Diagnose van de ziekte van Hirschsprung door immunokleuring rectale zuig biopten voor Calretinin, S100 proteïne en eiwit gen product 9,5

Samenvatting

Dit protocol beschrijft het proces van immunokleuring rectale zuig biopten voor calretinin, S100 proteïne, en proteïne gen product 9,5. Deze nieuwe adjuvante diagnostische methode voor de ziekte van Hirschsprung heeft de voorkeur gevoeligheid en specificiteit tarieven.

Samenvatting

De ziekte van Hirschsprung (HD) is een aangeboren darmziekte die klinisch manifesteert zich als een onvermogen om meconium door te geven bij zuigelingen of als langdurige constipatie bij kinderen. Rectale zuig biopsie (RSB) om de afwezigheid van ganglioncellen en neurale hypertrofie te bepalen is de meest accurate test voor de diagnose van HD op dit moment. Traditionele hematoxyline-eosine kleuring ontbreekt gevoeligheid en specificiteit. Acetylcholinesterase kleuring kan niet op grote schaal worden gebruikt vanwege zijn complexe proces. Onze nieuwe protocol van immunokleuring voor calretinin, S100 Protein, en Protein Gene product 9,5 (PGP 9.5), die we uitgevoerd op RSBs, vertoont hoge gevoeligheid en specificiteit van 96,49% (95% betrouwbaarheidsinterval, 0.88-0.99) en 100% (95% vertrouwen interval, 0.97-1.00), respectievelijk. De HD-getroffen segmenten vaak aanwezig als de afwezigheid van de expressie van calretinin, S100 Protein, en PGP 9.5, die markers van neurale hypertrofie in de submucosale weefsel. Dit protocol beschrijft het gedetailleerde werkproces van deze nieuwe diagnostische methode.

Inleiding

De ziekte van Hirschsprung (HD) is een gemeenschappelijke aangeboren darm darmaandoening die wordt gekenmerkt door een gebrek aan ganglioncellen in verschillende segmenten van het distale darmkanaal¹. De menselijke enterische zenuwstelsel wordt gevormd wanneer de invasie van de embryonale neurale cellen is voltooid. Als er een storing van het proces is en de invasie niet voltooit, wordt de distale darm van pasgeboren aganglionic². Deze potentieel fatale aandoening heet de ziekte van Hirschsprung. Proliferatie, beweeglijkheid, en darm groei zijn de drie belangrijkste componenten van succesvolle kolonisatie.

Traditionele hematoxyline en eosine (H & E) kleuring van een beperkte submucosale biopsie kan niet bereiken als bevredigend van een resultaat als H & E kleuring van een full-dikte weefsel verkregen uit een operatie. Bovendien, acetylcholinesterase (pijn) kleuring van rectale zuig weefsel is theoretisch uitdagende vanwege de onvoldoende gevoeligheid, die is 91%, en complexe verwerking van bevroren secties^3,4. Verschillende andere immunohistochemische markers van ganglioncellen en zenuwvezels die kunnen worden gekleurd in formaline-vaste en paraffine-embedded specimens zijn geleidelijk aan steeds de mainstream HD diagnostiek. Calretinin is een vitamine D-afhankelijke calcium-bindende eiwit dat niet wordt uitgedrukt in de myenteric en submucosale plexus van HD-getroffen segmenten⁵. S100 eiwit wordt uitgedrukt in cellen afgeleid van de neurale kuif, zoals zenuwvezels en glial cellen, die vaak aanwezig neurale hypertrofie in de submucosale weefsel van HD-getroffen segmenten⁶. Proteïne gen product 9,5 (PGP 9.5) betrouwbare vlekken zenuwvezels en ganglioncellen; PGP 9.5 kleuring fungeert als een aanvulling op calretinin kleuring, vooral in geval van geïsoleerde hypoganglionosis. De dubbele kleuring met S100 en PGP 9.5 kan het vals-negatieve tarief verminderen en de gevoeligheid verhogen. Als voorwaarde, de huidige studie is gericht op een adequate specificiteit en hoge gevoeligheid van deze nieuwe diagnostische methode te waarborgen. Onze nieuwe protocol gebruikt alle drie de markers voor de discriminatie van aganglionic darm en hypertrofische zenuwvezels. Een prospectieve studie van 318 kinderen werd uitgevoerd door ons lab en eerder gepubliceerd zonder een gedetailleerd protocol⁷. Het gedetailleerde protocol en de voorzorgsmaatregelen worden besproken in dit artikel. Elke pasgeborenen die leed aan een ernstige ontlasting probleem sinds de geboorte of kinderen met chronische constipatie met uitzondering van andere gemeenschappelijke ziekten zijn potentiële kandidaten voor rectale zuig biopsie (RSB). Onze nieuwe protocol is geschikt voor het bevlekken van niet alleen RSBs, maar ook full-dikte biopten of chirurgische specimens om een definitieve diagnose te stellen.

Protocol

Dit protocol werd goedgekeurd door de onderzoek Ethiekraad van het ziekenhuis van de Unie van Huazhong Universiteit van wetenschap en technologie.

1. rectale zuig biopsie

1. Voer de rectale zuig biopsie door een goed opgeleide pediatrische chirurg en een assistent met behulp van een Rbi2 zuig rectale biopsie systeem na het verkrijgen van geïnformeerde toestemming van de voogd.
   1. Voer RSB op patiënten die de volgende indicaties hebben: onvermogen om meconium te passeren bij zuigelingen of langdurige opgeblazen gevoel met of zonder constipatie bij kinderen; kinderen met lange-termijn constipatie die behoefte hebben aan paraffineolie om de ontlasting te voltooien; intestinale obstructie of intestinale perforatie met onbekende redenen bij kinderen ondergaan een enterostomy.
      Opmerking: de contra-indicaties voor RSB zijn als volgt: kinderen die ernstige symptomen, die in slechte fysieke conditie, of die niet kunnen tolerant de RSB; kinderen met acute-stage enterocolitis; kinderen ondergaan intestinale anastomosis zonder volledige genezing.
2. Voer een normale zoutoplossing retentie klysma als darm voorbereiding 36 h voor de procedure om losse ontlasting en overmatige oedeem van het slijmvlies te voorkomen. Voeg magnesiumsulfaat oplossing als het kind heeft ernstige constipatie. Toediening van vitamine K (1 mg/kg) aan pasgeborenen.
   Opmerking: Voer geen preoperatieve bloedtesten of het beheer van antibiotica, omdat ze niet nodig zijn.
3. Zet de patiënt in de lithotomy positie. Bedek het oppervlak van de buis met paraffineolie. Plaats de stompe-end buis 4-7 cm in de endeldarm met de zijkant gat tegenover de achterste of laterale muren.
4. Breng zachte druk op de buis om een adequate hechting van de zijkant gat te vergemakkelijken aan de rectale wand. Druk op de trigger en trek het gereedschap onmiddellijk in.
5. Gebruik de biopsie-instrument om 4 zuig biopten te verkrijgen met een diameter van 2 mm op 3 cm en 6 cm boven de tand lijn, anteriorly en posteriorly. Gebruik een naald om het monster te plaatsen op een gaasje bevochtigd met een zoutoplossing.
6. Observeer de patiënt tot 2 uur na de procedure uit te sluiten rectale bloeden. Vermijd verdere rectale en anale manipulaties in de eerste 24 uur na RSB.

2. voorbereiding van de RSB secties

1. Plaats de rectale zuig biopten in 4% Paraformaldehyde voor 6 uur om het weefsel vast te stellen. Gebruik een fixatief volume 5 keer meer dan het weefsel volume.
2. Dehydrateer het weefsel met behulp van de pathologische weefsel dehydrater voor 11 h. Het hele geprogrammeerde proces bestaat uit de volgende 5 stappen:
   1. Plaats het weefsel in formaldehyde en bevestig voor 1 uur.
   2. Plaats het weefsel in 75% ethanol voor 4 uur.
   3. Plaats het weefsel in absolute ethanol (twee veranderingen, 1 h elk).
   4. Plaats het weefsel in absolute ethanol (twee veranderingen, 30 min elk).
   5. Plaats het weefsel in xyleen (drie veranderingen, 1 h elk).
3. Plaats het weefsel in paraffine (58-60 °C) (drie veranderingen, 1 h elk). Embed de RSB weefsels in paraffineblokken.
4. Trim de paraffineblokken met behulp van een microtome totdat het weefsel volledig is blootgesteld met een complete sectie vliegtuig.
5. Snijd de blokken in 0,4 μm secties met een microtome.
6. Plaats de secties in 45-50 °C water voor een paar seconden elk om de secties toe te laten om in een vlakke plaat te verspreiden.
7. Breng de paraffine secties over op dia's.
8. Bak de dia's in een 60 °C oven voor 3-5 h. Vermijd bakken te lang, wat kan leiden tot het verlies van de antigenen.
9. Plaats de ontparaffine dia's in xyleen (2 veranderingen, 15 min elk).
10. Hydrateren de dia's in absolute ethanol, 95%, 80%, en 75% ethanol voor 5 min elk. Vervolgens spoel ze in omgekeerde osmose (RO)-gezuiverd water voor nog eens 5 minuten.

3. het herwinning van het antigeen

1. Maakwerk verdunningen voor calretinin ophalen door het mengen van 4 mL EDTA-antigeen ophalen buffer met 200 mL van RO-gezuiverd water. Maakwerk verdunningen voor S100 en PGP 9.5 ophalen door het mengen van 1 mL citroenzuur natrium citraat buffer (100x) met 99 mL van RO-gezuiverd water.
   Opmerking: Calretinin kan bij voorkeur worden opgehaald door EDTA-oplossing voor het ophalen. Echter, citroenzuur natrium citraat buffer is meer geschikt voor het ophalen van S100 en PGP 9.5.
2. Plaats de dia's in een coplin kleuring jar. Vul de pot met ophalen oplossing en plaats deze in een voorverwarmd kokend waterbad. Na het koken voor 20 min, verwijder de pot uit het waterbad en laat het afkoelen tot kamertemperatuur. Het koelproces duurt ongeveer 10 minuten. Verwijder de dia's en spoel ze voorzichtig af met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).
3. Teken een cirkel met een marker pen rond het weefsel en voor te bereiden een natte doos voor de volgende procedures.

4. blokkeren

1. Maakwerk verdunningen door 3 mL 30% H₂O₂ te mengen met 27 ml ro-gezuiverd water.
2. Voeg twee of drie druppels van 3% H₂O₂ oplossing dropwise op het weefsel te blokkeren peroxidates. Voeg de H₂O₂ oplossing onmiddellijk toe om ervoor te zorgen dat de oplossing niet van de cirkel overloopt. Voer blokkering van peroxidates uit in een incubator van 37 °C voor 20 min.
3. Spoel de dia's voorzichtig met PBS (drie wasbeurten, 5 min elk).
4. Blokkeer de dia's voor 20 min bij 37 °C met 5% boviene serum albumine (BSA, bereid door het mengen van 1,5 g van BSA poeder met 30 mL RO-gezuiverd water).
   Opmerking: blokkeren met 3% H₂O₂ kan voorkomen dat 95% van de niet-specifieke kleuring en blokkering met 5% BSA kan voorkomen dat de andere 5% van de niet-specifieke kleuring. Combineer de twee methoden om een betrouwbaar resultaat te verkrijgen.

5. antigeen-antilichaam reactie

1. Verwijder de 5% BSA en voeg 50 l van primair antilichaam (calretinin, S100, of PGP 9.5) toe aan de dia. Incubeer overnachting bij 4 °C.
2. Was de dia met PBS (drie keer, 3 min elk).
3. Voeg 50 l van de polymeer versterker toe (reagens A; Zie de lijst van materialen) aan de sectie en Incubeer het 20 min in een incubator van 37 °c. Dan, was de dia met PBS (drie keer, 3 min elk).
4. Voeg 50 l van secundair antilichaam B (geit anti-konijn/muis IgG secundair antilichaam) aan de sectie toe en incubeer 30 min in een incubator van 37 °C. Was de sectie met PBS (drie keer, 5 min elk).

6.3, 3-Diaminobenzidine en hematoxyline kleuring

1. Voeg 850 l van RO-gezuiverd water toe aan een buis van 1,5 mL en voeg de kleurstoffen reagentia toe (Zie de materiaallijst) in de volgorde a; B, en C. Voeg 50 l van elk reagens toe om een totaal van 1 ml 3, 3-DIAMINOBENZIDINE (DAB) werkoplossing te verkrijgen. Als er precipitaten, gebruik de oplossing na filtratie.
2. Voeg een druppel van DAB werkende oplossing om het weefsel sectie en vlek voor 3-10 min. Incubeer de dia's in schar bij kamertemperatuur tot bruine kleuring wordt gedetecteerd. Monitor zorgvuldig met behulp van een helderveld Microscoop. Houd de DAB-werkoplossing weg van het licht. Dan, was de dia met PBS 5 min.
3. Voeg een druppel hematoxyline aan eosine de kernen voor ongeveer 1 min. Dan, houd de coplin pot en was het onder een straaltje water voor ongeveer 30-40 s tot de overtollige kleurstof wordt verwijderd. Zorg ervoor dat u de weefselsecties niet beschadigt.
4. Dompel de RSB dia's in een coplin jar met PBS voor 25-30 s. Dan, onderscheid in 1% hydrochloric zuur-ethylalcohol voor 10 s. was de dia's met PBS 1 min.
5. Dehydrateer de dia's in de omgekeerde volgorde van hydratatie: 75%, 80%, 95%, en absolute ethanol (5 min elk).
6. De dia's blootstellen aan xyleen (2 veranderingen, 5 min elk).
7. Monteer de dekglaasje met ultraclean montage. Laat dia's drogen voordat visualisatie met behulp van een microscoop.

Resultaten

In totaal werden 318 patiënten ingeschreven in onze studie. Alle patiënten onderging RSB, en de weefsels werden gekleurd voor calretinin, S100, en PGP 9.5. De diagnose op basis van onze nieuwe protocol was HD in 97 gevallen, niet-HD in 213 gevallen, en vermoed HD in 8 gevallen. Onder de 132 chirurgische patiënten, 99 patiënten werden gediagnosticeerd met HD door immunokleuring van volledige dikte specimens na de operatie. S100 en PGP 9.5 kleuring bleek dat 92% en 93% van de 99 patiënten, ...

Discussie

Hier hebben we beschreven een procedure met behulp van drie verschillende immunohistochemische antistoffen aan RBS secties vlek voor de diagnose van HD. De gevoeligheid van ons diagnostisch protocol was 96,49% (95% CI, 0.88-0.99), en de specificiteit was 100% (95% CI, 0.97-1.00).

De meest kritieke stappen van het protocol zijn RSB en antigeen-antilichaam reactie. De grootte van de biopsie bepaalt de nauwkeurigheid van de kleuring. Een kleine biopsie zal niet genoeg weefsel om een precieze diag...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
calretinin antibody	MXB Biotechnologies	MAB-0716 170416405c	antibody: primaire antilichaam
S-100 antibody	MXB Biotechnologies	Kit-0007	antibody: primaire antilichaam
PGP9.5 antibody	Shanghai long island antibody Co. Ltd	R-0457-03	antibody: primaire antilichaam
versterker reagens	MXB Biotechnologies	KIT-9902-A 170416405a	antibody: secundair antilichaam A
Geiten anti-konijn/muis IgG secundair antilichaam	MXB Biotechnologies	KIT-9902-B	antibody: secundair antilichaam B
DAB kleuringskit (bevat reagens A B en C)	MXB Biotechnologies	DAB-0031	kleuringskit
Hitte-incubator	Shanghai yiheng instrument Co. Ltd	DHP-9082	instrument
Rbi2 zuig rectale biopsie systeem	Aus Systems Pty Ltd, South Australia, Australië	CP1200 HP1000 SS1000	instrument
microtoom	Leica	leica RM2016	instrument
citroenzuur natriumcitraat buffer (100X)	MXB Biotechnologies	MVS-0101	antigen retrievaal buffer
pathologische weefsel ontwateringsapparaat	Wuhan junjie electronic Co. Ltd	JT-12F	instrument