Methodenartikel

Keuring voor anorganische polyfosfaat in bacteriën

8.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58818

⸱

21 januari 2019

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, University of Alabama at Birmingham, 2Division of Infectious Diseases, University of Alabama at Birmingham

In dit artikel

Samenvatting

Beschrijven we een eenvoudige methode voor snelle kwantificering van anorganische polyfosfaat in verschillende bacteriën, waaronder mycobacteriële, gram-negatieve en gram-positieve soorten.

Samenvatting

Anorganische polyfosfaat (poliep) is een biologische polymeer gevonden in de cellen in alle domeinen van het leven, en is vereist voor de virulentie en stressrespons bij vele bacteriën. Er zijn een aantal manieren om quantifying poliep in biologische materialen, waarvan vele zijn arbeidsintensief of ongevoelig, beperken hun nut. Wij presenteren hier een gestroomlijnde methode voor de kwantificering van de poliep in bacteriën, met behulp van een silica membraan kolom extractie geoptimaliseerd voor snelle verwerking van meerdere monsters, vertering van poliep met de poliep-specifieke exopolyphosphatase ScPPX, en detectie van de resulterende gratis fosfaat met een gevoelige ascorbinezuur gebaseerde colorimetrische test. Deze procedure is eenvoudig, goedkoop en betrouwbaar poliep kwantificering kan in verschillende bacteriesoorten. Wij presenteren representatieve poliep kwantificering van de gram-negatieve bacterie (Escherichia coli), de gram-positieve melkzuur-bacterie (Lactobacillus reuteri), en mycobacteriële soorten (Mycobacterium smegmatis). We voegen ook een eenvoudig protocol voor nikkel affiniteit zuivering van mg hoeveelheden van ScPPX, die nog niet commercieel beschikbaar.

Inleiding

Anorganische polyfosfaat (poliep) is een lineaire biopolymeer van phosphoanhydride-linked fosfaat eenheden die wordt gevonden in alle domeinen van het leven1,2,3. In diverse bacteriën is poliep essentieel voor de stressrespons, beweeglijkheid, vorming van biofilms, celcyclus controle, antibioticaresistentie en virulentie4,5,6,7,8 ,9,10,11. Studies van de poliep metabolisme in bacteriën dus het potentieel hebben om opbrengst fundamentele inzichten in het vermogen van bacteriën om te leiden tot ziekte en gedijen in uiteenlopende omgevingen. In veel gevallen zijn de methoden die beschikbaar zijn voor de kwantificering van de poliep in bacteriële cellen echter een beperkende factor in deze studies.

Er zijn verschillende methoden die momenteel gebruikt voor het meten van de poliep in biologische materialen. Deze methoden zijn gewoonlijk twee afzonderlijke stappen: uitpakken van de poliep en kwantificeren van de poliep presenteren in deze extracten. De huidige methode van de goudstandaard, ontwikkeld voor de gist Saccharomyces cerevisiae door Bru en collega's12, extracten poliep samen met DNA en RNA met behulp van fenol en chloroform, gevolgd door ethanol neerslag, behandeling met deoxyribonuclease (DNase) en ribonuclease (RNase), en de spijsvertering van de resulterende gezuiverde poliep met de S. cerevisiae poliep-vernederende enzym exopolyphosphatase (ScPPX)13 opbrengst gratis fosfaat, dat vervolgens wordt gekwantificeerd met behulp van een Malachiet groen-gebaseerd colorimetrische bepaling. Deze procedure is zeer kwantitatieve maar arbeidsintensief, beperking van het aantal monsters dat kan worden verwerkt in een één experiment, en is niet geoptimaliseerd voor bacteriële monsters. Anderen hebben gemeld poliep extraheren uit een verscheidenheid van cellen en weefsels met behulp van silica kralen ("glassmilk") of silica membraan kolommen6,14,15,16,17, 18. Deze methoden doen niet efficiënt uitgepakt korte keten poliep (minder dan 60 fosfaat eenheden)12,14,15, hoewel dit van minder belang voor bacteriën, die over het algemeen gedacht zijn te synthetiseren voornamelijk lange-keten poliep3. Oudere methoden van poliep extractie met behulp van sterke zuren19,20 zijn niet langer gebruikte, omdat de poliep is onstabiel onder zure omstandigheden12.

Er zijn ook een aantal gerapporteerde manieren om quantifying poliep. Onder de meest voorkomende is 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), een fluorescente kleurstof meer meestal gebruikt om de vlekken van DNA. DAPI-polyP complexen hebben verschillende fluorescentie excitatie en emissie-maxima dan DAPI-DNA complexen21,22, maar er is aanzienlijke inmenging van andere cellulaire componenten, met inbegrip van RNA, nucleotiden en inositol fosfaten12,15,16,23, vermindering van de specificiteit en de gevoeligheid van de poliep metingen die worden uitgevoerd met behulp van deze methode. U kunt ook poliep en adenosinedifosfaat (ADP) kunnen worden omgezet in adenosine trifosfaat (ATP) met behulp van gezuiverde Escherichia coli poliep kinase (PPK) en de resulterende ATP gekwantificeerd aan de hand van luciferase14,17 ,18. Dit maakt de de ontdekking van zeer kleine hoeveelheden van de poliep, maar vereist twee stappen van de enzymatische reactie en zowel luciferine en zeer zuiver ADP, die dure reagentia. ScPPX specifiek verteert poliep in gratis fosfaat6,12,13,24, die kan worden opgespoord met behulp van de eenvoudiger methoden, maar ScPPX wordt geremd door DNA en RNA12, noodzakelijk DNase en RNase behandelingvan poliep-bevattende extracten. Noch PPK en ScPPX niet commercieel beschikbaar, en PPK zuivering is relatief complexe25,26.

Poliep in cel lysates of uittreksels kan ook worden gevisualiseerd op polyacrylamide gels door DAPI negatieve kleuring27,28,29,30, een methode die beoordeling van ketenlengte wel toegestaan, maar is lage-doorvoer en slecht kwantitatieve.

Nu melden we een snelle, goedkope en middellange-doorvoer poliep assay waarmee snelle kwantificering van de poliep niveaus in verschillende bacteriesoorten. Deze methode begint met het lysing van bacteriële cellen bij 95 ° C in 4 M guanidine isothiocyanaat (GITC)14 om de inactivering van cellulaire fosfatasen genaamd, gevolgd door een silica membraan kolom extractie geoptimaliseerd voor snelle verwerking van meerdere monsters. Het resulterende poliep-bevattende extract wordt dan met een grote overmaat van ScPPX, eliminerend de behoefte aan DNase en RNase behandeling verteerd. We nemen een protocol voor eenvoudige nikkel affiniteit zuivering van mg hoeveelheden ScPPX. Ten slotte is de poliep afkomstige gratis fosfaat gekwantificeerd met een eenvoudige, gevoelige, ascorbinezuur-based colorimetrische bepaling24 en genormaliseerd naar totale cellulaire eiwit. Deze methode stroomlijnt de meting van de poliep in bacteriële cellen, en wij tonen het gebruik ervan met de representatieve soorten van gram-negatieve bacteriën, gram-positieve bacteriën en mycobacteriën.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. het zuiveren van gist Exopolyphosphatase (ScPPX)

  1. Transformeer de E. coli eiwit overexpressie stam BL21(DE3)31 met plasmide pScPPX26 door electroporation32 of33van de chemisch te worden verwerkt.
  2. Inoculeer 1 L lysogenie Bouillon (LB) met 100 µg mL-1 ampicilline in een unbaffled kolf van 2 L met een één kolonie van BL21(DE3) met pScPPX2 en incubeer 's nachts bij 37 ° C zonder schudden, aan een absorptie bij 600 nm (een600) van ongeveer 0,3, uitgedrukt in een spectrofotometer.
  3. Start van de cultuur (180 rpm) schudden en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C, gedurende welke tijd de cellen tot een A600 van 0,4 toenemen zal - 0,5.
  4. Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) toevoegen om een eindconcentratie van 1 mM en een extra 100 µg mL-1 ampicilline en incubeer gedurende 4 uur bij 37 ° C met schudden bij 180 t/min.
    Opmerking: Dit protocol overexpressie genereert een grote hoeveelheid oplosbare ScPPX. Echter ScPPX overexpressie is zeer vergevingsgezind, en een verscheidenheid van andere gemeenschappelijke overexpressie EiwitProtocollen zijn gebruikt om met succes het zuiveren van ScPPX.
  5. De cellen overbrengen in een fles 1 L centrifuge en oogst ze door centrifugeren gedurende 20 minuten bij 5000 x g bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en de cel pellet overbrengen in een conische tube van 50 mL.
    Opmerking: Cel pellets kunnen worden opgeslagen voor onbepaalde tijd bij-80 ° C.
  6. De pellet op ijs ontdooien, dan het resuspendeer in 9 mL 50 mM HEPES, 0.5 M NaCl en 5 mM imidazool (pH 8) voor een totaal volume van ongeveer 10 mL.
  7. (Eindconcentraties) 1 mg lysozyme-1 mL, 2 mM MgCl2en 50 eenheden mL-1 voor een RNA - en DNA-vernederende endonuclease toevoegen (Zie Tabel van materialen) en incubeer gedurende 30 min op ijs.
    Opmerking: ScPPX bindt nucleic zuren (gegevens niet worden weergegeven), zodat de nuclease behandeling is van essentieel belang tijdens het zuiveringsproces ongehinderd.
  8. Met behulp van een ultrasoonapparaat met een microtip (Zie Tabel of Materials), lyse de cellen door 2 cycli van ultrasoonapparaat op ijs op 50% kracht, pulserende 5 s op en 5 s af, met een 2 min rust tussen de cycli.
    Opmerking: Gebruik juiste gehoorbescherming tijdens ultrasoonapparaat. Ook het geval met overexpressie, een scala aan cellysis methodes zijn aanvaardbaar voor de zuivering van de ScPPX.
  9. Verwijderen van de onoplosbare puin door centrifugeren de lysate gedurende 20 minuten bij 20.000 x g bij 4 ° C. Filtreer het resulterende supernatant (ongeveer 10 mL) door een 0.8 µm porie-grootte celluloseacetaat spuit-filter.
  10. Laden de lysate op een chelaat kolom nikkel-betalen 5 mL (Zie Tabel van materialen) gebruik een peristaltische pomp of een grote injectiespuit.
  11. Spoel de kolom met 50 mL 50 mM HEPES, 0.5 M NaCl, 5 mM imidazool (pH 8).
  12. Spoel de kolom met 50 mL 50 mM HEPES, 0.5 M NaCl, 20 mM imidazool (pH 8).
  13. Elueer ScPPX met 50 mM HEPES, 0.5 M NaCl en 0.5 M imidazool (pH 8), verzamelen 15 1 mL breuken. Test deze elutie breuken voor eiwit genoegen nemen met de Bradford eiwit assay34 (Zie Tabel van materialen) en uitvoeren van een SDS-pagina gel35 om te bevestigen welke breuken bevatten gezuiverde ScPPX (moleculair gewicht = 45 kDa).
  14. Zwembad de breuken met pure ScPPX en aanpassen van de concentratie van de gebundelde proteïne tot ongeveer 2 mg mL-1 met 50 mM HEPES en 0.5 M NaCl. Hogere eiwit concentraties kunnen neerslaan in de volgende stap.
  15. Wisselen de gezuiverde ScPPX in opslag buffer (20 mM Tris-HCl [pH 7.5], 50 mM KCl, 10% [v/v] glycerol) door dialyse. Plaats van gebundelde ScPPX breuken in een verzegelde lengte van 12.000-14.000 Da molecuulgewicht cutoff dialyse membraan buizen (Zie Tabel van materialen) en schorten in 1 L voor opslag buffer met continu roeren bij 4 ° C voor ten minste 4 h. Herhaal deze stap met verse de buffer van de opslag voor een totaal van 3 buffer veranderingen.
  16. De gezuiverde, dialyzed eiwit overbrengen in een centrifugebuis of buizen en Centrifugeer gedurende 20 min bij 20.000 x g bij 4 ° C tot het verwijderen van eventuele onoplosbare aggregaten. Zorgvuldig overbrengen in het supernatant een schone 15 mL conische buis.
  17. Aanpassen van de concentratie van het gezuiverde ScPPX naar 1 mg mL-1 met opslag buffer, toevoegen van 0,1% (g/v) protease-vrije bovien serumalbumine (BSA; eindconcentratie), en de opslag voor maximaal 6 maanden bij 4 ° C.
    Opmerking: ScPPX verliest meer dan 90% van haar activiteit wanneer het bevroren13.

2. oogsten monsters voor polyfosfaat extractie

  1. Groeien bacteriën onder de voorwaarden van belang voor het bepalen van de inhoud van de poliep. Voor dit protocol, Lactobacillus reuteri36 's nachts bij 37 ° C te groeien zonder schudden in malic enzym inductie (MEI) middellange37 zonder cysteïne (MEI-C).
  2. Oogst voldoende cellen door centrifugeren in een tube microcentrifuge 1,5 mL 50 – 100 µg cellulaire eiwit optellen (zie stap 3 hieronder). Voor E. coli, is dit 1 mL van een logboek fase cultuur op een A-600 van 0,2 - 0,4. Voor L. reuteriis dit 1 mL van een overnachting cultuur. Pas zo nodig voor andere soorten van belang.
  3. Verwijder het supernatant volledig uit de cel pellets.
  4. Resuspendeer de cel pellets in 250 µL van GITC lysis buffer (4 M guanidine isothiocyanaat, 50 mM Tris-HCl, pH 7) en lyse door incubatie bij 95 ° C gedurende 10 min. winkel lysates bij-80 ° C.
    Opmerking: Verenigbaar met de lysis van de tijd, omdat uitgebreide broedtijd bij hoge temperatuur leiden aantasting van de poliep door hydrolyse38 tot kan. Lysates kunnen voor onbepaalde tijd worden opgeslagen bij-80 ° C.
    Let op: Guanidine isothiocyanaat is een chaotropic-zout en moet worden behandeld met handschoenen en afgevoerd als gevaarlijk afval.

3. meten van het eiwitgehalte van cel Lysates

  1. Bereiden BSA normen met 0, 0.1, 0.2 en 0.4 mg mL-1 van BSA in GITC lysis-buffermengsel.
    Opmerking: Het is belangrijk om de BSA-normen in GITC, want GITC de ontwikkeling van de kleur van de analyse van Bradford beïnvloedt. BSA normen kunnen voor onbepaalde tijd worden opgeslagen bij-20 ° C.
  2. Aliquot 5 µL van ontdooide, goed gemengde cel lysates en BSA normen te scheiden van putten in een duidelijk 96-wells-plaat.
  3. 195 µL van Bradford reagens34 toevoegen aan elk putje en meten van de absorptie bij 595 nm (een595) in een afleesapparaat (Zie Tabel van materialen).
  4. Berekenen van de hoeveelheid eiwit in elk putje door vergelijking met de standaard curve van de BSA, met behulp van de formule y = mx + b, waarbij y is een595, x µg BSA, m is de helling van de standaard curve, en b is het y-snijpunt van de standaard curve. De resulterende waarde met 0.05 om te bepalen van de totale mg van eiwitten in elk monster vermenigvuldigen.

4. wordt uitgepakt polyfosfaat

  1. Voeg toe 250 µL ethanol 95% aan elke steekproef lysed van GITC en vortex te mengen.
  2. Dat mengsel toepassen in een silica membraan spin kolom en centrifuge voor 30 s bij 16.100 x g.
  3. Gooi de doorstroming, dan Voeg 750 µL van 5 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50% ethanol en centrifuge voor 30 s bij 16.100 x g.
  4. De doorstroming en Centrifugeer gedurende 2 min bij 16.100 x g negeren.
  5. Plaats van de kolom in een schone 1,5 mL microfuge buis en voeg 150 µL van 50 mM Tris-HCl (pH 8).
  6. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten, dan poliep Elueer door gedurende 2 minuten bij 8.000 x g centrifugeren.
    Opmerking: Indien gewenst, de eluaten kunnen worden achtergelaten bij-20 ° C gedurende ten minste 1 week.

5. verteren polyfosfaat

  1. Met 0, 5, 50 of 200 µM kalium fosfaat in 50 mM Tris-HCl (pH 8) normen voor te bereiden.
    Opmerking: Kalium fosfaat normen kunnen worden opgeslagen voor onbepaalde tijd bij kamertemperatuur.
  2. Aliquot 100 µL van elke standaard fosfaat en uitgepakt poliep monsters in aparte putjes van een duidelijk 96-wells-plaat.
  3. Voorbereiding van een master mix met (per monster): 30 µL van 5 x ScPPX reactie-buffer (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2250 mM ammoniumacetaat, pH 7.5)13, 19 µL van H2O en 1 µL van gezuiverde ScPPX (1 mg mL-1).
  4. Voeg 50 µL van de master mix aan elk putje van de 96-wells-plaat. Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C.
    Opmerking: Indien gewenst, het verteerd poliep monsters kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C voor onbepaalde tijd.

6. opsporen van gratis fosfaat24

  1. Bereid detectie oplossing basis door ontbinding 0,185 g van antimoon kaliumtartraat in 200 mL water, dus het toevoegen van 150 mL 4 N H24, vervolgens toe te voegen 1,49 g van ammoniumnitraat heptamolybdate. Roer om los en breng tot een eindvolume van 456 mL. Filtreer de oplossing voor het verwijderen van deeltjes en opslaan beschermd tegen licht bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.
  2. Voorbereiden van een stamoplossing van 1 M ascorbinezuur. Winkel beschermd tegen licht bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.
  3. Bereid een verse voorraad van de werken van detectie oplossing elke dag door het mengen van detectie basis 9.12 mL met 0.88 mL 1 M ascorbinezuur. Toestaan dat de detectie-oplossing om te komen tot kamertemperatuur vóór gebruik.
  4. 50 µL van detectie oplossing toevoegen aan elk monster en de standaard in de 96-wells-plaat en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 2 minuten om ontwikkeling van de kleur.
  5. Meten van de absorptie bij 882 nm met een afleesapparaat en bereken de concentratie van de fosfaat van elk monster in vergelijking tot de kalium fosfaat standaard curve.
    Let op: De detectie-oplossing bevat giftige zouten en sterke zuren. Draag handschoenen en behandelen van overtollige oplossing als giftig afval.

7. berekening van de cellulaire polyfosfaat inhoud

  1. Converteren van de concentraties van de fosfaat bepaald in stap 6.5 aan nanomoles van de poliep afkomstige fosfaat in elke hele cel lysate volgens de volgende formule:
    nmol poliep = 1.5 x (µM fosfaat / 10)
    Opmerking: De standaard curve gebaseerde methode in stap 6, bepaalt de concentratie van fosfaat (in µM) in elk 100 µL poliep monster aliquoted in stap 5.2. Deze concentratie om om te zetten een aantal nmol, 100 µL wordt gedeeld door 106 te geven van een volume in L, vermenigvuldigd met de concentratie (µmol L-1) en vervolgens vermenigvuldigd met 1.000 (het aantal nmol in een µmol). Dit reduceert tot de concentratie te delen door 10. Het volume van de totale extract bereid in stap 4 is 150 µL, dus het is noodzakelijk om te vermenigvuldigen de resulterende waarde met 1,5 voor de berekening van de nmol van fosfaat aanwezig in het hele extract.
  2. Normaliseren cellulaire poliep inhoud aan totale cellulaire eiwit door nmol poliep te delen door de totale proteïne van mg in elk monster bepaald in stap 3.4. Poliep niveaus zijn uitgedrukt in termen van de concentratie van individuele poliep afkomstige gratis fosfaat.
    Opmerking: In sommige gevallen kan het bedrag van de poliep afkomstige fosfaat aanwezig in een monster vallen buiten het lineaire bereik van de standaard curve van fosfaat (stap 6.5). Als de niveaus van de poliep erg hoog zijn, kan het overtollige poliep-bevattende eluaat uit stap 4.6 verdunde 1:10 of 1:100, als dit nodig is, en vervolgens gemeten opnieuw zoals beschreven in stappen 5 t/m 7.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De belangrijkste stappen van het protocol zijn routerplan in vereenvoudigde vorm in Figuur 1.

Om aan te tonen het gebruik van dit protocol met gram-negatieve bacteriën, wild-type E. coli was MG165539 uitgegroeid tot halverwege log fase in de rijke medium LB bij 37 ° C met schudden (200 rpm), vervolgens gespoeld en een extra 2 h in ge¨ uncubeerd morpholinopropanesulfo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het protocol hier beschreven vereenvoudigt en versnelt de kwantificering van de poliep niveaus in diverse bacteriën, met een typische set 24 monsters nemen ongeveer 1,5 h volledig verwerken. Dit maakt snelle screening van monsters en analyse van de mutant Bibliotheken, en vereenvoudigt de kinetische experimenten voor het meten van de accumulatie van poliep na verloop van tijd. We hebben aangetoond dat het protocol effectief op vertegenwoordigers van drie verschillende stammen werkt: proteobacteria, firmicutes, en Straalz...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit project werd ondersteund door de Universiteit van Alabama in Birmingham departement microbiologie opstarten middelen en NIH grant R35GM124590 (naar MJG) en NIH subsidie R01AI121364 (FW).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
E. coli BL21(DE3)Millipore Sigma69450
plasmid pScPPX2Addgene112877beschikbaar voor academische en andere non-profitinstellingen
LB bouillonFisher ScientificBP1427-2E. coli groeimedium
ampicillineFisher ScientificBP176025
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG)Gold BiotechnologyI2481C
HEPES bufferGold BiotechnologyH-400-1
kaliumhydroxide (KOH)Fisher ScientificP250500voor het aanpassen van de pH van HEPES-gebufferde oplossingen
natriumchloride (NaCl)Fisher ScientificS27110
imidazoolFisher ScientificO3196500
lysozymFisher ScientificAAJ6070106
magnesiumchloride (MgCl2)Fisher ScientificBP214-500
Pierce Universal NucleaseFisher ScientificPI88700Benzonase (Sigma-Aldrich cat. # E1014) is een acceptabel alternatief
Model 120 Sonic DismembratorFisher ScientificFB-120andere cellysismethoden (bijv. French Press) kunnen ook effectief zijn
5 mL HiTrap chelating HP kolomGE Life Sciences17040901elke nikkel-affiniteitschromatografie kolom of hars kan worden vervangen
nikkel(II) sulfaat hexahydraatFisher ScientificAC415611000voor het opladen van de HiTrap kolom
0,8 µm poriëngrootte cellulose acetaat spuitfiltersFisher Scientific09-302-168
Bradford reagensBio-Rad5000205
Tris bufferFisher ScientificBP1525
Spectrum Spectra/Por 4 RC Dialyse Membraanbuisjes 12.000 tot 14.000 Dalton MWCOFisher Scientific08-667Bandere dialysemembranen met MWCO & lt; 30.000 Da zouden ook moeten werken
zoutezuur (HCl)Fisher ScientificA144-212voor het aanpassen van de pH van Tris-gebufferde oplossingen
kaliumchloride (KCl)Fisher ScientificP217500
glycerolFisher ScientificBP2294
10x MOPS medium mengselTeknovaM2101E. coli groeimedium
glucoseFisher ScientificD161
monobasisch kaliumfosfaat (KH2PO4)Fisher ScientificBP362-500
dibasisch kaliumfosfaat (K2HPO4)Fisher ScientificBP363-500
gedehydrateerd gistextractFisher ScientificDF0886-17-0
tryptonFisher ScientificBP1421-500
magnesiumsulfaat heptahydraatFisher ScientificM63-50
mangansulfaat monohydraatFisher ScientificM113-500
guanidine isothiocyanateFisher ScientificBP221-250
runde serum albumine (proteasevrij)Fisher ScientificBP9703100
heldere vlakke bodem 96-well platenSigma-AldrichM0812-100EAelke heldere 96-well plaat zal werken
Tecan M1000 Infinite plate readerTecan, Inc.niet van toepassingelke plate reader die in staat is om de absorptie te meten bij 595 en 882 nm zal werken
ethanolFisher Scientific04-355-451
silica membraan spin kolommenEpoch Life Science1910-050/250
ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)Fisher ScientificBP120500
1,5 mL microfuge buisjesFisher ScientificNC9580154
ammoniumacetaatFisher ScientificA637-500
antimoonkaliumtartraatFisher ScientificAAA1088922
4 N zwavelzuur (H2SO4)Fisher ScientificSA818-500
ammoniumheptamolybdaatFisher ScientificAAA1376630
ascorbinezuurFisher ScientificAC401471000

Referenties

  1. Rao, N. N., Gomez-Garcia, M. R., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate: essential for growth and survival. Annual Review of Biochemistry. 78, 605-647 (2009).
  2. Achbergerova, L., Nahalka, J. Polyphosphate--an ancient energy source and active metabolic regulator. Microbial Cell Factories. 10, 63(2011).
  3. Kornberg, A., Rao, N. N., Ault-Riche, D. Inorganic polyphosphate: a molecule of many functions. Annual Review of Biochemistry. 68, 89-125 (1999).
  4. Albi, T., Serrano, A. Inorganic polyphosphate in the microbial world. Emerging roles for a multifaceted biopolymer. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 32 (2), 27(2016).
  5. Gray, M. J., Jakob, U. Oxidative stress protection by polyphosphate--new roles for an old player. Current Opinion in Microbiology. 24, 1-6 (2015).
  6. Gray, M. J., et al. Polyphosphate is a primordial chaperone. Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).
  7. Racki, L. R., et al. Polyphosphate granule biogenesis is temporally and functionally tied to cell cycle exit during starvation in Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2440-E2449 (2017).
  8. Rashid, M. H., et al. Polyphosphate kinase is essential for biofilm development, quorum sensing, and virulence of Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (17), 9636-9641 (2000).
  9. Candon, H. L., Allan, B. J., Fraley, C. D., Gaynor, E. C. Polyphosphate kinase 1 is a pathogenesis determinant in Campylobacter jejuni. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8099-8108 (2007).
  10. Richards, M. I., Michell, S. L., Oyston, P. C. An intracellularly inducible gene involved in virulence and polyphosphate production in Francisella. Journal of Medical Microbiology. 57 (Pt 10), 1183-1192 (2008).
  11. Singh, R., et al. Polyphosphate deficiency in Mycobacterium tuberculosis is associated with enhanced drug susceptibility and impaired growth in guinea pigs. Journal of Bacteriology. 195 (12), 2839-2851 (2013).
  12. Bru, S., Jimenez, J., Canadell, D., Arino, J., Clotet, J. Improvement of biochemical methods of polyP quantification. Microbial Cell. 4 (1), 6-15 (2016).
  13. Wurst, H., Kornberg, A. A soluble exopolyphosphatase of Saccharomyces cerevisiae. Purification and characterization. Journal of Biological Chemistry. 269 (15), 10996-11001 (1994).
  14. Ault-Riche, D., Fraley, C. D., Tzeng, C. M., Kornberg, A. Novel assay reveals multiple pathways regulating stress-induced accumulations of inorganic polyphosphate in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 180 (7), 1841-1847 (1998).
  15. Lee, W. D., et al. Simple Silica Column-Based Method to Quantify Inorganic Polyphosphates in Cartilage and Other Tissues. Cartilage. , (2017).
  16. Martin, P., Van Mooy, B. A. Fluorometric quantification of polyphosphate in environmental plankton samples: extraction protocols, matrix effects, and nucleic acid interference. Applied and Environmental Microbiology. 79 (1), 273-281 (2013).
  17. Cremers, C. M., et al. Polyphosphate: A Conserved Modifier of Amyloidogenic Processes. Molecular Cell. 63 (5), 768-780 (2016).
  18. Dahl, J. U., et al. The anti-inflammatory drug mesalamine targets bacterial polyphosphate accumulation. Nature Microbiology. 2, 16267(2017).
  19. Kulaev, I. S., Vagabov, V. M., Kulakovskaya, T. V. Ch. 2. The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. , John Wiley & Sons, Ltd. 15-35 (2004).
  20. Werner, T. P., Amrhein, N., Freimoser, F. M. Novel method for the quantification of inorganic polyphosphate (iPoP) in Saccharomyces cerevisiae shows dependence of iPoP content on the growth phase. Archives of Microbiology. 184 (2), 129-136 (2005).
  21. Aschar-Sobbi, R., et al. High sensitivity, quantitative measurements of polyphosphate using a new DAPI-based approach. Journal of Fluorescence. 18 (5), 859-866 (2008).
  22. Kulakova, A. N., et al. Direct quantification of inorganic polyphosphate in microbial cells using 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Environmental Science and Technology. 45 (18), 7799-7803 (2011).
  23. Kolozsvari, B., Parisi, F., Saiardi, A. Inositol phosphates induce DAPI fluorescence shift. Biochemical Journal. 460 (3), 377-385 (2014).
  24. Christ, J. J., Blank, L. M. Enzymatic quantification and length determination of polyphosphate down to a chain length of two. Analytical Biochemistry. 548, 82-90 (2018).
  25. Ahn, K., Kornberg, A. Polyphosphate kinase from Escherichia coli. Purification and demonstration of a phosphoenzyme intermediate. Journal of Biological Chemistry. 265 (20), 11734-11739 (1990).
  26. Zhu, Y., Lee, S. S., Xu, W. Crystallization and characterization of polyphosphate kinase from Escherichia coli. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 997-1001 (2003).
  27. Smith, S. A., Morrissey, J. H. Sensitive fluorescence detection of polyphosphate in polyacrylamide gels using 4',6-diamidino-2-phenylindol. Electrophoresis. 28 (19), 3461-3465 (2007).
  28. Livermore, T. M., Chubb, J. R., Saiardi, A. Developmental accumulation of inorganic polyphosphate affects germination and energetic metabolism in Dictyostelium discoideum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (4), 996-1001 (2016).
  29. Rudat, A. K., Pokhrel, A., Green, T. J., Gray, M. J. Mutations in Escherichia coli Polyphosphate Kinase That Lead to Dramatically Increased In Vivo Polyphosphate Levels. Journal of Bacteriology. 200 (6), e00697-e00617 (2018).
  30. Smith, S. A., Wang, Y., Morrissey, J. H. DNA ladders can be used to size polyphosphate resolved by polyacrylamide gel electrophoresis. Electrophoresis. , (2018).
  31. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).
  32. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
  33. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
  34. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  35. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
  36. Mu, Q., Tavella, V. J., Luo, X. M. Role of Lactobacillus reuteri in Human Health and Diseases. Frontiers in Microbiology. 9, 757(2018).
  37. Alcantara, C., Blasco, A., Zuniga, M., Monedero, V. Accumulation of polyphosphate in Lactobacillus spp. and its involvement in stress resistance. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1650-1659 (2014).
  38. Kulaev, I. S., Vagabov, V. M., Kulakovskaya, T. V. Ch. 1. The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. , John Wiley & Sons, Ltd. 3-13 (2004).
  39. Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
  40. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
  41. Akiyama, M., Crooke, E., Kornberg, A. The polyphosphate kinase gene of Escherichia coli. Isolation and sequence of the ppk gene and membrane location of the protein. Journal of Biological Chemistry. 267 (31), 22556-22561 (1992).
  42. Akiyama, M., Crooke, E., Kornberg, A. An exopolyphosphatase of Escherichia coli. The enzyme and its ppx gene in a polyphosphate operon. Journal of Biological Chemistry. 268 (1), 633-639 (1993).
  43. Rao, N. N., Liu, S., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate in Escherichia coli: the phosphate regulon and the stringent response. Journal of Bacteriology. 180 (8), 2186-2193 (1998).
  44. van Pijkeren, J. P., Britton, R. A. High efficiency recombineering in lactic acid bacteria. Nucleic Acids Research. 40 (10), e76(2012).
  45. Zhang, H., Ishige, K., Kornberg, A. A polyphosphate kinase (PPK2) widely conserved in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16678-16683 (2002).
  46. Sander, P., Meier, A., Bottger, E. C. rpsL+: a dominant selectable marker for gene replacement in mycobacteria. Molecular Microbiology. 16 (5), 991-1000 (1995).
  47. Hartman, S., Bont, J. A. M. D., et al. The Prokaryotes, a handbook on the biology of bacteria: ecophysiology, isolation, application. Balows, A., et al. , Springer-Verlag. New York, Inc. 1215-1237 (1992).
  48. Winder, F. G., Denneny, J. M. The metabolism of inorganic polyphosphate in mycobacteria. Journal of General Microbiology. 17 (3), 573-585 (1957).
  49. Jankute, M., Cox, J. A., Harrison, J., Besra, G. S. Assembly of the Mycobacterial Cell Wall. Annual Review of Microbiology. 69, 405-423 (2015).
  50. Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
  51. Cogan, E. B., Birrell, G. B., Griffith, O. H. A robotics-based automated assay for inorganic and organic phosphates. Analalytical Biochemistry. 271 (1), 29-35 (1999).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Kwantificering van polyfosfaatextractie met silicamembraanScPPX zuiveringascorbinezuur assaybacterieel polyfosfaateiwitnormalisatiefosfaatdetectiepolyfosfaatextractiepolyfosfaatanalyse

Gerelateerde artikelen