Methodenartikel

Generatie van kanker cel klonen te visualiseren Telomere Repeat-bevattende RNA TERRA uitgedrukt uit een enkele Telomere in levende cellen

DOI:

10.3791/58790

⸱

17 januari 2019

 ,  ,  , 
1Laboratory of Cell Biology and Molecular Genetics, Department of Cellular, Computational and Integrative Biology - CIBIO, University of Trento, 2Department of Life Sciences, University of Trieste

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van kanker cel klonen met een MS2 sequence tag op een enkele subtelomere. Deze aanpak, afhankelijk van het MS2-GFP-systeem, maakt de visualisatie van de endogene transcripten van Telomere herhalen-bevattende RNA (TERRA) uitgedrukt uit een enkele telomeer in levende cellen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Telomeren zijn getranscribeerd, die aanleiding geven tot Telomere herhalen-bevattende lang noncoding RNAs (TERRA), die zijn voorgesteld om te spelen belangrijke rollen in de telomeer biologie, met inbegrip van de heterochromatin formatie en telomeer lengte homeostase. Recente bevindingen bleek dat TERRA moleculen ook met interne chromosomale regio's communiceren te regelen van genexpressie in cellen van muis embryonale stamcellen (ES). In overeenstemming met dit bewijs, RNA fluorescentie in situ hybridisatie (RNA-vis) analyses hebben aangetoond dat alleen een subset van TERRA lokaliseren afschriften aan chromosoom uiteinden. Een beter begrip van de dynamiek van TERRA moleculen zal helpen bepalen hun functie en de mechanismen van de actie. Hier beschrijven we een methode om te etiketteren en visualiseren van single-telomeer TERRA afschriften in kankercellen met behulp van het MS2-GFP-systeem. Voor dit doel presenteren we een protocol voor het genereren van stabiele klonen, opdrachtregel de AGS menselijke maag kanker cel, met MS2 sequenties op een één subtelomere geïntegreerd. Transcriptie van TERRA van het MS2-gelabeld telomeer resulteert in de expressie van TERRA MS2-gelabelde moleculen die worden gevisualiseerd door live-cel fluorescentie microscopie op co expressie van een MS2 RNA-bindende eiwit gesmolten tot GFP (MS2-GFP). Deze aanpak kan onderzoekers bestuderen de dynamiek van single-telomeer TERRA moleculen in kankercellen, en het kan worden toegepast op andere cellijnen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De lange noncoding RNA TERRA is transcriptie van de subtélomérique regio van chromosomen en de transcriptie opbrengst naar de uiteinden van chromosomen, afgifte binnen de Telomere herhalen tract1,2. Om deze reden, TERRA Transcripten bestaan uit subtelomeric afkomstige sequenties aan hun 5'-eind en beëindigen met Telomere herhalingen (UUAGGG in Vertebraten)3. Belangrijke rollen zijn voorgesteld voor TERRA, met inbegrip van de heterochromatin formatie bij telomeren4,5, DNA replicatie6, bevordering van homologe recombinatie tussen chromosoom eindigt7,8 , 9, telomeer structuur10en telomeer lengte homeostase2,11,12,13te reguleren. Verder, TERRA afschriften communiceren met talrijke extratelomeric sites te reguleren van wijdverbreide genexpressie van muis embryonale stamcellen (ES) cellen14. In overeenstemming met dit bewijs, RNA fluorescentie in situ hybridisatie (RNA-vis) analyses hebben aangetoond dat alleen een subset van TERRA afschriften lokaliseren op telomeren1,2,15. Daarnaast is TERRA gemeld aan nucleaire aggregaten formulier lokaliseren op de X en Y chromosomen in2,16van de cellen van de muis. Deze bevindingen wijzen erop dat TERRA afschriften complexe dynamiek binnen de kern ondergaan. Inzicht in de dynamiek van TERRA moleculen zal helpen definiëren hun functie en de mechanismen van de actie.

Het MS2-GFP-systeem is wijd verbeid gebruikt om te visualiseren de molecules van RNA in levende cellen van verschillende organismen17,18. Dit systeem is eerder gebruikt voor tag en visualiseren van single-telomeer TERRA moleculen in S. cerevisiae12,19. Met behulp van dit systeem, werd onlangs aangetoond dat gist TERRA afschriften binnen het cytoplasma tijdens de post-diauxie shift fase lokaliseren, suggereren dat TERRA extranuclear functies20kan uitoefenen. Onlangs hebben we het MS2-GFP-systeem gebruikt om te studeren van single-telomeer TERRA afschriften van kanker cellen21. Voor dit doel, wij het uitgeven hulpmiddel van CRISPR/Cas9 genoom te integreren MS2 sequenties op een enkele telomeer (telomeer 15q, hierna Tel15q) in dienst en verkregen klonen uiten MS2-gelabeld endogene Tel15q TERRA (TERRA-MS2 klonen). Co uitdrukking van een GFP-gesmolten MS2 RNA-bindende eiwit (MS2-GFP) dat herkent en bindt MS2 RNA opeenvolgingen maakt visualisatie van single-telomeer TERRA afschriften in levende cellen21. Het doel van het protocol geïllustreerd hier is om te beschrijven in detail de stappen die nodig zijn voor de generatie van TERRA-MS2 klonen.

Voor het genereren van TERRA-MS2 klonen, een MS2 cassette is geïntegreerd in de regio subtélomérique telomeer 15q, stroomafwaarts van de TERRA promotor regio en transcriptie begin site. De MS2 cassette bevat een neomycine resistentie gen geflankeerd door lox-p sites, en zijn integratie op subtelomere 15q wordt uitgevoerd met behulp van het systeem CRISPR/Cas922. Nadat de transfectie van het MS2 cassette, enkele klonen zijn geselecteerd en subtélomérique integratie van de cassette wordt gecontroleerd door PCR, DNA sequencing en Southern blot. Positieve klonen zijn besmet met een adenovirus Cre-uiten ter opheffing van de markering van selectie in de cassette, waardoor alleen MS2 sequenties en een enkele lox-p-site op de subtelomere-15q. Expressie van TERRA MS2-gelabeld transcripties van Tel15q wordt gecontroleerd door RT-qPCR. Tot slot het MS2-GFP fusieproteïne wordt uitgedrukt in TERRA-MS2 klonen via retrovirale infectie om te visualiseren MS2-TERRA afschriften door fluorescentie microscopie. TERRA afschriften kunnen gemakkelijk worden gedetecteerd door RNA-vis en live-cel geschikt zijn met behulp van Telomere herhalen-specifieke sondes1,2,15,23. Deze benaderingen leveren belangrijke informatie over de lokalisatie van de totale bevolking van TERRA moleculen bij eencellige resolutie. De generatie van klonen met MS2 sequenties op een enkel subtelomere kunnen onderzoekers bestuderen de dynamiek van single-telomeer TERRA afschriften in levende cellen, die zal helpen bij het definiëren van de functie en de mechanismen van de actie van TERRA.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Selectie van resistente neomycine klonen

  1. AGS in Ham van F-12_K (Kaighn) medium aangevuld met 10% foetale boviene Serum (FBS), 2 mM L-glutamine, penicilline (0.5 eenheden per mL voedingsbodem) en streptomycine (0,2 µg per mL voedingsbodem) bij 37 ° C en 5% CO2cellen groeien. Transfect van de cellen aan een 50-60% samenvloeiing met de sgRNA/Cas9 uiten van vector en het MS2-cassette op een 1:10 molaire verhouding21.
    Opmerking: In een parallelle experiment, laten verifiëren van transfectie efficiëntie door een vector van GFP-uitdrukken (dat wil zeggen, Cas9-GFP vector) transfecting. Ten minste 60-70% transfectie efficiëntie moet worden bereikt.
  2. De volgende dag, vervang het kweken medium met medium dat neomycine op 0,7 µg Mo/mL eindconcentratie (selectieve medium).
    Opmerking: De cellen splitsen en ze zaaien in het selectieve medium overmorgen transfectie zal versnellen van het selectieproces. Alle niet-transfected cellen zal onmiddellijk sterven. Als transfectie is uitgevoerd in 6 goed platen, in welk geval elk putje op een 60% zou samenvloeiing bevatten ongeveer 0.7 x 106 cellen, de volgende dag die de cellen uit een enkele bron aan een 10 cm schotel met selectieve medium kunnen worden verdeeld.
  3. Houden van de cellen in het selectieve medium voor 7-10 dagen, middellange eenieder wijzigen of twee dagen, totdat één klonen zichtbaar zijn.
  4. Picken van cel klonen
    1. Bereiden een 96 goed plaat met 10 µL van 0,25% trypsine in elk putje.
      Opmerking: Twee opstellen 96 platen goed in het geval dat meer dan 96 klonen moeten worden gepickt.
    2. Met het gebruik van een Microscoop, Markeer de positie van elke kloon zichtbaar in de 10 cm schotel doordat een stip aan de onderkant van de schotel met behulp van een markering. Elke stip komt overeen met een kolonie worden gepickt.
    3. Vervang het kweken medium met net genoeg fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) vormen een dunne film van vloeistof op het klonen en niet laat de cellen droog tijdens het picken van de kloon.
    4. Kies één kolonies met behulp van een precisiepipet 10 µL. Hechten de tip met 5 µL van trypsine naar de kolonie en langzaam laat de trypsine die gelokaliseerde op de kolonie blijven zal. Toestaan trypsine loskoppelen van de cellen voor 1 min en vervolgens schrapen de kolonie met de tip en het zuigen in de tip.
      Opmerking: Tijdens deze procedure, spiegelen de schotel een beetje aan de ene kant, dus om het volume van PBS rond de kolonie wordt geplukt, het pickproces helpen zal door het vermijden van de trypsine rond de kolonie te verdunnen. Met behulp van een kloon ring kan ook helpen het oppakken van één klonen.
    5. Plaats de cellen uit de kolonie in een putje van de 96 goed plaat met 10 µL van 0,25% trypsine.
    6. Incubeer 5 min bij kamertemperatuur, vul de put met 150 µL van selectieve medium (Ham van F - 12K (Kaighn) medium aangevuld met 10% FBS, 2 mM L-glutamine, penicilline (0.5 eenheden per mL voedingsbodem), streptomycine (0,2 µg per mL voedingsbodem) en bevattende neomycine op dan een concentratie van 0,7 µg/mL.
      Opmerking: Tijdens de incubatietijd andere klonen kunnen worden geplukt. Het is raadzaam om te plukken zo veel klonen mogelijk. De meer klonen worden geplukt hoe hoger de kans zal zijn om positieve degenen te identificeren.
    7. Zodra alle van de klonen zijn geplukt en in de 96 goed plaat overgebracht, zodat de cellen groeien voor een paar dagen in het selectieve medium Ham van F - 12K (Kaighn) medium aangevuld met 10% FBS, 2 mM L-glutamine, penicilline (0.5 eenheden per mL voedingsbodem), streptomycine (0,2 µg per mL van medium) en met Neomycine bij een concentratie van 0,7 µg Mo/mL bij 37 ° C en 5% CO2, tot het bereiken van de samenvloeiing van de 90%.
  5. Splitsing van klonen
    1. Bereiden drie 96 goed platen bedekt met gelatine door toe te voegen 100 µL van gelatine per putje, Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, dan twee keer wassen met PBS. Deze platen zal worden gebruikt voor DNA-extractie (DNA plaat) en voor kloon bevriezing (bevriezing platen).
      Opmerking: Gelatine bevordert de bijlage van de cellen en het DNA in de putjes. In het bijzonder de gelatine coating zal het toestaan van het DNA te houden aan de onderkant van de putten tijdens de DNA-extractie en wassen van procedures (hieronder besproken). Tijdens de kloon-splitsing procedure is het raadzaam om het gebruik van een meerkanaalspipet.
    2. Zodra klonen 90% samenvloeiing bereiken, gecombineerd medium uit elk putje van de 96 goed plaat, wassen met PBS, Voeg 30 µL van 0,25% trypsine per putje en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
      Opmerking: Klonen zal groeien verschillende tarieven, die ook van het aantal cellen per kloon geplukt afhangen zal. Dus wordt deze stap uitgevoerd tijdens de verschillende dagen wanneer de verschillende klonen samenvloeiing van 90 bereikt %.
    3. Voeg 70 µL van selectieve medium per putje, cel klontjes door pipetteren op en neer in de putjes verstoren, dan 30 µL van de 100 µL naar de gelatinized DNA plaat gevuld met 120 µL van selectieve medium per µL van het goed en 30 aan de gelatinized bevriezing platen kant wit h 50 µL medium (zonder selectie).
    4. Plaats van de DNA-plaat in de incubator en laat de cellen om te groeien op 37 ° C en 5% CO2 tot 90% samenvloeiing.
    5. Toevoegen van 80 µL van ijskoude vers gemaakte 2 x bevriezing medium (80% FBS en 20% dimethylsulfoxide (DMSO)) aan elk putje van de bevriezing plaat, voeg parafilm (gespoten met 70% ethanol) op de top van de plaat zo aan elk putje zegel, plaats het deksel op de top en wikkel de plaat met aluminiumfolie. Plaats de bevriezing platen bij-80 ° C.
    6. Voeg 90 µL van selectieve medium per putje aan de oorspronkelijke 96 goed plaat met het klonen die zijn gesplitst en houd het in cultuur tot PCR screening van resultaten. Deze plaat zullen worden gebruikt als back-up-plaat.

2. screening van neomycine resistente klonen

  1. DNA-extractie van de 96 goed DNA plaat.
    1. Zodra de klonen gekweekt in de DNA-plaat 90% samenvloeiing bereiken, 2 keer wassen met PBS, dan lyse met 50 µL lysis-buffermengsel (10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 10 mM NaCl, 0,5% SDS en 1 mg/mL proteïnase K). De afdekplaat met parafilm, afdichten van elk putje, zet het deksel op, dek af met saran omslag, en bij 37 ° C's nachts.
    2. Voeg 100 µL van koude ethanol (Et-OH) / NaCl-oplossing (0,75 M NaCl in 100% ethanol) voor elk goed en neerslag gedurende 6 uur of 's nachts bij kamertemperatuur.
      Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
    3. Verwijder de Et-OH/NaCl-oplossing door het omkeren van de plaat en 3 keer wassen met 200 µL van 70% ethanol per putje.
    4. Voeg 25 µL van RNAse A oplossing in gedestilleerd water en Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur.
  2. 3 µL van genomic DNA voor PCR versterking gebruiken. Uitvoeren van PCR screening van de geselecteerde klonen gebruikend inleidingen binnen het neomycine resistentie gen en subtelomere 15q gloeien. PCR versterking wordt uitgevoerd met behulp van standaard polymerase enzymen en PCR protocollen21.
    Opmerking: PCR voorwaarden MS2 primers (MS2-subtel15q-primer-S en MS2 primer als) en inleidingen van de Klikfrequentie (CTR prime S en CTR primer als) zijn de volgende: 98 ° C gedurende 20 s als denaturatie stap en vervolgens 34 cycli bij 98 ° C 10 s, 58° C 20 s, 72 ° C 15 s , met behulp van polymerase enzym in een 25 µL reactie mix (Zie Tabel van materialen). Primer sequenties zijn aangegeven in tabel 1.
  3. Uitvoeren van PCR reacties op agarose gel en PCR banden positieve klonen met behulp van de standaard gel extractie procedures (Zie Tabel van materialen voor gel extractievloeistoffen) verkregen extract.
  4. Analyses van DNA sequencing van het PCR-product met gel-geëxtraheerde voor bevestiging van de aanwezigheid van de MS2 sequenties21uitvoeren.
    Opmerking: De sequencing analyses kunnen worden uitgevoerd met behulp van de inleidingen voor de screening van de PCR gebruikt.
  5. Zuidelijke vlek screening van positieve klonen van PCR
    1. De klonen positieve PCR en sequencing screening van de oorspronkelijke 96 goed plaat (de back-up-plaat) aan 6 goed platen in Ham van F - 12K (Kaighn) medium aangevuld met 10% FBS, 2 mM L-glutamine, penicilline (0.5 eenheden per mL voedingsbodem), streptomycine (0,2 µg per groeien mL voedingsbodem) en met Neomycine bij een concentratie van 0,7 µg Mo/mL bij 37 ° C 5% CO2.
      Opmerking: Als alternatief, als sommige van deze klonen verloren zijn, ontdooi ze uit een van de bevriezing platen (zie protocol 2.6).
    2. Zodra de klonen zijn aan 90% samenvloeiing in de 6 goed plaat, wassen van de cellen met PBS en voeg 250 µL van lysis buffer met 0,5 µg proteïnase K per putje.
    3. De cellen met behulp van een cel schraper Schraap en breng de lysate in een 1,5 mL-buis.
    4. Incubeer bij 37 ° C gedurende 16 uur.
    5. Voeg 1 mL ethanol 100%, schud krachtig en toestaan van het DNA te precipiteren van ten minste 2 uur of overnachting bij-20 ° C.
      Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
    6. Spin bij 13.400 x g bij 4 ° C gedurende 10 minuten, verwijder het supernatant en wassen van de pellets met 70% ethanol. Laat de lucht van de pellets drogen bij kamertemperatuur. Ook gebruiken een vacuüm concentrator.
    7. Resuspendeer de DNA-pellets in 50 µL van gedistilleerd water met RNAse A en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C.
    8. Het verteren van 5-10 µg genomic DNA via NcoI en BamHI restrictie-enzymen (twee onafhankelijke spijsvertering) in 100 µL reactie volume het broeden van de reacties van de spijsvertering bij 37 ° C's nachts.
    9. 4 µL van de spijsvertering op agarose gel (0,8% agarose) voor volledige spijsvertering bevestiging uitgevoerd.
    10. 1/10 volume van natrium acetaat 3 M oplossing pH 5.2 en 2 volumes van 100% ethanol toevoegen met de reacties van de spijsvertering beperking en incubeer ten minste 2 uur of overnachting bij-20 ° C te precipiteren DNA.
      Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
    11. Centrifugeer bij 13.400 x g bij 4 ° C gedurende 20 min, gooi het supernatant en wassen van de pellets met 70% ethanol. Laat de korrels in de lucht droog bij kamertemperatuur. Ook gebruiken een vacuüm concentrator.
    12. Resuspendeer pellets in 20 µL van gedistilleerd water en laadt u het verteerd DNA op een agarose gel van 0,8%.
      Opmerking: Voor een betere resolutie van verteerd DNA, bereiden een gel ten minste 15 cm lang en 's nachts draaien op lage spanning (volt ̴30). De elektroforese ingesteld moet worden geoptimaliseerd.
    13. De volgende dag, vlek de gel met een DNA-etikettering agent, zoals ethidiumbromide op 1 µL/10 mL eindconcentratie, gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en neem een foto met een liniaal dichtbij de gel op een gel imaging instrument.
    14. De overdracht van DNA instelt met een nylon membraan en het uitvoeren van membraan kruising met een MS2 sequentie-specifieke sonde met behulp van standaardprocedures21.
    15. Ontdooi de klonen die positief op PCR, DNA sequencing en zuidelijke vlek uit een van de twee bevriezing platen (zie volgende stap).
  6. Ontdooien van klonen
    1. Bereiden van een tube van 15 mL met 5 mL voor de voorverwarmde Ham F - 12 K (Kaighn) medium aangevuld met 10% FBS, 2 mM L-glutamine, penicilline (0.5 eenheden per mL voedingsbodem) en streptomycine (0,2 µg per mL voedingsbodem) voor elke kloon worden ontdooid.
    2. Verwijder een van de bevriezing platen van-80 ° en voeg 100 µL voorverwarmde F12K compleet medium naar de goed met de positieve kloon worden ontdooid.
      Opmerking: Deze procedure moet snel worden uitgevoerd en de 96 goed plaat moet worden gelegd op droog ijs na elke kloon is ontdooid, zodat de andere klonen te blijven bevroren. Dit is vooral van belang als meerdere klonen moeten worden ontdooid van de dezelfde 96 goed plaat.
    3. De cellen overbrengen in de tube van 15 mL met 5 mL van medium en centrifugeer bij 800 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Het medium gecombineerd, resuspendeer de cellen in 500 µL voorverwarmde volledige F12K medium en elke kloon overbrengen in een enkel putje van een 12 goed plaat.
  7. Afschaffing van het neomycine resistentie gen van de cassette MS2 op subtelomere 15q geïntegreerd.
    1. Laat het klonen te groeien van een 12 goed plaat naar een 10 cm schotel in volledige F12K medium.
      Opmerking: Neomycine moet niet worden opgenomen in het medium tenzij anders aangegeven.
    2. Het adenovirus Cre-uiten aan de gekweekte cellen in een 10 cm schotel aan 70% samenvloeiing in 10 mL van volledige F12K medium toevoegen.
      Opmerking: Met behulp van een Cre-GFP waarin adenovirus kan evaluatie van de efficiëntie van de infectie, die 100% moet benaderen. De replicatie-defecte adenovirus zullen verloren gaan na enkele passages in cultuur.
    3. 48 uur na infectie, splitst u de cellen in drie 10 cm schotels. Twee gerechten zullen worden gebruikt voor verificatie van het neomycine gene wegnemen door negatieve selectie, groeiende cellen in neomycine-bevattende medium (eerst schotel), en door de zuidelijke vlek (tweede schotel).
    4. Cultuur van de derde schotel met de kloon voor cel invriezen en RNA extractie.

3. verificatie van de TERRA-MS2 Transcript expressie door RT-qPCR

  1. Na verificatie van neomycine gene verwijdering, totaal RNA extractie van TERRA-MS2 klonen met behulp van organische oplosmiddelen (fenol en guanidine isothiocynate oplossing)21uit te voeren.
    1. Resuspendeer de RNA geëxtraheerd uit een 10 cm schotel in 100 µL van diethyl pyrocarbonate (DEPC) water.
    2. 3 µL van RNA op gel in werking een denaturating (1% formaldehyde-bevattende) 1 x 3-(N-Morpholino) propanesulfonic zuur (MOPS) om na te gaan van concentratie en de integriteit van het RNA. Ook analyseren RNA concentratie met een spectrofotometer.
    3. Behandelen van 3 µg van RNA met DNAse mij using 1 eenheid van DNAse ik enzym in 60 µL definitieve reactie volume.
    4. Incubeer de reactie gedurende 1 uur bij 37 ° C.
  2. Reverse transcriptie reactie en qPCR analyses
    1. De volgende onderdelen toevoegen aan een nuclease-gratis microcentrifuge-buis: 2 µL van een specifieke primer bij 1 µM TERRA, 1 µL van dNTPs mix (elke 10 mM), 6 µL van DNAse ik behandelde RNA (overeenkomend met ̴300ng RNA). Stel het volume in op 13 µL met 4 µL van DEPC water.
      Opmerking: Voor elke RNA te analyseren, een tweede buis met dezelfde reagentia maar een referentie specifieke primer, in plaats van TERRA specifieke primer, moet worden opgesteld.
    2. Verwarm het mengsel tot 65 ° C gedurende 5 minuten en incubeer in ijs voor minstens 1 min.
    3. Verzamelen van de inhoud van de buizen door kort centrifugeren en voeg 4 µL van 5 X RT enzym Buffer, 1 µL 0,1 M dithiothreitol (DTT), 1 µL (4 eenheden) van RNAse remmer en 1 µL van reverse-transcriptase (Zie Tabel van materialen).
    4. Incubeer de monsters bij 42 ° C gedurende 60 min, gebruik dan 2 µL van de RT-reactie voor qPCR analyses.
  3. QPCR reactie mix in een eindvolume van 20 µL bestaande uit 10 µL van 2 x qPCR master mix, 2 µL van cDNA sjabloon, 1 µL van voorwaartse primer (10 µM), 1 µL van omgekeerde primer (10 µM), en 6 µL van water voor te bereiden.
  4. QPCR reactie in een thermocycler via standaardprotocollen21uitvoeren.

4. productie van een retrovirussen MS2-GFP uitdrukken

  1. Wilt genereren waarin retrovirus MS2-GFP, transfect 80% confluente phoenix verpakking cellen met een MS2-GFP fusieproteïne uitdrukken retrovirus vector (pBabe-MS2-GFP PURO) en een env gen uiting van vector (zoals pCMV-VSVG) met behulp van een molaire verhouding 4:1 van de twee vectoren.
  2. De volgende dag, door het kweken medium (DMEM aangevuld met 10% FBS, 2 mM L-glutamine en Pen/Strep) te vervangen door verse medium met 10mM natrium butyraat.
  3. Incubeer gedurende 8 uur bij 37 ° C, 5% CO2, dan vervangt het medium met verse kweken medium waar het virus verzameld worden zal.
  4. Na 48u, het retrovirus-bevattende medium van de phoenix cellen te verwijderen. Dit medium is direct inzetbaar voor infectie van TERRA-MS2 klonen, in welk geval Filtreer het medium door een 0,45 µm filter toevoegen polybrene (eindconcentratie is 30 µg/mL) en toe te voegen aan de cellen (in dit geval het protocol blijft bij stap 5). Als alternatief kan retrovirus in een tube van 50 mL falcon worden neergeslagen door toevoeging van 1/5th volume van 50% PEG-8000/900 mM NaCl-oplossing en 's nachts het broeden bij 4 ° C op een rotator-wiel.
  5. De volgende dag, pellet retrovirus deeltjes door centrifugeren bij 2.000 x g gedurende 30 min, verwijder supernatant en resuspendeer de pellet in F12K medium zonder serum.
    Opmerking: De virusdeeltjes kunnen worden resuspended in 1/100,th van het oorspronkelijke supernatant volume. Een infectie test moet worden verricht om te verifiëren of de minimale hoeveelheid retrovirus vereist om de cellen efficiënt te infecteren.

5. visualisatie van TERRA-MS2 afschriften in levende cellen

  1. Plaat TERRA-MS2 klonen en WT AGS cellen in glazen bodem gerechten. Op de dag van de infectie, voeg toe polybrene aan het medium (eindconcentratie is 30 µg/mL) en het MS2-GFP waarin retrovirus.
  2. Na 24 uur verwijderen van het virus-bevattende medium en toevoegen van verse medium zonder fenol-rood.
  3. Het analyseren van de cellen in een omgekeerde Microscoop met behulp van de instelling van de juiste Microscoop. Het imago van de cellen met een 100 X of 60 X doelstelling met grote numerieke diafragma (1.4 X) en het gebruik van een gevoelige camera (EMCCD). Een milieucontrole-systeem gebruiken om de monsters bij 37 ° C en 5% CO2 tijdens imaging.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 1 geeft een overzicht van de experimentele strategie. De belangrijkste stappen van het protocol en een indicatief tijdschema voor de generatie van TERRA-MS2 klonen in AGS cellen worden weergegeven(figuur 1). Op dag 1, zijn meerdere putjes van een 6 goed plaat transfected met de MS2 cassette en sgRNA/Cas9 uiten van vectoren (afgebeeld in figuur 1B...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit artikel presenteren we een methode voor het genereren van menselijke kanker cel klonen met MS2 sequenties geïntegreerd binnen subtelomere 15q. Met behulp van deze klonen, worden de transcriptie van de subtelomere-15q MS2-gelabeld TERRA-moleculen gedetecteerd door fluorescentie microscopie door co uitdrukking van een fusieproteïne MS2-GFP. Deze aanpak kan onderzoekers bestuderen de dynamiek van TERRA uitgedrukt uit een eenpersoons telomeer in levende cellen21. In dit protocol, worden TERRA-M...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We zijn dankbaar voor het personeel van de geavanceerde imaging faciliteit van CIBIO bij de Universiteit van Trento en de BioOptics licht microscopie faciliteit op de Max F. Perutz laboratoria (MFPL) in Wenen. Het onderzoek leidt tot deze resultaten heeft financiering ontvangen van de Mahlke-Obermann-Stiftung en de zevendekaderprogramma voor onderzoek, technologische ontwikkeling en demonstratie van de Europese Unie onder de Subsidieovereenkomst geen 609431 bij EG. EG wordt ondersteund door een Rita Levi Montalcini fellowship van het Italiaanse ministerie van onderwijs, Universiteit en onderzoek (MIUR).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AGS cellen--Gift van Christian Baron (Université de Montréal).
F12K Nut Mix 1XGIBCO21127022Kweekmedium voor AGS-cellen
L-Glutamine CORNINGMT25005CIComponent van kweekmedium
Penicilline Streptomycine OplossingCORNING30-002-CIComponent van kweekmedium
Fetaal bovien serumSigma AldrichF2442Component van kweekmedium
DMEM 1XGIBCO21068028kweekmedium voor phoenix-cel
CaCl2Sigma AldrichC1016gebruikt bij de phoenix-celtransfectie
HEPESSigma AldrichH3375gebruikt bij de phoenix-celtransfectie (HBS-oplossing)
KClSigma AldrichP9333gebruikt bij de phoenix-celtransfectie (HBS-oplossing)
DextroseSigma AldrichD9434gebruikt bij de phoenix-celtransfectie (HBS-oplossing)
NaClSigma AldrichS7653gebruikt bij de phoenix-celtransfectie (HBS-oplossing) en retrovirus precipitatie
Na2HPO4Sigma AldrichS3264gebruikt bij de phoenix-celtransfectie (HBS-oplossing)
TRYPSIN EDTA OPLOSSING 1XCORNING59430Cgebruikt bij celsplitsing
DPBS 1XGIBCO14190250Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
DMSOSigma AldrichD8418Component van celvriesmiddel (80% FBB en 20% DMSO)
G-418 DisulfaatFormediumG4185selectiemiddel voor 
Gelatine oplossing BioreagentSigma AldrichG1393coating van 96-well DNA-plaat en vriesplaat
Tris-baseFisher BioReagents10376743Component van Cel lysis buffer voor genomische DNA extractie
EDTASigma AldrichE6758Component van Cel lysis buffer voor genomische DNA extractie
SDSSigma Aldrich71729Component van Cel lysis buffer voor genomische DNA extractie
Proteinase KThermo FisherAM2546Component van Cel lysis buffer voor genomische DNA extractie
RNAse AThermo Fisher12091021RNA degradatie tijdens DNA extractie
AgaroseSigma AldrichA5304DNA gel voorbereiding
Atlas ClearSightBioatlasBH40501Kleurmiddel gebruikt voor het detecteren van DNA en RNA monsters in agarose gel
ethanolFisher BioReagentsBP28184DNA precipitatie
Natriumacetaat Sigma Aldrich71196Gebruikt voor DNA precipitatie op een 3M concentratie pH5.2
Wizard SV Gel en PCR clean-Up systeemPromegaA9282Extractie van PCR fragmenten uit agarose gel tijdens PCR screening van neomycin positieve klonen
TrizolAMBION15596018Organisch oplosmiddel gebruikt voor RNA extractie
Dnase ITHERMO SCIENTIFIC89836degradatie van genomisch DNA uit RNA 
dNTPs mixInvitrogen10297018gebruikt in RT en PCR reacties
DTTInvitrogen707265MLgebruikt in RT reacties
diethyl pyrocarbonaatSigma AldrichD5758gebruikt om RNAses in water te inactiveren (1:1000 verdunning)
RibolockThermo FisherEO0381RNase inhibitor
MOPSSigma AldrichM9381voorbereiding van RNA gel
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences15710voorbereiding van denaturerende RNA gel (1% PFA in 1x MOPS)
Superscript III Reverse transcriptaseInvitrogen18080-093Retrotranscriptiereactie
Pfu DNA polymerase (recombinant)Thermo ScientificEP0501PCR reactie
2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROXPCR BIOSYSTEMSPB 20.14qPCR reactie
Cre-GFP adenovirushttps://medicine.uiowa.edu/vectorcore1174-HTgebruikt om TERRA-MS2 klonen te infecteren om het neomycn-gen te verwijderen
Natrium ButyraatSigma AldrichB5887gebruikt om de retrovirusdeeltjesproductie in phoenix-cellen te bevorderen
PEG8000Sigma Aldrich89510Precipitatie van retrovirusdeeltjes
35µ-Schaal GlasbodemIbidi81158gebruikt bij live cel beeldvorming analyses van TERRA-MS2 klonen

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends. Science. 318 (5851), 798-801 (2007).
  2. Schoeftner, S., Blasco, M. A. Developmentally regulated transcription of mammalian telomeres by DNA-dependent RNA polymerase II. Nature Cell Biology. 10 (2), 228-236 (2008).
  3. Diman, A., Decottignies, A. Genomic origin and nuclear localization of TERRA telomeric repeat-containing RNA: from Darkness to Dawn. FEBS Journal. , (2017).
  4. Arnoult, N., Van Beneden, A., Decottignies, A. Telomere length regulates TERRA levels through increased trimethylation of telomeric H3K9 and HP1alpha. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (9), 948-956 (2012).
  5. Montero, J. J., et al. TERRA recruitment of polycomb to telomeres is essential for histone trymethylation marks at telomeric heterochromatin. Nature Communications. 9 (1), 1548(2018).
  6. Beishline, K., et al. CTCF driven TERRA transcription facilitates completion of telomere DNA replication. Nature Communications. 8 (1), 2114(2017).
  7. Arora, R., et al. RNaseH1 regulates TERRA-telomeric DNA hybrids and telomere maintenance in ALT tumour cells. Nature Communications. 5, 5220(2014).
  8. Balk, B., et al. Telomeric RNA-DNA hybrids affect telomere-length dynamics and senescence. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (10), 1199-1205 (2013).
  9. Graf, M., et al. Telomere Length Determines TERRA and R-Loop Regulation through the Cell Cycle. Cell. 170 (1), 72-85 (2017).
  10. Lee, Y. W., Arora, R., Wischnewski, H., Azzalin, C. M. TRF1 participates in chromosome end protection by averting TRF2-dependent telomeric R loops. Nature Structural & Molecular Biology. , (2018).
  11. Moravec, M., et al. TERRA promotes telomerase-mediated telomere elongation in Schizosaccharomyces pombe. EMBO Reports. 17 (7), 999-1012 (2016).
  12. Cusanelli, E., Romero, C. A., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA TERRA is induced by telomere shortening to nucleate telomerase molecules at short telomeres. Molecular Cell. 51 (6), 780-791 (2013).
  13. Moradi-Fard, S., et al. Smc5/6 Is a Telomere-Associated Complex that Regulates Sir4 Binding and TPE. PLoS Genetics. 12 (8), e1006268(2016).
  14. Chu, H. P., et al. TERRA RNA Antagonizes ATRX and Protects Telomeres. Cell. 170 (1), 86-101 (2017).
  15. Lai, L. T., Lee, P. J., Zhang, L. F. Immunofluorescence protects RNA signals in simultaneous RNA-DNA FISH. Experimental Cell Research. 319 (3), 46-55 (2013).
  16. Zhang, L. F., et al. Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells. Genetics. 182 (3), 685-698 (2009).
  17. Gallardo, F., Chartrand, P. Visualizing mRNAs in fixed and living yeast cells. Methods in Molecular Biology. 714, 203-219 (2011).
  18. Querido, E., Chartrand, P. Using fluorescent proteins to study mRNA trafficking in living cells. Methods in Cell Biology. 85, 273-292 (2008).
  19. Cusanelli, E., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 5 (3), 407-419 (2014).
  20. Perez-Romero, C. A., Lalonde, M., Chartrand, P., Cusanelli, E. Induction and relocalization of telomeric repeat-containing RNAs during diauxic shift in budding yeast. Current Genetics. , (2018).
  21. Avogaro, L., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics and function of single-telomere TERRA molecules in cancer cells. RNA Biology. , 1-10 (2018).
  22. Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
  23. Yamada, T., et al. Spatiotemporal analysis with a genetically encoded fluorescent RNA probe reveals TERRA function around telomeres. Scientific Reports. 6, 38910(2016).
  24. Deng, Z., et al. Formation of telomeric repeat-containing RNA (TERRA) foci in highly proliferating mouse cerebellar neuronal progenitors and medulloblastoma. Journal of Cell Science. 125 (Pt 18), 4383-4394 (2012).
  25. Casini, A., et al. A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast. Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).
  26. Nergadze, S. G., et al. CpG-island promoters drive transcription of human telomeres. RNA. 15 (12), 2186-2194 (2009).
  27. Porro, A., et al. Functional characterization of the TERRA transcriptome at damaged telomeres. Nature Communications. 5, 5379(2014).
  28. Farnung, B. O., Brun, C. M., Arora, R., Lorenzi, L. E., Azzalin, C. M. Telomerase efficiently elongates highly transcribing telomeres in human cancer cells. PLoS One. 7 (4), e35714(2012).
  29. Flynn, R. L., et al. Alternative lengthening of telomeres renders cancer cells hypersensitive to ATR inhibitors. Science. 347 (6219), 273-277 (2015).
  30. Scheibe, M., et al. Quantitative interaction screen of telomeric repeat-containing RNA reveals novel TERRA regulators. Genome Research. 23 (12), 2149-2157 (2013).
  31. Bolland, D. J., King, M. R., Reik, W., Corcoran, A. E., Krueger, C. Robust 3D DNA FISH using directly labeled probes. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
  32. Masui, O., et al. Live-cell chromosome dynamics and outcome of X chromosome pairing events during ES cell differentiation. Cell. 145 (3), 447-458 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

TERRA visualisatieMS2 GFP systeemtelomeer tagginglive cell imagingRNA FISH analyseconfocale microscopiesubtelomere integratieTRF2 mCherryneomycine selectie

Gerelateerde artikelen