Methodenartikel

De structuur en de dynamiek van Nucleosomes met behulp van Atomic Force microscopie Imaging sonderen

DOI:

10.3791/58820

⸱

31 januari 2019

 ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Nebraska Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol karakteriseren nucleosoom deeltjes op het niveau van de single-molecuul met behulp van statische en time-lapse atomaire kracht microscopie (AFM) beeldvormende technieken. De beschreven methode van oppervlakte functionalization zorgt voor de opname van de structuur en de dynamiek van nucleosomes in hoge resolutie op nanoschaal.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chromatine, oftewel een lange keten van nucleosoom subeenheden, is een dynamisch systeem dat voorziet in deze kritieke processen zoals DNA replicatie en transcriptie te nemen plaats in eukaryote cellen. De dynamiek van nucleosomes toegang biedt tot de DNA van replicatie en transcriptie machineries en kritisch bijdraagt aan de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de chromatine functies. Studies van de single-molecuul zoals atomaire kracht microscopie (AFM) imaging hebben aanzienlijk bijgedragen aan ons huidige begrip van de rol van nucleosoom structuur en dynamiek. Het huidige protocol beschrijft de stappen waardoor hoge resolutie beeldvormingstechnieken van de AFM te bestuderen van de structurele en dynamische eigenschappen van nucleosomes. Het protocol wordt geïllustreerd door de AFM gegevens die zijn verkregen voor de nucleosomes van de centromeer waarin H3 Histon wordt vervangen door haar tegenhanger centromeer eiwit een (RETOREN-A). Het protocol begint met de vergadering van mono-nucleosomes met behulp van een methode van continue verdunning. De voorbereiding van het mica substraat met aminopropyl silatrane (APS-mica) die wordt gebruikt voor de beeldvorming nucleosoom matiemaatschappij is van cruciaal belang voor de AFM visualisatie van nucleosomes beschreven en de procedure voor het voorbereiden van het substraat wordt verstrekt. Nucleosomes gestort op het oppervlak van de APS-mica zijn eerste beeld met behulp van statische AFM, die een momentopname van de nucleosoom bevolking vangt. Uit analyses van deze beelden, dergelijke parameters zoals de grootte van DNA gewikkeld rond de nucleosomes kunnen worden gemeten en dit proces is ook gedetailleerd. De time-lapse AFM imaging procedure in de vloeistof wordt beschreven voor de high-speed time-lapse AFM die verschillende frames kan vangen van nucleosoom dynamiek per seconde. Ten slotte is de analyse van de dynamiek van de nucleosoom waardoor de kwantitatieve karakterisering van de dynamische processen beschreven en geïllustreerd.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In eukaryote cellen is DNA zeer verkorte en georganiseerd in de chromosomen. 1 het eerste niveau van de organisatie van het DNA in een chromosoom is de vergadering van de nucleosomes in welke 147 bp van DNA is strak gewikkeld rond een kern van Histon octamer. 2 , 3 nucleosoom deeltjes monteren op een lange DNA-molecuul vormen een chromatine-array die wordt dan georganiseerd tot een zeer compact chromosoom eenheid ontstaat. 4 de demontage van de chromatine geeft de toegang tot het DNA dat vereist is door kritische cellulaire processen zoals gene transcriptie en genoom replicatie, suggereert dat chromatine is een zeer dynamisch systeem gratis. 5 , 6 , 7 inzicht in de dynamische eigenschappen van DNA op verschillende niveaus van de chromatine is uitermate belangrijk voor het ophelderen van genetische processen op moleculair niveau waar fouten tot celdood of de ontwikkeling van ziekten zoals kanker leiden kunnen. 8 is een eigenschap van de chromatine van groot belang is de dynamiek van nucleosomes. 9 , 10 , 11 , 12 de hoge stabiliteit van deze deeltjes is toegestaan voor de karakterisering van het structurele door kristallografische technieken. 2 wat deze studies ontbreken zijn de dynamische details van nucleosomes zoals het mechanisme van DNA uitpakken vanuit de kern van Histon; de dynamische route die is vereist voor replicatie en schrijffouten en andere processen. 7 , 9 , 13 , 14 , 15 , 16 bovendien speciale eiwitten remodelleert factoren genoemd is gebleken om de demontage van nucleosomal deeltjes17; de intrinsieke dynamiek van nucleosomes is echter de kritieke factor in dit proces dat tot het gehele demontage proces bijdraagt. 14 , 16 , 18 , 19

Single-molecuul technieken zoals single-molecuul fluorescentie19,20,21, optische overlapping (pincet)13,18,22,23 en AFM 10 , 14 , 15 , 16 , 24 , 25 , 26 zijn instrumentaal in het begrip van de dynamiek van nucleosomes. Tussen deze methoden, AFM profiteert van diverse unieke en aantrekkelijke functies. AFM maakt het mogelijk om te visualiseren en karakteriseren van individuele nucleosomes evenals de langere matrices27. AFM beelden, kunnen belangrijke kenmerken van nucleosoom structuur zoals de lengte van DNA de Histon kern gewikkeld worden gemeten 10,14,26,28; een parameter die centraal staat in de karakterisering van nucleosoom uitpakken dynamiek. Verleden AFM studies is nucleosomes zeer dynamische systemen en dat DNA spontaan vanuit de kern Histon14 uitpakken kuntgebleken. De spontane uitpakken van DNA van nucleosomes was direct gevisualiseerd door AFM actief zijn in de modus time-lapse wanneer de beeldvorming wordt gedaan in waterige oplossingen 14,26,29.

De komst van de snelle time-lapse instrumentatie van de AFM (HS-AFM) maakte het mogelijk om te visualiseren van het proces nucleosoom uitpakken op de milliseconde tijdschaal 14,15,24. Recente studies van de30 van HS-AFM 16,van centromeer specifieke nucleosomes geopenbaard verschillende nieuwe functies van de nucleosomes vergeleken met het canonieke type. Centromeer nucleosomes vormen van een centromeer, een klein deel van het chromosoom cruciaal voor chromosoom segregatie31. In tegenstelling tot canonieke nucleosomes in bulk chromatine bevat de kern Histon van centromeer nucleosomes RETOREN-A Histon in plaats van Histon H332,33. Als gevolg van deze substitutie Histon, is DNA inwikkeling in centromeer nucleosomes ~ 120 bp in plaats van de 147 ~ bp voor canonieke nucleosomes; een verschil dat tot verschillende morphologies van de centromeer en canonieke nucleosomes leiden kan arrays34, suggereren dat centromeer chromatine ondergaat hogere dynamiek in vergelijking met het grootste deel een. De nieuwe dynamiek weergegeven door centromeer nucleosomes HS-AFM16,30 studies illustreren de unieke kans geboden door de techniek van deze single-molecuul te visualiseren direct de structurele en dynamische eigenschappen van nucleosomes. Voorbeelden van deze functies zal kort worden besproken en geïllustreerd aan het einde van het papier. Deze vooruitgang geboekt als gevolg van de ontwikkeling van nieuwe protocollen voor AFM beeldvorming van nucleosomes, alsmede de wijzigingen van bestaande methoden. Het doel van het protocol hier beschreven is vooruitgang te boeken deze spannende in single-molecuul AFM nucleosoom studies toegankelijk voor iedereen die graag gebruik maken van deze technieken in hun onderzoek van de chromatine. Veel van de beschreven technieken zijn van toepassing op problemen buiten de studie van nucleosomes en kunnen worden gebruikt voor onderzoek van de andere eiwitten en DNA systemen van belang. Een paar voorbeelden van dergelijke toepassingen kunnen worden gevonden in publicaties35,36,,37,38,39,40,41, 42,43,44,45,46,47,48,49 en vooruitzichten van AFM studies verschillende biomoleculaire systemen worden gegeven in29,50,51,53,,54Beoordelingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. continu verdunning vergadering van Mono-nucleosomes

  1. Genereren en zuiveren van een ongeveer 400 bp DNA substraat dat een af-gecentreerde Widom 601 nucleosoom positionering van de reeks bevat. 55
    Opmerking: Als u wilt beperken de ongewenste vorming van di-nucleosomes, elke 'arm' flankerend de positionering volgorde mag niet meer dan ~ 150 bp.
    1. Gebruik van de plasmide pGEM3Z-601 samen met de ontworpen inleidingen en versterken van het substraat-DNA met PCR. Voor de 423 bp substraat met 122 en 154 bp arm lengtes hier gebruikt, gebruik vooruit (5'-CAGTGAATTGTAATACGACTC-3') en omgekeerde (5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3') inleidingen.
    2. Toevoegen met het reactiemengsel aan een thermische cycler buizen voorverwarmd tot 95 ° C. Voer het volgende programma 33 cycli na een initiële denaturatie voor 5 min op 95 ° C: 30 s denaturatie bij 95 ° C, 30 s gloeien bij 49 ° C, 35 s uitbreiding bij 72 ° C. Stel een definitieve verlenging bij 72 ° C gedurende 10 minuten na de 33 cycli.
    3. Het zuiveren van het DNA uit het PCR-mengsel met behulp van een commercieel beschikbare PCR zuivering Kit. Wanneer het DNA uit het PCR Schoonmaakbeurt kolom eluerende, 10 mM Tris buffer (pH 7.5) in plaats van de kit geboden elutie buffer gebruiken
      Opmerking: Neem extra zorg niet over te dragen van de buffers tussen de zuivering stappen. Een besmette eluens kan problemen veroorzaken stroomafwaarts wanneer meting DNA concentratie en/of de startende zoutconcentratie van het mengsel van de vergadering nucleosoom kunt wijzigen.
  2. Bepalen van de concentratie van DNA door het meten van de extinctie van gezuiverde DNA op 260 nm.
    1. Een leeg op de UV-VIS spectrofotometer met behulp van alleen de 10 mM Tris pH 7.5 elutie buffer verzamelen. Een meting van het gezuiverde DNA te verzamelen.
  3. Met de concentratie bepaald, aliquoot 25 pmol van het gezuiverde DNA in een 0,6 mL microfuge buis en breng dit in een vacuüm centrifuge totdat de oplossing nauwelijks zichtbaar is; Dit is meestal 30 min tot 1 h.
    Opmerking: Het DNA substraat is nu klaar voor nucleosoom montage. Anders, het protocol kan hier worden onderbroken en het DNA opgeslagen bij-20 ° C tot gebruik.
  4. Plaats van de microfuge buis met de 25 pmol DNA op het ijs en voeg de nucleosoom montage onderdelen in tabel 1, in de aangegeven volgorde. Wanneer alle onderdelen zijn toegevoegd, verwijderen van het mengsel uit het ijs en Incubeer bij kamertemperatuur (RT) voor 30 min.
    Opmerking: Het is cruciaal dat het zoutgehalte van de buffer voorraad Histon wordt beschouwd wanneer de NaCl berekening die onontbeerlijk is om de uiteindelijke concentratie van 2 M. 15 , 56
  5. Monteer de nucleosomes door het verminderen van de zoutconcentratie van 2 M van het mengsel tot 200 mM met behulp van een continu tarief verdunning. 57
    1. Vul een spuit met 100 µL van verdunning buffer met 10 mM Tris pH 7.5 en plaats deze op een spuitpomp.
    2. Direct de naald van de spuit via een vooraf geperforeerde gat in de dop van de microfuge buis, zorgen voor contact wordt gemaakt met het mengsel van de vergadering (Figuur 1).
    3. Voer de spuitpomp met een snelheid van 0,75 µL/min gedurende 120 minuten.
      Opmerking: De resulterende oplossing voor 100 µL bevat 250 nM nucleosomes en 200 mM NaCl.
    4. Breng het mengsel aan een 10 K MWCO dialyse knop en dialyze tegen 200 mL van een vooraf gekoeld (4 ° C) laag zout buffer met 10 mM Tris pH 7.5, EDTA van 0,25 mM en 2,5 mM NaCl, voor 1 uur bij 4 ° C.
  6. Om te beoordelen de Histon inhoud van de vergadering nucleosoom, bereiden u een discontinue SDS-pagina gel met een 15% scheiden en 6% stapelen als eerder beschreven30.
    1. Aliquot 10-20 µL van de nucleosoom stock aan een microfuge buis en 4 x Laemmli monster Buffer toevoegen aan een werkende concentratie van 1-2 x. 58
    2. Als een besturingselement, herhaal dit preparaat in een aparte microfuge buis voor 1-2 µg de Histon voorraad. Verwarm de monsters bij 95 ° C gedurende ~ 5 min.
    3. Laden van de monsters in aangrenzende rijstroken met elkaar op de gel. Monster buffer aan de ongebruikte rijstroken om zelfs band migratie toevoegen.
    4. De gel op 65 V uitvoeren, totdat de kleurstof voorkant door het stapelen van gel beweegt. Wanneer het scheiden gel is bereikt, oplopen tot 150 V en uitgevoerd totdat de kleurstof voorkant volledig uit de gel is gemigreerd.
    5. Ontmantelen van de Elektroforese van eenheid en de gel zachtjes overbrengen in een kleuring container gevuld met dd H2O. Laat de gel zitten voor 5 min met zachte agitatie. Herhaal dit proces tweemaal meer met verse dd H2O elke keer gebruikt.
      Opmerking: De Coomassie vlek gebruikt in dit protocol vereist niet de typische fixing stappen die nodig zijn voor Coomassie vlekken (Zie Tabel van materialen). Als een ander Coomassie preparaat wordt gebruikt, wijzig de fixing stappen waar nodig.
    6. Het water uit de laatste spoeling verwijderen en toevoegen van net genoeg vlek ter dekking van de gel. Laat de gel zitten met zachte agitatie voor ten minste 1 uur.
      Opmerking: Voor de agitatie, de kleuring container kan geplaatst worden op elk toestel dat bevordert de beweging van de vlek over de gel terwijl ook de gel gedekt in vloeistof.
    7. Verwijderen van de vlek uit de container en spoel de gel met dd H2O. vervangen de dd H2O en geniet van de gel voor 30 min met zachte agitatie. (De gel moet worden weergegeven als dat aangegeven in Figuur 2, met duidelijke scheiding van de bands Histon.)
  7. De nucleosomes bij 4 ° C bewaren tot gebruik.
    Opmerking: Wanneer opgeslagen in deze voorwaarden, nucleosomes stabiel blijven voor enkele maanden. Het protocol kan hier worden gepauzeerd.

2. functionalization van Mica oppervlak voor statische AFM beeldvorming van Nucleosomes

  1. Een 50 mM 1-(3-Aminopropyl) silatrane APS stamoplossing in gedeïoniseerd water bereiden zoals beschreven. 30 winkel 1 mL aliquots van deze oplossing bij 4 ° C tot gebruik.
    Opmerking: De aliquots kunnen worden opgeslagen voor meer dan een jaar bij 4 ° C. 59
  2. Een werkoplossing APS 1:300 voorbereiden op mica wijziging door het oplossen van 50 µL van de 50 mM APS voorraad in 15 mL dd H2O.
    Opmerking: Deze werkoplossing kan worden opgeslagen op kamertemperatuur voor meerdere dagen.
  3. Snijd stroken van 1 x 3 cm breed van mica van hoge kwaliteit mica bladen (Zie Tabel van materialen voor mica hier gebruikt).
    1. Controleer of het stuk past wanneer diagonaal in een cuvet geplaatst. Hiermee kunt u dat het topje van scherp pincet, een scheermesje of plakband, klieven lagen van het mica totdat zowel zijden zijn vers gekloofd en het stuk zo dun als ~0.1 mm (figuur 3A is). Onmiddellijk plaats van het mica stuk in de APS gevuld cuvette en incubeer gedurende 30 min (figuur 3B).
  4. Het stuk mica overbrengen in een cuvet gevuld met dd H2O en weken voor 30 s (Figuur 3 c). Volledig droog beide zijden van de APS-mica strip onder een stroom van argon.
    Opmerking: Een nonwoven cellulose en polyester cleanroom wipe (aanbevolen wipe gedetailleerde in materialen) kunnen worden gebruikt als hulpmiddel bij het water vanaf de rand van het mica wicking bij het drogen.
  5. Gebruik de droge mica strip is nu voor de bereiding van de monsters. Anders slaat het stuk in een schone, droge cuvette (figuur 3D).
    Opmerking: Extra opslagruimte in een vacuüm voor 1-2 h wordt aanbevolen wanneer het milieu vochtig. Het protocol kan hier worden gepauzeerd.

3. bereiding van nucleosoom monsters op APS-Mica statische AFM Imaging

  1. Dubbele plakband van toepassing op verschillende magnetische pucks en plaats ze naar de kant.
  2. Snijd het APS-mica substraat naar het gewenste formaat (1 x 1 cm vierkantjes voor de MM AFM instrument gebruikt hier). Plaats deze stukken in een schone petrischaal en overdekte droog.
  3. Maak drie verdunningen van het geassembleerde nucleosomes (laatste nucleosoom concentraties van 0,5, 1,0 en 2,0 nM) met behulp van een 0,22 µm gefilterd buffer met 10 mM HEPES pH 7.5 en 4 mM MgCl2.
    Opmerking: Als u wilt beperken het verlies van nucleosomes bij de lage eindconcentratie, de verdunningen moeten gebeuren tegelijkertijd, onmiddellijk voorafgaand aan de depositie op de APS-mica.
  4. 5-10 µL van het monster van de verdunde nucleosoom stort in het midden van de APS-mica stuk, en laat Incubeer gedurende twee minuten. Spoel zachtjes het monster met 2-3 mL dd H2O om alle onderdelen van de buffer te verwijderen. Na elke ~0.5 mL dd H2O gebruikt, schud zachtjes de mica om te verwijderen van de overtollige spoelwater.
    Opmerking: Een wegwerp injectiespuit wordt aanbevolen voor deze spoeldouche stap.
  5. Droog de gedeponeerde steekproef onder een lichte stroom van schone argon gas.
    Opmerking: Het monster is nu klaar om de image worden gemaakt of kan worden opgeslagen in een vacuüm kabinet of exsiccator gevuld met argon. Monsters voorbereid en opgeslagen zoals beschreven hebben zijn beeld één jaar na voorbereiding zonder verlies van kwaliteit. Het protocol kan hier worden gepauzeerd.

4. statische AFM beeldvorming van Nucleosomes

  1. Monteren van een tip van de AFM op de houder van de tip. Een tip die een constante van de lente van ~ 40 N/m en een resonantiefrequentie tussen 300 en 340 kHz heeft gebruikt (Zie de Tabel van materialen voor de uitkragingen hier gebruikt).
  2. Monteer het monster dat is bereid in sectie 3 op het podium van de AFM dat evenwel niet tot het contact met het oppervlak van de steekproef.
  3. Plaatst u de laser op de uitkraging totdat het totaal maximaal is en de verticale en laterale doorbuiging waarden in de buurt van nul aan te passen.
  4. Afstemmen van de sonde van de AFM te vinden zijn resonantiefrequentie en aanpassen van de amplitude van de schijf en de grootte van de afbeelding ingesteld op 100 x 100 nm. Klik op de engage knop om te beginnen met de aanpak.
  5. Zodra naderde, geleidelijk optimaliseren de Amplitude Setpoint totdat het oppervlak van het monster wordt duidelijk gezien. Het verhogen van de grootte van de scan van 1 x 1 µm en de resolutie van 512 x 512 pixels. Klik op de capture knop gevolgd door de engage knop om te beginnen Beeldacquisitie.
    Opmerking: De afbeeldingen in Figuur 4 tonen de soepele achtergrond die kan worden verwacht wanneer imaging van deze monsters.
  6. Open de opgeslagen beelden met behulp van de software van de analyse van de instrumenten van AFM voor het analyseren van het monster nucleosoom.
    1. Plat de afbeelding met behulp van een polynomiale lijn aftrekken of een soortgelijke functie.
    2. De kleurentabel aan de laagste waarde voor de minimum en maximum de hoogste waarde instellen Een register bijhouden van deze waarden voor elke afbeelding als ze nodig zullen zijn in een latere stap.
      Opmerking: Als deze waarden niet gewend bent, hoogte gegevens worden onjuist in de latere analyse zoals dwarsdoorsneden van nucleosoom kernen als plateaus van gelijk, in plaats van verschillende hoogte verschijnen zal.
    3. Exporteer de afbeelding als een TIFF-afbeelding in de oorspronkelijke grootte. -Selecteer de gewenste opties om op te slaan van de afbeelding met een rand of schaal bars.
    4. Open de afbeelding in analysesoftware staat voor de lengte van omtrek metingen.
    5. Stel de x-, y- en z schalen waarop de afbeelding worden afgestemd.
    6. Als een binnenlengte kalibratie, meten en registreren van de contour lengte van gratis DNA van het ene eind naar het andere. Voor deze kalibratiefactor, gebruikt u de metingen voor het genereren van een histogram en passen met een normale (Gauss) verdeling. Verdeel het piek-center (x-c) door de lengte van het substraat in basenparen.
      Opmerking: Deze waarde is de afbeelding specifieke omrekeningsfactor van nanometer voor base paren van DNA.
    7. Meten en registreren van de contour lengte van beide armen voor elke nucleosoom uit het vrije uiteinde van de arm naar het midden van de kern, voor samenhang (figuur 5A).
    8. Voor elke kern nucleosoom, verzamelen twee volledige breedte op halve maximumwaarden (FWHM) van een loodrechte pair voor core doorsnede metingen (figuur 5B gemiddelde van de twee metingen van de FWHM en de helft van de resulterende waarde van elke geleding nucleosoom aftrekken correct is voor de gemeten lengte vanaf de afslag/entry DNA naar het midden van de kern die is niet deel van de lengte van de arm.
    9. Verdeel elke arm lengte door de berekende kalibratiefactor (stap 4.5.6) te verkrijgen van arm lengtes in DNA-basenparen.
    10. Bereken de hoeveelheid DNA verpakken door af te trekken de nucleosoom arm som van de totale basenpaar lengte van het onverpakt substraat. Deze waarden worden uitgezet als een histogram en passen de piek(en) met een normale (Gauss) verdeling te verkrijgen van de gemiddelde verpakt basenparen van DNA voor de nucleosoom bevolking.
    11. Bereken de gemiddelde nucleosoom hoogte van de gemeten doorsneden. Dit plot als een histogram en passen de piek(en) met een normale (Gauss) verdeling te verkrijgen van de hoogte van de nucleosoom bevolking.

5. time-Lapse AFM beeldvorming van nucleosoom Dynamics

  1. Monteer de tip van de AFM op de houder van de tip. Een sonde met een lente-constante van ongeveer 0.1 N/m en een resonantiefrequentie van 7-10 kHz kan worden gebruikt (Zie de lijst van de materialen voor de uitkragingen hier gebruikt).
  2. Een stuk van 1 x 1 cm van de APS-mica hechten aan een magnetische puck met behulp van dubbel-stick tape en bevestig de puck op het instrument van de AFM.
  3. Verdun de nucleosomes tot een 1 nM concentratie in een gefilterde imaging buffer met 10 mM HEPES pH 7.5 en 4 mM MgCl20,22 µm.
  4. Kluisje 5-10 µL van de verdunde nucleosoom in het midden van het mica stuk voor 2 min. spoelen de gedeponeerde monster met 20µL van de imaging buffer twee keer. Na de tweede spoel, houden een druppel van imaging buffer op het oppervlak.
  5. Gebruik van de camera bovenaanzicht om te vinden de tip en de benadering van het oppervlak handmatig tot de tip ~ 100-500 is µm van het oppervlak.
  6. Het toevoegen van extra imaging buffer om het gat tussen de tip en de oppervlakte te vullen. In dit voorbeeld is ongeveer 50 µL van imaging buffer is voldoende om het gat te vullen. Vind een resonantie piek voor naar de wenk.
  7. Begin de computer-gestuurde benadering naar de oppervlakte. Toen naderde, beginnen beeldbewerking met een 1-2 µm gebied Selecteer een ~ 500 nm interessegebied. Met dit interessegebied geselecteerd, passen de overname Gegevensdensiteit op 512 x 512 pixels.
  8. Instelpunt kruisspanning en rijden amplitude parameters om beeldkwaliteit te verbeteren. Een gratis amplitude van 10 nm of minder en een scanfrequentie van ~ 2 Hz kan worden gebruikt om kwaliteitsbeelden te vangen. Een voorbeeld van nucleosoom dynamiek gevangen met behulp van time-lapse AFM is weergegeven in Figuur 6.

6. Hogesnelheidstrein Time-Lapse AFM beeldvorming van nucleosoom Dynamics

Opmerking: De onderstaande protocol is bedoeld voor het instrument van de HS-AFM ontwikkeld door de groep van Ando (Kanazawa Universiteit, Kanazawa, Japan). 60

  1. APS-mica voorbereiden op vloeibare imaging.
    1. Het glazen staafje hechten aan de AFM scanner podium met het glazen staafje - scanner lijm (Zie Tabel van materialen). Laat deze droog voor een minimum van 10 min.
    2. Maken ~0.1 mm dikke circulaire stukken van mica met een diameter van 1,5 mm door ponsen hen van een grotere mica blad. De HS-AFM mica glas rod lijm gebruiken (Zie Tabel van materialen) dit mica stuk hechten aan het glazen staafje op de HS-AFM en droog, ongerepte voor een minimum van 10 minuten. Klieven lagen met behulp van een drukgevoelige tape totdat een goed gekloofd laag te op de tape zien is.
    3. Verdunnen 1 µL van 50 mM APS voorraad in 99 µL van dd H2O om een 500 µM APS oplossing te maken. Stort 2.5 µL van deze oplossing op het oppervlak van de vers gekloofd mica en laat gedurende 30 minuten functionalize.
      Opmerking: Om te voorkomen dat tijdens het functionalizing van het oppervlak drogen, de dop van een tube van 50 mL conische centrifuge kunt passen met een vochtige filterpapier stuk en geplaatst over de scanner. De APS-voorraad wordt verdund 3 keer minder voor vloeibare imaging dan voor statische denkbaar om te controleren de dynamiek naar een wisselkoers die kan worden waargenomen bij AFM.
    4. Spoel de mica met 20 µL van dd H2O door het toepassen van verschillende ~ 3 µL gespoeld. Verwijder water volledig na elke spoeling door het plaatsen van een nonwoven veeg aan de rand van het mica. Na de laatste spoeling, ~ 3 µL van dd H2O plaats op het oppervlak en laat het zitten voor een minimum van 5 min te verwijderen elke nonspecifically afhankelijke APS.
  2. Plaats van de sonde in de HS-AFM houder en plaats de houder in het werkgebied van de AFM met het topje naar boven. Spoel de houder met behulp van ~ 100 µL van dd H2O gevolgd door twee ~ 100 µL gespoeld van 0,22 µm gefilterd nucleosomes imaging buffer die bevat 10 mM HEPES pH 7.5 en 4 mM MgCl2.
  3. Met de spoelen gedaan, door de kamer te vullen met ~ 100 µL van nucleosoom imaging buffer, dompelen de tip. Pas de ' Freischwinger '-positie totdat het wordt geraakt met de laser. Spoel de APS-mica met 20 µL van gefilterde nucleosoom imaging buffer, met behulp van ~ 4 µL per spoeling.
  4. 1 µL van de voorraad van de vergadering nucleosoom verdund in 250 µL van gefilterde nucleosoom imaging buffer voor een definitieve nucleosoom concentratie van 1 nM. 2.5 µL met deze tweevoudige verdunning storten op het oppervlak en laat het zitten voor 2 min. Spoel het oppervlak met ~ 4 µL van nucleosoom imaging buffer twee keer. Na de laatste spoeling, laat het oppervlak bedekt met imaging buffer.
    Opmerking: Als het oppervlak is niet gespoeld na neerlegging van het monster nucleosoom, het oppervlak zal snel worden overvol.
  5. De scanner en het monster op de top van de houder van de tip zo ingesteld dat het monster gezicht naar beneden. Om te beginnen met de aanpak, de functie auto-aanpak met een instelpunt amplitude, As dicht bij de gratis oscillation amplitude A0.
    Opmerking: Idealiter eens = 0.95 een0, maar op 82% van een0 werkt zo goed als voorzichtig.
  6. Pas de instelpunt totdat het oppervlak wordt goed bijgehouden.
    Opmerking: Om te minimaliseren van de overdracht van energie van de AFM tip aan het monster nucleosoom, de amplitude van de uitkraging moet worden klein gehouden, met amplitudes zo laag als 1 nm optimaal.
  7. Instellen van het afbeeldingsgebied ongeveer 150 x 150 nm tot 200 x 200 nm met overname gegevenssnelheid van ~ 300 ms per frame imaging.
    Opmerking: De grootte van deze afbeelding is meestal voldoende om vast te leggen van de dynamiek van verschillende nucleosomes tegelijk. Een minder bevolkte oppervlak kan verzoeken om wijzigingen van deze parameters. De voorgestelde framesnelheid volstaat om vast te leggen nucleosoom dynamiek zoals looping, glij- en uitpakken, o.a. (Zie vertegenwoordiger resultaten sectie hieronder).

7. analyse van nucleosoom Dynamics gevangen met behulp van Time-Lapse AFM

  1. Omzetten in de beelden van het gegevenstype van de HS AFM (ASD) TIFF-afbeeldingen.
    1. De beelden met behulp van het systeem van de AFM analysesoftware ofwel vlak of lijn functies gebruiken totdat de achtergrond uniform contrast is afvlakken.
    2. Het afbeeldingscontrast (kleurenschaal) ingesteld op automatisch.
      Opmerking: Het contrast kan handmatig worden aangepast voor presentatiedoeleinden maar niet voor analyse. Hierdoor hoogte detail verloren in de geconverteerde afbeeldingen.
    3. Het geselecteerde bereik van beelden als een MOV-bestand opslaan. Hef de selectie van de bar van de schaal en de grenzen van de opties voor opslaan.
      OPMERKINGEN: Doe niet analyse van beelden die schaal bars in het frame hebben. Deze de grootte van de afbeelding veranderen en zal resulteren in onjuiste metingen.
    4. Het MOV-bestand converteren naar TIFF-afbeeldingen met behulp van een geschikte software (Zie Tabel van materialen). Gebruik de dezelfde framesnelheid voor conversie als werd gebruikt bij het maken van het MOV-bestand.
  2. Openen de beelden in een staat van deze meting meting-software voor arm lengte omtrek metingen, type (Zie Tabel van materialen).
    1. Instellen van de afmetingen van de afbeelding naar overeenkomen met die waarin het was gevangen.
    2. Meet de omtrek lengte voor elke nucleosoom arm vanaf het einde van de arm naar het midden van de nucleosoom kern en de metingen opnemen in een werkblad (figuur 4A).
    3. Meet de lengte van het onverpakt substraat van het DNA in de frames na een nucleosoom unwraps. Gebruik dit voor een specifieke kalibratie van de film van de nm/bp-verhouding die wordt gebruikt voor nucleosoom inwikkeling van berekeningen
    4. Twee dwarsdoorsnede profielen voor de nucleosoom kern en twee voor de blote DNA (figuur 4B) verzamelen.
    5. De dwarsdoorsnede profielen importeren naar een spreadsheet-software en normaliseren van de percelen door de laagste waarde van de z van alle punten in het profiel af te trekken.
    6. Bereken de hoogte en de volle breedte op halve maximum (FWHM) voor elke doorsnede en de gemiddelden van de twee profielen voor elk frame.
  3. Aftrekken van de helft van de waarde van de FWHM van elk van de nucleosoom armen zijn perceel als een scatterplot samen met de berekende som van de armen.
    1. Bereken de lengte van de gemiddelde omtrek vanaf de DNA-metingen gemaakt voor het DNA in frames na de nucleosoom uitgepakt.
    2. De kalibratiefactor nm/bp bepalen door de gemiddelde omtrek lengte van de gratis DNA door de basenpaar lengte van het DNA-substraat te verdelen. Gebruik deze waarde te berekenen nucleosoom inwikkeling in elk frame, zoals beschreven in paragraaf 5.12.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mono-nucleosomes waren eerst voorbereid op AFM imaging experimenten met behulp van een continu verdunning vergadering methode (Figuur 1). De voorbereide nucleosomes werden vervolgens gecontroleerd met behulp van de discontinue SDS-pagina (Figuur 2). Een mica oppervlak werd vervolgens matiemaatschappij met APS, die nucleosomes op het oppervlak vangt met behoud van een goede achtergrond voor hoge resolutie afbeeldingen (Figuur 3). Nuc...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol dat hierboven beschreven is vrij eenvoudig en bieden zeer reproduceerbare resultaten, hoewel een paar belangrijke kwesties kunnen worden benadrukt. Matiemaatschappij APS-mica is een belangrijk substraat voor het verkrijgen van betrouwbare en reproduceerbare resultaten. Een hoge stabiliteit van APS-mica is een van de belangrijke kenmerken van dit substraat waarmee men het imaging substraat van tevoren gereedmaakt voor gebruik dat kan worden gebruikt ten minste twee weken na voorbereid. 59

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Auteur bijdragen: YLL en MSD ontworpen het project; MSD gemonteerd nucleosomes. MSD en ZS uitgevoerd AFM experimenten en data analyses. Alle auteurs schreef en het manuscript bewerkt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Plasmid pGEM3Z-601Addgene, Cambridge, MA26656
PCR PrimersIDT, Coralville, IACustom Order(FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'
DreamTaq polymeraseThermoFischer Scientific, Waltham, MAEP0701Catalognummer voor 200 eenheden
PCR zuiveringskitQiagen, Hilden, Duitsland 28104Catalognummer voor 50 eenheden
Tris baseSigma-Aldrich, St. Louis, MO10708976001Catalognummer voor 250 g
EDTAThermoFischer Scientific, Waltham, MA15576028Catalognummer voor 500 g
(CENP-A/H4)2, recombinant humaanEpiCypher, Durham, NC16-0010Catalognummer voor 50 ug
H2A/H2B, recombinant humaanEpiCypher, Durham, NC15-0311Catalognummer voor 50 ug
H3 Octamer, recombinant humaanEpiCypher, Durham, NC16-0001Catalognummer voor 50 ug
Slide-A-Lyzer MINI dialyseapparaat, 10K MWCO, 0,1 mLThermoFischer Scientific, Waltham, MA69574Catalognummer voor 10 apparaten
NatriumchlorideSigma-Aldrich, St. Louis, MOS9888-500GCatalognummer voor 500 mg
Amicon Ultra-0,5 mL centrifugaalfilters Millipore-sigma, Burlington, MOUFC501008Catalognummer voor 8 apparaten
HClSigma-Aldrich, St. Louis, MO258148-25MLCatalognummer voor 25 mL
TricineSigma-Aldrich, St. Louis, MOT0377-25GCatalognummer voor 25 g
SDSSigma-Aldrich, St. Louis, MO11667289001Catalognummer voor 1 kg
Ammoniumpersulfaat (AmmPS) Bio-Rad, Hercules, CA1610700Catalognummer voor 10 g
30% Acrylamide/Bis-oplossing, 37,5:1Bio-Rad, Hercules, CA1610158Catalognummer voor 500 mL
TEMEDBio-Rad, Hercules, CA1610800Catalognummer voor 5 mL
4x Laemmli-eiwitmonsterbuffer voor SDS-PAGEBio-Rad, Hercules, CA1610747Catalognummer voor 10 mL
2-MESigma-Aldrich, St. Louis, MOM6250-10MLCatalognummer voor 10 mL
ageRuler vooraf gekleurde eiwitladder ThermoFischer Scientific, Waltham, MA26616Catalognummer voor 500 uL
Bio-Safe™ Coomassie-kleuringBio-Rad, Hercules, CA1610786Catalognummer voor 1 L
Niet-geweven schone ruimtedoekjes: TX604 TechniCloth TexWipe, Kernersvile, NCTX604
Muscoviete Blok MicaAshevilleMica, Newport News, VAGrade-1
Aminopropyl silatrane (APS)Gesynthetiseerd zoals beschreven in 22
HEPESSigma-Aldrich, St. Louis, MOH4034-25GCatalognummer voor 25 g
Scotch TapeScotch-3M, St. Paul, MN
TESPA-V2 afm-sonde (voor statische beeldvorming)Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
MSNL-10 afm-sonde (voor standaard tijdsverloop beeldvorming)Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
Aron Alpha Industrial Krazy GlueToagosei America, West Jefferson, OHAA480Catalognummer voor 2 g tube
MgCl2Sigma-Aldrich, St. Louis, MOM8266-100GCatalognummer voor 100 g
Millex-GP-filter, 0,22 µmSigma-Aldrich, St. Louis, MOSLGP05010Catalognummer voor 10 apparaten
BL-AC10DS-A2 afm-sonde (voor HS-AFM)Olympus, Japan
Compound FG-3020C-20 FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan 
Compound FS-1010S135-0,5 FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan 
MultiMode Atomic Force MicroscopeBruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, CA
High-Speed Time-Lapse Atomic Force MicrosocopyToshio Ando, Nano-Life Science Institute, Kanazawa University, Kakuma-machi, Kanazawa, Japan

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
  2. Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  3. Clark, D. J. Nucleosome Positioning, Nucleosome Spacing and the Nucleosome Code. Journal of biomolecular structure. 27 (6), 781-793 (2010).
  4. Poirier, M. G., Oh, E., Tims, H. S., Widom, J. Dynamics and function of compact nucleosome arrays. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (9), 938-944 (2009).
  5. Li, B., Carey, M., Workman, J. L. The Role of Chromatin during Transcription. Cell. 128 (4), 707-719 (2007).
  6. Venkatesh, S., Workman, J. L. Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 178(2015).
  7. Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).
  8. Adam, S., Polo, S. ophieE., Almouzni, G. Transcription Recovery after DNA Damage Requires Chromatin Priming by the H3.3 Histone Chaperone HIRA. Cell. 155 (1), 94-106 (2013).
  9. Ahmad, K., Henikoff, S. Epigenetic Consequences of Nucleosome Dynamics. Cell. 111 (3), 281-284 (2002).
  10. Filenko, N. A., Palets, D. B., Lyubchenko, Y. L. Structure and dynamics of dinucleosomes assessed by atomic force microscopy. Journal of amino acids. 2012, 650840(2012).
  11. Hihara, S., et al. Local nucleosome dynamics facilitate chromatin accessibility in living mammalian cells. Cell reports. 2 (6), 1645-1656 (2012).
  12. Jiang, C., Pugh, B. F. Nucleosome positioning and gene regulation: advances through genomics. Nature reviews. Genetics. 10 (3), 161-172 (2009).
  13. Brennan, L. D., Forties, R. A., Patel, S. S., Wang, M. D. DNA looping mediates nucleosome transfer. Nature Communications. 7, https://www.nature.com/articles/ncomms13337 - supplementary-information 13337(2016).
  14. Lyubchenko, Y. L. Nanoscale nucleosome dynamics assessed with time-lapse AFM. Biophysical Reviews. 6 (2), 181-190 (2014).
  15. Miyagi, A., Ando, T., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of nucleosomes assessed with time-lapse high-speed atomic force microscopy. Biochemistry. 50 (37), 7901-7908 (2011).
  16. Stumme-Diers, M. P., Banerjee, S., Hashemi, M., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L. Nanoscale dynamics of centromere nucleosomes and the critical roles of CENP-A. Nucleic Acids Research. 46 (1), 94-103 (2018).
  17. Narlikar, G. eetaJ., Sundaramoorthy, R., Owen-Hughes, T. Mechanisms and Functions of ATP-Dependent Chromatin-Remodeling Enzymes. Cell. 154 (3), 490-503 (2013).
  18. Ngo, T. T., Zhang, Q., Zhou, R., Yodh, J. G., Ha, T. Asymmetric Unwrapping of Nucleosomes under Tension Directed by DNA Local Flexibility. Cell. 160 (6), 1135-1144 (2015).
  19. Ruth, B., Wietske, K., Kirsten, M., John van, N. spFRET reveals changes in nucleosome breathing by neighboring nucleosomes. Journal of Physics: Condensed Matter. 27 (6), 064103(2015).
  20. Buning, R., van Noort, J. Single-pair FRET experiments on nucleosome conformational dynamics. Biochimie. 92 (12), 1729-1740 (2010).
  21. Koopmans, W. J. A., Brehm, A., Logie, C., Schmidt, T., van Noort, J. Single-Pair FRET Microscopy Reveals Mononucleosome Dynamics. Journal of Fluorescence. 17 (6), 785-795 (2007).
  22. Brower-Toland, B. D., et al. Mechanical disruption of individual nucleosomes reveals a reversible multistage release of DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (4), 1960(1960).
  23. Bennink, M. L., et al. Unfolding individual nucleosomes by stretching single chromatin fibers with optical tweezers. Nature Structural Biology. 8 (7), 606-610 (2001).
  24. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Chromatin Protocols. Chellappan, S. P. , Springer New York. 27-42 (2015).
  25. Menshikova, I., Menshikov, E., Filenko, N., Lyubchenko, Y. L. Nucleosomes structure and dynamics: effect of CHAPS. International Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 2, 2129-2137 (2011).
  26. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of nucleosomes revealed by time-lapse atomic force microscopy. Biochemistry. 48 (33), 7842-7848 (2009).
  27. Yodh, J. G., Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Woodbury, N., Lohr, D. Evidence for nonrandom behavior in 208-12 subsaturated nucleosomal array populations analyzed by AFM. Biochemistry. 38 (48), 15756-15763 (1999).
  28. Filenko, N. A., et al. The role of histone H4 biotinylation in the structure of nucleosomes. PLoS One. 6 (1), e16299(2011).
  29. Lyubchenko, Y. L. Encyclopedia of Analytical Chemistry. Meyers, R. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester. 1-24 (2013).
  30. Stumme-Diers, M. P., Banerjee, S., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L. Nanoscale Imaging: Methods and Protocols. Lyubchenko, Y. L. , Springer. New York. 225-242 (2018).
  31. Cleveland, D. W., Mao, Y., Sullivan, K. F. Centromeres and Kinetochores. Cell. 112 (4), 407-421 (2003).
  32. Rosin, L. F., Mellone, B. G. Centromeres Drive a Hard Bargain. Trends in Genetics. 33 (2), 101-117 (2017).
  33. McKinley, K. L., Cheeseman, I. M. The molecular basis for centromere identity and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (1), 16-29 (2016).
  34. Lyubchenko, Y. L. Centromere chromatin: a loose grip on the nucleosome. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 8(2014).
  35. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Visualization of supercoiled DNA with atomic force microscopy in situ. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (2), 496-501 (1997).
  36. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Aki, T., Adhya, S. Atomic force microscopic demonstration of DNA looping by GalR and HU. Nucleic Acids Research. 25 (4), 873-876 (1997).
  37. Herbert, A., et al. The Zalpha domain from human ADAR1 binds to the Z-DNA conformer of many different sequences. Nucleic acids research. 26 (15), 3486-3493 (1998).
  38. Oussatcheva, E. A., et al. Structure of branched DNA molecules: gel retardation and atomic force microscopy studies. Journal of Molecular Biology. 292 (1), 75-86 (1999).
  39. Gaillard, C., Shlyakhtenko, L. S., Lyubchenko, Y. L., Strauss, F. Structural analysis of hemicatenated DNA loops. BMC Struct Biol. 2 (1), 7(2002).
  40. Potaman, V. N., et al. Unpaired structures in SCA10 (ATTCT)n.(AGAAT)n repeats. Journal of Molecular Biology. 326 (4), 1095-1111 (2003).
  41. Virnik, K., et al. "Antiparallel" DNA loop in gal repressosome visualized by atomic force microscopy. Journal of Molecular Biology. 334 (1), 53-63 (2003).
  42. Pavlicek, J. W., et al. Supercoiling-induced DNA bending. Biochemistry. 43 (33), 10664-10668 (2004).
  43. Karymov, M., Daniel, D., Sankey, O. F., Lyubchenko, Y. L. Holliday junction dynamics and branch migration: single-molecule analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (23), 8186-8191 (2005).
  44. Shlyakhtenko, L. S., et al. Nanoscale structure and dynamics of ABOBEC3G complexes with single-stranded DNA. Biochemistry. 51 (32), 6432-6440 (2012).
  45. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Miyagi, A., Lyubchenko, Y. L. Specificity of binding of single-stranded DNA-binding protein to its target. Biochemistry. 51 (7), 1500-1509 (2012).
  46. Shlyakhtenko, L. S., et al. APOBEC3G Interacts with ssDNA by Two Modes: AFM Studies. Scientific Reports. 5, 15648(2015).
  47. Sun, Z., Tan, H. Y., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Remodeling of RecG Helicase at the DNA Replication Fork by SSB Protein. Scientific Reports. 5, 9625(2015).
  48. Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. SSB and the RecG DNA helicase: An intimate association to rescue a stalled replication fork. Protein Science. 26 (4), 638-649 (2017).
  49. Zhang, Y., et al. High-speed atomic force microscopy reveals structural dynamics of alpha-synuclein monomers and dimers. Journal of Chemical Physics. 148 (12), 123322(2018).
  50. Lyubchenko, Y. L. DNA structure and dynamics: an atomic force microscopy study. Cell Biochem Biophys. 41 (1), 75-98 (2004).
  51. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. AFM for analysis of structure and dynamics of DNA and protein-DNA complexes. Methods. 47 (3), 206-213 (2009).
  52. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Gall, A. A. Atomic force microscopy imaging and probing of DNA, proteins, and protein DNA complexes: silatrane surface chemistry. Methods in Molecular Biology. 543, 337-351 (2009).
  53. Lyubchenko, Y. L. Nanoimaging methods for biomedicine. Methods. 60 (2), 111-112 (2013).
  54. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Imaging of DNA and Protein-DNA Complexes with Atomic Force Microscopy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 26 (1), 63-96 (2016).
  55. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
  56. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Ando, T. Imaging of nucleic acids with atomic force microscopy. Methods (San Diego, Calif). 54 (2), 274-283 (2011).
  57. Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones. Methods in enzymology. 304, 3-19 (1999).
  58. Gallagher, S. R. One-dimensional SDS gel electrophoresis of proteins. Current protocols in immunology. , Chapter 8 Unit 8.4 (2006).
  59. Shlyakhtenko, L. S., Gall, A. A., Lyubchenko, Y. L. Cell Imaging Techniques: Methods and Protocols. Taatjes, D. J., Roth, J. , Humana Press. 295-312 (2013).
  60. Uchihashi, T., Ando, T. Atomic Force Microscopy in Biomedical Research: Methods and Protocols. Braga, P. C., Ricci, D. , Humana Press. 285-300 (2011).
  61. Lyubchenko, Y. L., Gall, A. A., Shlyakhtenko, L. S. Visualization of DNA and protein-DNA complexes with atomic force microscopy. Methods in molecular biology. 1117, 367-384 (2014).
  62. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Proceeding of the Fourth International Workshop: STM-AFM-SNOM: New Nanotools for Molecular Biology. , Foundation Fourmentin-Guilbert. 20-34 (1997).
  63. Kato, M., et al. Interarm interaction of DNA cruciform forming at a short inverted repeat sequence. Biophys J. 85 (1), 402-408 (2003).
  64. Yodh, J. G., Woodbury, N., Shlyakhtenko, L. S., Lyubchenko, Y. L., Lohr, D. Mapping nucleosome locations on the 208-12 by AFM provides clear evidence for cooperativity in array occupation. Biochemistry. 41 (11), 3565-3574 (2002).
  65. Lyubchenko, Y. L., Gall, A. A., Shlyakhtenko, L. S. Atomic force microscopy of DNA and protein-DNA complexes using functionalized mica substrates. DNA-Protein Interactions: Principles and Protocols. , 569-578 (2001).
  66. Lyubchenko, Y. L. Preparation of DNA and nucleoprotein samples for AFM imaging. Micron. 42 (2), 196-206 (2011).
  67. Gilmore, J. L., et al. Single-molecule dynamics of the DNA-EcoRII protein complexes revealed with high-speed atomic force microscopy. Biochemistry. 48 (44), 10492-10498 (2009).
  68. Shlyakhtenko, L. S., et al. Molecular mechanism underlying RAG1/RAG2 synaptic complex formation. J Biol Chem. 284 (31), 20956-20965 (2009).
  69. Suzuki, Y., et al. Visual Analysis of Concerted Cleavage by Type IIF Restriction Enzyme SfiI in Subsecond Time Region. Biophysical. 101 (12), 2992-2998 (2011).
  70. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. J., Li, M., Harris, R. S., Lyubchenko, Y. L. Interaction of APOBEC3A with DNA assessed by atomic force microscopy. PloS one. 9 (6), e99354(2014).
  71. Pan, Y., et al. Nanoscale Characterization of Interaction of APOBEC3G with RNA. Biochemistry. 56 (10), 1473-1481 (2017).
  72. Sun, Z., Hashemi, M., Warren, G., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of the Interaction of RecG Protein with Stalled Replication Forks. Biochemistry. 57 (13), 1967-1976 (2018).
  73. Pavlicek, J. W., Lyubchenko, Y. L., Chang, Y. Quantitative analyses of RAG-RSS interactions and conformations revealed by atomic force microscopy. Biochemistry. 47 (43), 11204-11211 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

NucleosoomstructuurNucleosoomdynamiekAFM imagingChromatinestructuurCENP A nucleosomenTime lapse AFMPreparatie van mica substraatProte ne DNA complexenSingle molecule studies

Gerelateerde artikelen