Multiplexing gericht echografie stimulatie met fluorescentie microscopie

Samenvatting

Low-Intensity Pulsed echografie stimulatie (LIPUS) is een modaliteit voor niet-invasieve mechanische stimulatie van endogene of gemanipuleerde cellen met hoge ruimtelijke en temporele resolutie. In dit artikel wordt beschreven hoe implementeren van LIPUS om een epi-fluorescentie Microscoop en minimaliseren van akoestische impedantie mismatch langs het pad van de echografie om te voorkomen dat ongewenste mechanische artefacten.

Samenvatting

Door zich te concentreren in lage-intensiteit ultrageluid pulsen die doordringen van de zachte weefsels, vertegenwoordigt LIPUS een veelbelovende biomedische technologie voor het op afstand en veilig manipuleren neurale afvuren, hormonale secretie en genetisch geherprogrammeerd cellen. Echter wordt de vertaling van deze technologie voor medische toepassingen momenteel gehinderd door een gebrek aan biofysische mechanismen waarmee gericht weefsels gevoel en te reageren op LIPUS. Een geschikte benadering voor het identificeren van deze mechanismen zou moeten gebruiken van optische biosensoren in combinatie met LIPUS om te bepalen onderliggende signaalroutes. Echter, de LIPUS tot en met een fluorescentie Microscoop kan leiden tot ongewenste mechanische artefacten als gevolg van de aanwezigheid van fysieke interfaces die weerspiegelen, absorberen en akoestische golven breken. Dit artikel bevat een stapsgewijze procedure om op te nemen LIPUS aan verkrijgbare rechtop epi-fluorescentie microscopen terwijl het minimaliseren van de invloed van fysieke interfaces de akoestische weg. Een eenvoudige procedure is beschreven te bedienen een transducer één element echografie en voldoen aan de focale zone van de transducer brengen het objectieve focal point. Het gebruik van LIPUS is geïllustreerd met een voorbeeld van LIPUS-geïnduceerde calcium transiënten in gekweekte menselijke glioblastoma cellen gemeten met behulp van calcium imaging.

Inleiding

Veel ziekten vereist enige vorm van invasieve medische interventie. Deze procedures zijn vaak duur en riskant en vereisen herstel periodes dus het toevoegen van een last aan stelsels voor gezondheidszorg. Niet-invasieve therapeutische modaliteiten hebben het potentieel om veiligere en goedkopere alternatieven voor conventionele chirurgische ingrepen. Huidige niet-invasieve benaderingen zoals farmacotherapie of Transcraniële magnetische stimulatie zijn echter vaak beperkt door afwegingen tussen weefsel penetratie, Spatio resolutie en ongewenste effecten van de af-target. In dit verband vormt een gerichte echografie een veelbelovende niet-invasieve technologie met het p....

Protocol

1. groeiende cellen op akoestisch transparant Polyester Film

1. De grootte van een 12 mm gat aan de onderkant van een standaard 35 mm cultuur schotel met behulp van een verticale pers-boor boor. De boor langzaam en Oogbescherming dragen. Verwijderen van stukken van plastiek gekoppeld aan de onderkant van de schotel een mes gebruiken voor het maken van een glad oppervlak aan de externe zijde (Figuur 2).
2. Breng een dunne laag van de marine-grade epoxy of lijm aan de oppervlakte van de externe onderkant van de schotel.
3. Plaats een foliën van polyester (2,5 µm dikte) tegen de externe onderkant van de schotel en druk s....

Resultaten

Figuur 5 is een voorbeeld van LIPUS experiment multiplexed met calcium beeldvorming. Glioblastoma cellen (A-172) werden geteeld op EMPM gecoat polyester film in standaard kweekmedium (aangevuld met 10% serum en 1% antibiotica) en geïncubeerd met de calcium-gevoelige fluorescerende verslaggever Fluo-4 AM. Cellen werden beeld met behulp van een 10 X onderdompeling lens en verlicht met een witte LED lichtbron en fluorescentie licht werd verzameld met behulp van .......

Discussie

Een grote voordeel van geconcentreerd ultrageluid is haar vermogen om te leveren niet-gebeurt mechanisch en/of thermische energie aan biologische monsters met een hoge spatio-temporele precisie. Andere technieken die mechanisch stimuleren cellen meestal dienst invasieve fysische sondes (bijvoorbeeld cel-prikken) of de interactie van energierijke laserstralen met vreemde voorwerpen (bijvoorbeeld optisch pincet) vereist. Magnetische verwarming kan verhitten specifieke ruimtelijke locaties binnen biologisc.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
upright microscope with large working volume	Thorlabs	CERNA
upright microscope with large working volume	Scientifica	SliceScope
optomechanical components	Thorlabs	n/a
needle hydrophone	ONDA Corporation	HNP/C/R/A/T series + AH/G pre-amplifier
needle hydrophone	Precision Acoustics	n/a
fiber optic hydrophone	ONDA Corporation	HFO series
fiber optic hydrophone	Precision Acoustics	n/a
oscilloscope	Keysight Technology	DSOX2004A (4-channels 70MHz)
function generator	Keysight Technology	33500B (20MHz single-channel)
RF power amplifier	Electronic Navigation Industries (ENI)	325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA
RF power amplifier	Electronics & Innovation (E&I)
immersion ultrasound transducer	Olympus	focused immersion transducers
immersion ultrasound transducer	Benthowave Instrument	HiFu transducer BII-76 series
immersion ultrasound transducer	Precision Acoustics	Piezo-ceramic or HiFu transducers
immersion ultrasound transducer	Ultrasonic-S-lab	HiFu transducers made to order
high-density Matrigel	Corning	VWR 80094-330
Mylar film 2.5 microns	Chemplex	CAT.NO:107