De structuur en de dynamiek van Nucleosomes met behulp van Atomic Force microscopie Imaging sonderen

Summary

Hier presenteren we een protocol karakteriseren nucleosoom deeltjes op het niveau van de single-molecuul met behulp van statische en time-lapse atomaire kracht microscopie (AFM) beeldvormende technieken. De beschreven methode van oppervlakte functionalization zorgt voor de opname van de structuur en de dynamiek van nucleosomes in hoge resolutie op nanoschaal.

Abstract

Chromatine, oftewel een lange keten van nucleosoom subeenheden, is een dynamisch systeem dat voorziet in deze kritieke processen zoals DNA replicatie en transcriptie te nemen plaats in eukaryote cellen. De dynamiek van nucleosomes toegang biedt tot de DNA van replicatie en transcriptie machineries en kritisch bijdraagt aan de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de chromatine functies. Studies van de single-molecuul zoals atomaire kracht microscopie (AFM) imaging hebben aanzienlijk bijgedragen aan ons huidige begrip van de rol van nucleosoom structuur en dynamiek. Het huidige protocol beschrijft de stappen waardoor hoge resolutie beeldvormingstechnieken van de AFM te bestuderen van de structurele en dynamische eigenschappen van nucleosomes. Het protocol wordt geïllustreerd door de AFM gegevens die zijn verkregen voor de nucleosomes van de centromeer waarin H3 Histon wordt vervangen door haar tegenhanger centromeer eiwit een (RETOREN-A). Het protocol begint met de vergadering van mono-nucleosomes met behulp van een methode van continue verdunning. De voorbereiding van het mica substraat met aminopropyl silatrane (APS-mica) die wordt gebruikt voor de beeldvorming nucleosoom matiemaatschappij is van cruciaal belang voor de AFM visualisatie van nucleosomes beschreven en de procedure voor het voorbereiden van het substraat wordt verstrekt. Nucleosomes gestort op het oppervlak van de APS-mica zijn eerste beeld met behulp van statische AFM, die een momentopname van de nucleosoom bevolking vangt. Uit analyses van deze beelden, dergelijke parameters zoals de grootte van DNA gewikkeld rond de nucleosomes kunnen worden gemeten en dit proces is ook gedetailleerd. De time-lapse AFM imaging procedure in de vloeistof wordt beschreven voor de high-speed time-lapse AFM die verschillende frames kan vangen van nucleosoom dynamiek per seconde. Ten slotte is de analyse van de dynamiek van de nucleosoom waardoor de kwantitatieve karakterisering van de dynamische processen beschreven en geïllustreerd.

Introduction

In eukaryote cellen is DNA zeer verkorte en georganiseerd in de chromosomen. ¹ het eerste niveau van de organisatie van het DNA in een chromosoom is de vergadering van de nucleosomes in welke 147 bp van DNA is strak gewikkeld rond een kern van Histon octamer. ^{2 , 3} nucleosoom deeltjes monteren op een lange DNA-molecuul vormen een chromatine-array die wordt dan georganiseerd tot een zeer compact chromosoom eenheid ontstaat. ⁴ de demontage van de chromatine geeft de toegang tot het DNA dat vereist is door kritische cellulaire processen zoals gene transcriptie en ge....

Protocol

1. continu verdunning vergadering van Mono-nucleosomes

1. Genereren en zuiveren van een ongeveer 400 bp DNA substraat dat een af-gecentreerde Widom 601 nucleosoom positionering van de reeks bevat. ⁵⁵
   Opmerking: Als u wilt beperken de ongewenste vorming van di-nucleosomes, elke 'arm' flankerend de positionering volgorde mag niet meer dan ~ 150 bp.
   1. Gebruik van de plasmide pGEM3Z-601 samen met de ontworpen inleidingen en versterken van het substraat-DNA met PCR. Voor de 423 bp substraat met 122 en 154 bp arm lengtes hier gebruikt, gebruik vooruit (5'-CAGTGAATTGTAATACGACTC-3') en omgekeerde (5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3') inleidingen....

Results

Mono-nucleosomes waren eerst voorbereid op AFM imaging experimenten met behulp van een continu verdunning vergadering methode (Figuur 1). De voorbereide nucleosomes werden vervolgens gecontroleerd met behulp van de discontinue SDS-pagina (Figuur 2). Een mica oppervlak werd vervolgens matiemaatschappij met APS, die nucleosomes op het oppervlak vangt met behoud van een goede achtergrond voor hoge resolutie afbeeldingen (Figuur 3). Nuc.......

Discussion

Het protocol dat hierboven beschreven is vrij eenvoudig en bieden zeer reproduceerbare resultaten, hoewel een paar belangrijke kwesties kunnen worden benadrukt. Matiemaatschappij APS-mica is een belangrijk substraat voor het verkrijgen van betrouwbare en reproduceerbare resultaten. Een hoge stabiliteit van APS-mica is een van de belangrijke kenmerken van dit substraat waarmee men het imaging substraat van tevoren gereedmaakt voor gebruik dat kan worden gebruikt ten minste twee weken na voorbereid. ⁵⁹

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid pGEM3Z-601	Addgene, Cambridge, MA	26656
PCR Primers	IDT, Coralville, IA	Custom Order	(FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'
DreamTaq polymerase	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	EP0701	Catalog number for 200 units
PCR purification kit	Qiagen, Hilden, Germany	28104	Catalog number for 50 units
Tris base	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	10708976001	Catalog number for 250 g
EDTA	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	15576028	Catalog number for 500 g
(CENP-A/H4)2, recombinant human	EpiCypher, Durham, NC	16-0010	Catalog number for 50 ug
H2A/H2B, recombinant human	EpiCypher, Durham, NC	15-0311	Catalog number for 50 ug
H3 Octamer, recombinant human	EpiCypher, Durham, NC	16-0001	Catalog number for 50 ug
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Kit, 10K MWCO, 0.1 mL	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	69574	Catalog number for 10 devices
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	S9888-500G	Catalog number for 500 mg
Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters	Millipore-sigma, Burlington, MO	UFC501008	Catalog number for 8 devices
HCl	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	258148-25ML	Catalog number for 25 mL
Tricine	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T0377-25G	Catalog number for 25 g
SDS	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	11667289001	Catalog number for 1 kg
Ammonium Persulfate (AmmPS)	Bio-Rad, Hercules, CA	1610700	Catalog number for 10 g
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1	Bio-Rad, Hercules, CA	1610158	Catalog number for 500 mL
TEMED	Bio-Rad, Hercules, CA	1610800	Catalog number for 5 mL
4x Laemmli protein sample buffer for SDS-PAGE	Bio-Rad, Hercules, CA	1610747	Catalog number for 10 mL
2-ME	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	M6250-10ML	Catalog number for 10 mL
ageRuler Prestained Protein Ladder	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	26616	Catalog number for 500 uL
Bio-Safe™ Coomassie Stain	Bio-Rad, Hercules, CA	1610786	Catalog number for 1 L
Nonwoven cleanroom wipes: TX604 TechniCloth	TexWipe, Kernersvile, NC	TX604
Muscovite Block Mica	AshevilleMica, Newport News, VA	Grade-1
Aminopropyl silatrane (APS)	Synthesized as described in 22
HEPES	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	H4034-25G	Catalog number for 25 g
Scotch Tape	Scotch-3M, St. Paul, MN
TESPA-V2 afm probe (for static imaging)	Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
MSNL-10 afm probe (for standard time-lapse imaing)	Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
Aron Alpha Industrial Krazy Glue	Toagosei America, West Jefferson, OH	AA480	Catalog number for 2 g tube
MgCl2	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	M8266-100G	Catalog number for 100 g
Millex-GP Filter, 0.22 µm	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	SLGP05010	Catalog number for 10 devices
BL-AC10DS-A2 afm probe (for HS-AFM)	Olympus, Japan
Compound FG-3020C-20	FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan
Compound FS-1010S135-0.5	FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan
MultiMode Atomic Force Microscope	Bruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, CA
High-Speed Time-Lapse Atomic Force Microsocopy	Toshio Ando, Nano-Life Science Institute, Kanazawa University, Kakuma-machi, Kanazawa, Japan