voor minder dan 5 min voordat de opnamen te verlammen.
   2. Plaats een cover slip en vastleggen van de beelden van de spier met behulp van een groen fluorescente proteïne (GFP) filteren op een fluorescente microscoop met charge - coupled apparaat camera. Vastleggen van de beelden van de spier op 24, 48, en 72 uur na de L4-fase.
5. Voeren beeld-analyse en figuur voorbereiding met een beeld processing software.
   Opmerking: De definities van de scores en de spier schade niveaus worden weergegeven in Figuur 3, waarvan de criteria als volgt worden weergegeven: 3 punten voor ontbrekende spiervezels; 2 punten voor gescheurde of gebroken spiervezels; 1 punt voor gebogen spiervezels; 0 punten voor gezonde spiervezels.

6. statistische Analyses

1. Voer alle experimenten minimaal drie keer onafhankelijk.
2. Gebruik de methode Kaplan-Meier te beoordelen van de C. elegans overleving testen, en de log-rank test in het analyseren van overleving verschillen. Statistische significantie vastgesteldop 0.05.
3. Van de Student t-test gebruiken om de statistische resultaten van de tests van C. elegans vloeibare toxiciteit voor de twee verschillende groepen te analyseren. One-way ANOVA-test in het analyseren van de verschillen tussen drie of meer waarden voor één onafhankelijke variabele gebruiken. Statistische significantie vastgesteldop 0.05.

Resultaten

Door het volgen van de bovenstaande protocollen, is het gemakkelijk om te differentiëren tussen de toxicities van de vier Aeromonas stammen. De bepaling van de overleving van de C. elegans is afgebeeld in Figuur 1. De overlevingskansen bij C. elegans besmet met Aeromonas soorten, weergegeven in volgorde van hoog naar laag waren: A. caviae, A. veronii, A. hydrophila, en A. dhakensis. Hoewel er diversiteit o...

Discussie

C. elegans is een nematode bacterivorous dat natuurlijk inname bacteriën als voedsel en een ingewikkeld aangeboren immuniteit voor bacteriën tijdens de evolutionaire proces heeft ontwikkeld. Twee van de belangrijke organen, onderhouden en ondersteunen van de immuniteit zijn de opperhuid en darm^9,-¹³. De epidermis en de bands van spier van C. elegans lijken op de structuren van de soft-weefsel in zoogdieren en mensen⁶. Van...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Shaker incubator	YIH DER	LM-570R	Bacterie incubatie
K2HPO4	J.T.Baker	MP021519455	Voedingsbodem bereiding
KH2PO4	J.T.Baker	3246-05	Voedingsbodem bereiding
Na2HPO4	J.T.Baker	MP021914405	Voedingsbodem bereiding
NaCl	SIGMA	31434	Voedingsbodem bereiding
MgSO4	SIGMA	M7506	Voedingsbodem bereiding
agar	Difco	214530	Voedingsbodem bereiding
CaCl2	SIGMA	C1016	Voedingsbodem bereiding
cholesterol	SIGMA	C8503	Voedingsbodem bereiding
ethanol	SIGMA	32205	Voedingsbodem bereiding
KOH	SIGMA	P5958	Voedingsbodem bereiding
6 cm Petri plate	ALPHA PLUS	46	Agar plaat bereiding
96-well plate	FALCON	353072	vloeibare test
bacteriële pepton	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	Voedingsbodem bereiding
gist extract	SIGMA	92144	Voedingsbodem bereiding
citroenzuur•H2O	SIGMA	C1909	Voedingsbodem bereiding
tri-kalium citraat•H2O	SIGMA	104956	Voedingsbodem bereiding
FudR	SIGMA	1271008	Voedingsbodem bereiding
disodium EDTA	SIGMA	E1644	Voedingsbodem bereiding
FeSO4•7 H2O	SIGMA	215422	Voedingsbodem bereiding
MnCl2•4 H2O	SIGMA	221279	Voedingsbodem bereiding
ZnSO4•7 H2O	SIGMA	204986	Voedingsbodem bereiding
CuSO4•5 H2O	SIGMA	C8027	Voedingsbodem bereiding
tryptone	SIGMA	16922	Voedingsbodem bereiding
Microscope systeem	Nikon	Eclipase Ti inverted	microscoop beeldvorming
Wetenschappelijke CCD Camera	QImaging	Retiga-2000R Fast 1394	microscoop beeldvorming