In dit protocol beschrijven we het volledige proces van experimentele bijziendheid aansporing in muizen met nieuw ontworpen brillen en de techniek die nodig is voor het bereiken van stabiele en reproduceerbare resultaten in oogbeschadigingen en/of parameter metingen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Aansporing en evaluatie van een lymfkliertest Model van experimentele bijziendheid
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Lymfkliertest model van bijziendheid kunnen een krachtig hulpmiddel voor bijziendheid onderzoek vanwege de relatief gemakkelijke genetische manipulatie. Unidirectioneel voor het opwekken van bijziendheid in dieren is om duidelijke min lenzen voor ogen voor weken (lens-geïnduceerde bijziendheid, LIM). Bestaande protocollen voor aansporing en evaluatie verschillen echter van laboratorium tot laboratorium. We beschreven hier, een zeer praktische en reproduceerbare methode om te induceren LIM in muizen met nieuw ontworpen brillen. De methode correcties de lens stabiel voor het oog van de muis terwijl de lens worden gehaald voor het reinigen of actuele kunt drug administration. Het fenotype is robuust en efficiënt, en de variantie is klein. De hier beschreven methode kan worden toegepast op muizen direct na het spenen dat zich uitstrekt van de mogelijke duur voor experimenten. Ook gaven wij technische adviseert om reproduceerbare resultaten in breking en axiale lengte metingen te bereiken. Wij hopen het stapsgewijze protocol hier beschreven en de gedetailleerde artikel onderzoekers bijziendheid experimenten met bijziendheid soepeler uitvoeren en de gegevens vergelijkbaar te maken over laboratoria kan helpen.
Inleiding
De prevalentie van bijziendheid onlangs dramatisch is toegenomen, hoewel het mechanisme van het ontstaan en de progressie nog grotendeels onbekend1. Het meest kenmerkende fenotype van bijziendheid is de rek van axiale lengte (AL), waardoor het risico voor de retinale complicaties of zelfs blindheid2. Om beter te begrijpen van de pathogenese van bijziendheid en ontwikkelen effectieve behandelingen, zijn robuuste bijziend diermodellen en stabiele fenotype evaluatie noodzakelijk.
Kort, bestaan twee methoden voor inducerende bijziend Staten in dieren: formulier-ontbering bijziendheid (FDM) en lens-geïnduceerde bijziendheid (LIM)3. De voormalige plaatst diffusors voor het oog of sutures van het ooglid om te verbergen de afbeelding, die invloeden van de normale ontwikkeling van de oogbol, resulterend in een fenotype van bijziendheid. De laatste plaatsen min lenzen voor het oog om te verplaatsen het brandpunt achter het netvlies. Het netvlies detecteert de verschuiving van de focus en kieuwopeningenvorm van de oogbol u kunt opnieuw uitlijnen de retina en brandpunt. Voor FDM, nadat het ooglid is gesloten of de diffuser is vastgesteld voor het oog, is bijna geen verder onderhoud nodig. LIM moet de lens worden genomen voor het schoonmaken zodat het transparant. FDM is dus relatief eenvoudig te technisch worden geïnduceerd. Echter, de mechanismen van FDM en LIM zijn verschillend, en welke methode bootst de bijziendheid in de mens beter is nog steeds onder debat3. Een van de sterke punten van LIM is het sterker fenotype vergeleken met FDM, ten minste in het geval van muizen4.
Dieren die zijn gebruikt voor bijziendheid inducerende omvatten kuikens5, apen6, boom spitsmuizen7, cavia's8en muizen4. Rekening houdend met de mogelijkheid van genetische manipulatie, overvloedig beschikbaar antilichamen en lage kosten voor de fokkerij, kunnen muizen zijn de eerste keuze als de diermodel van bijziendheid. Vergeleken met andere grotere dieren, is vaststelling van lenzen of diffusors voor het oog van de muis echter relatief moeilijk vooral voor jonge muizen zoals recht na het spenen. Voor de experimenten moeten actuele drug administration of meerdere tussentijdse oog-metingen, is het ook noodzakelijk voor het frame worden verwijderd. Een andere uitdaging is de kleine morfologische verandering van muis oogbol, waarvoor geavanceerde techniek en apparaten te evalueren. Tot op heden maakt verschillende inducerende en het meten van de protocollen die worden gebruikt in verschillende onderzoeksteams het moeilijk om te vergelijken en herhaal de resultaten over laboratoria. Een standaard protocol met details nodig is.
Voorgaande werken beschreven meerdere methoden om op te lossen lenzen of diffusors voor het oog van de muis, zoals lijmen van9,10 en11,12van de frame van de hoofd gemonteerde goggle stiksel. Wij de exist hoofd gemonteerde goggle technics11,12,13 in combinatie met onze nieuw ontworpen frame te ontwikkelen van een ameliorated protocol voor robuuste en efficiënte experimentele bijziendheid in muizen inducerende. Het protocol kan worden toegepast op jonge muizen snel na het spenen op postnatale dag 21 (p21). Wij ook de processen voor stabiele en nauwkeurige evaluatie van fenotypen met inbegrip van de breking en AL geoptimaliseerd. Wij hopen dit gestandaardiseerde protocol kan helpen om kortzichtige muizen een gemakkelijker toegankelijk model voor bijziendheid onderzoek.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures werden goedgekeurd door de ethische Commissie op dier onderzoek van de Keio University School of Medicine vastgehouden aan de ARVO instructie voor het gebruik van dieren in Ophthalmic en visie onderzoek, de institutionele richtsnoeren inzake dier experimenten op Keio Universiteit en het dier onderzoek: rapportage van In Vivo experimenten (aankomen) richtsnoeren voor het gebruik van dieren in het onderzoek.
1. het monteren van de brillen voor muizen
- Bereiden van onderdelen die nodig zijn voor het samenstellen van de brillen (Figuur 1a). Voor elke muis, bereiden alle achterban: een hoofd gemonteerde nylon stick, een hogere en een lagere titanium frame, twee lenzen met juiste bevoegdheden overeenkomstig het doel van het experiment, een schroef van de grootte van de M1.4 met de lengte van 10 mm, één moer M1.4 grootte schroef, een vlakte wasmachine voor M1.4 grootte schroef met de dikte van 0.3 mm, en twee kunstmatige nagel tips (Tabel van materialen).
Opmerking: Twee soorten frames bestaan met verschillende hoogtes. Voor een muis, worden een hoger frame en een lagere frame gebruikt als een set. Hogere frames moeten worden geplaatst boven de lagere degenen zodat de visie velden symmetrisch. Frames en lenzen worden speciaal ontworpen en gemaakt door auteurs research group. Deze zijn beschikbaar door contact met de bijbehorende auteurs van dit artikel. Elders kunnen worden gevonden in gereedschap winkels. - Monteer het frame voor het rechter en linker oog afzonderlijk.
- Schik de nagel tip om het gezicht van de buiten richting om de beste beschermende effect te bereiken. Aanpassen van de hoek tussen de nagel tip en het frame worden ongeveer 130° om te voorkomen dat de muis visie veld (Figuur 1b) maskeren. Houden de kunstmatige nagel tips om het frame met behulp van Cyanoacrylaat lijm.
Opmerking: Nagel tips kunnen helpen om te voorkomen dat de lens wordt gekrast door de muis. De richting van de nagel tips moet tegenovergestelde omdat het hoger kader en het onderste raam worden gebruikt voor het rechter oog en het linker oog, respectievelijk. - Wacht ten minste 12 uur te laat de lijm drogen, dan gebruik een spijker klipper om aan te passen de vorm van de nagel tips om worden over 1 cm × 1 cm door te knippen en trimmen.
- Houden van de lens naar het frame met behulp van Cyanoacrylaat lijm. Zet de lens op het frame met de hand en houd van het frame horizontaal. Injecteer de Cyanoacrylaat lijm van de rand van de lens en laat de zelfklevende verspreiding door oppervlaktespanning.
Opmerking: De lijm zal eroderen de lens en de transparantie van invloed, dus zorg ervoor dat de lijm alleen raakt het perifere deel van de lens. Gebruik 0 dioptrie (D) plano lens als besturingselement en minus lens voor het opwekken van bijziendheid. Het effect van de verschillende bevoegdheden van min lenzen (–10 D tot –50 D) geweest4elders beschreven. Maximaliseren van de aansporing van bijziendheid, wordt –30 D lens aanbevolen voor inducerende bijziendheid. FDM kan ook worden opgewekt met hetzelfde apparaat simpelweg door het veranderen van de lens in het GLB van 1,5 mL microtube als de diffusor.
- Schik de nagel tip om het gezicht van de buiten richting om de beste beschermende effect te bereiken. Aanpassen van de hoek tussen de nagel tip en het frame worden ongeveer 130° om te voorkomen dat de muis visie veld (Figuur 1b) maskeren. Houden de kunstmatige nagel tips om het frame met behulp van Cyanoacrylaat lijm.
- Draai de schroef vast in de stick nylon samen met de wasmachine van de platte kant van de stick. De bril en de stokken voordat het experiment respectievelijk voorbereiden en voorraad voor verder gebruik (Figuur 1 c).
Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
2. metingen van de breking en AL basislijn.
- Toepassing van een daling van mydriatic agent met 5 mg/mL tropicamide en 5 mg/mL phenylephrine waterstofchloride aan weerskanten van de oogbol tot het verwijden van de pupil. Wacht ten minste 5 minuten voordat de narcose.
Opmerking: Verwijden de leerling onder algemene verdoving omkeerbare cataract die invloeden van de meting daarna zal veroorzaken. Altijd het verwijden van de pupil voor narcose en wacht minstens 5 min. Één druppel (ongeveer 0,05 mL) van het mydriatic agens is genoeg voor de pupil van het oog van de muis, leerstoornissen, terwijl meer agent kan geen kwaad met de volgende stappen. - Zet de muis onder algemene verdoving. Pak de rug huid van de muis zacht om te voorkomen dat de muis zijn oog stoten totdat het volledig is verdoofd. Beoordelen van de diepte van de narcose genoeg te zijn als de muis niet wordt verplaatst rond als het vrij op tafel is gelegd.
Opmerking: Een combinatie van midazolam (40 μg/100 μl), medetomidine (7,5 μg/100 μl) en Butorfanol tartraat (50 μg/100 μl) wordt hier gebruikt voor algemene anesthesie voor muizen met een volume van 0,01 mL/g intraperitoneale injectie. In het algemeen, minder dan 5 min nodig zijn voor muizen in slaap te vallen. Lange tijd van algemene anesthesie veroorzaakt lage lichaamstemperatuur en trage hartslag. Om te voorkomen dat de potentiële invloed van narcose op de meting, afwerking van alle metingen binnen 10 minuten na het inspuiten van de verdoving wordt aanbevolen. De geboden in de verdoving cocktail Butorfanol ongeveer 4 uren van analgesie verstrekken. Juiste recept voor narcose kan verschillende instellingen. - Het meten van de breking van het oog van de muis met behulp van een infrarood photorefractor4,9,14. Draai de richting van één van de ogen van de muis om te houden van de eerste Purkinje-afbeelding in het midden van de leerling en meten van de breking langs de optische as. Na de meting, meet u het tegenovergestelde oog met dezelfde procedures (Figuur 2a).
Opmerking: De waarde die is gemeten voor de breking is sterk beïnvloed door de positie van het oog van de muis langs de optische as. Zorg ervoor dat de eerste Purkinje-afbeelding wordt uitgelijnd binnen ±3 graden vanaf het midden van de leerling. De werkbank van de spectrale domein optische coherentie tomografie (SD-OCT) systeem kan worden gebruikt voor de fine tuning van de richting van de leerling in breking metingen4. - Het meten van de AL van het oog van de muis met behulp van een SD-OCT systeem4,15,16. De AL definiëren als de afstand van het hoornvlies hoekpunt tot de helderste grens in de buurt van de optische zenuw (Figuur 2b).
Opmerking: Vergelijkbaar met de waardering van de breking, de AL is sterk beïnvloed door de richting van het oog van de muis. Het hoornvlies hoekpunt kan worden bevestigd door de punt-achtige reflectie op het oppervlak van het hoornvlies. De grens van de kant van het netvlies zal worden zeer wazig zijn op het punt de optische zenuw. Draai de richting een beetje te laat de grens worden duidelijk genoeg voor het meten van, maar niet ver van de optische zenuw.
3. fixatie van het Frame op de schedel van de muis.
- Toepassing één druppel van 0,1% gezuiverde Natrium hyaluronaat oog druppel om te voorkomen dat droogte op elk oog.
Opmerking: Eye druppel op het oog oppervlak beïnvloedt de waarden van de breking en axiale lengte metingen. Gebruik niet de daling van de ogen na de narcose totdat alle metingen zijn gedaan. - De kin van de narcose muis zetten op een helling die gemaakt van klei of om het even wat kan worden gebruikt als een kussen om de upfront vliegtuig van de schedel worden horizontale.
- Steriliseren van het haar en hoofdhuid tussen de oren en ogen wattenstaafje met 70% ethanol.
- Snijd de huid tussen de oren en ogen voor het blootstellen van de schedel voor over 0.8 cm2 met behulp van chirurgische schaar en pincet. Gebruik tandheelkundige etsen vloeistof en katoenen doekje te verwijderen van het beenvlies. Het steriliseren van de heelkundige schaar en pincet met 70% ethanol vóór de operatie van elke muis.
Opmerking: Knippen van het haar en steriele handschoenen mogelijk. Controleer de bepalingen van de relevante dierenverzorgers Comité vóór deze procedure. In de meeste gevallen de tandheelkundige etsen vloeistof vindt u als een van de bijlagen in het zelf genezen tandheelkundige zelfklevende systeem. Als de vloeistof tandheelkundige etsen niet beschikbaar is, gebruikt u 70% ethanol. - Monteer een set frames zonder lens te helpen bevestigen de stok op de juiste positie. Zet de frames op het hoofd van de muis. Zorgvuldig pas de positie van de frames om ervoor te zorgen dat beide ogen zijn in het midden van het lege kader.
- Gebruik een zichzelf genezen tandheelkundige zelfklevend systeem om te koppelen de stok aan het hoofd van de muis. Wees voorzichtig niet te laten de vloeistof van de stroom systeem aanvaarden in het oog van de muis.
Opmerking: De methode voor het gebruik van het zelf genezen tandheelkundige zelfklevend systeem verschilt tussen producten. Verwijzen naar de instructies zorgvuldig.
Let op: Sommige van de reagentia in de tandheelkundige zelfklevend systeem kan worden giftig. - Wacht ongeveer 5 minuten en opstijgen zorgvuldig het frame en de moer zonder het veranderen van de positie van de stok (Figuur 3a).
- Injecteren van 0,75 mg/kg atipamezole hydrochloride intraperitoneally om de muis te recovery van de narcose sneller. Zet de muis in een individuele kooi totdat volledig hersteld. Laat niet de muis zonder toezicht totdat het voldoende bewustzijn te handhaven sternale lighouding heeft herwonnen. Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
4. Inleiding van de inductie van bijziendheid en het onderhoud achteraf
- Wacht ten minste 24 uur na de operatie te laten de muis volledig herstellen van anesthesie. Pak van de stok en zetten de frames met lenzen. De aansporing begint op dit tijdstip (Figuur 3b).
Opmerking: Om te minimaliseren van het ongemak tijdens het herstel van anesthesie en geven genoeg tijd voor de tandheelkundige zelfklevend systeem om te stollen, is het sterk aanbevolen om het frame zetten, nadat de muizen volledig hersteld van de verdoving. Het cement van de hars van de zelfklevende systeem zal volledig betrekking hebben op de verlaging van de hoofdhuid. Dus is geen specifieke na chirurgische behandeling nodig ter voorkoming van infectie en verbetering van post chirurgische pijn. Direct na de eerste keer voor het plaatsen op het frame, zal de muizen worden over bewust aan het bestaan van de lens en kras er veel. Het bruto gedrag zal worden terug naar normaal na een paar uur. De muizen met lenzen kunnen worden gehouden met de dezelfde dichtheid aan de normale muizen. - Verwijder het frame en reinig de lenzen en de nagel tips met katoenen wissers ten minste twee keer per week om de transparantie van de lens.
Opmerking: Het is niet nodig om de muis onder verdoving voor het verwijderen en aanbrengen op het frame. Een ondersteuning bieden voor de muizen om op te zitten, in plaats van het hebben van hen hangen terwijl nood werkend met hen zou kunnen verminderen.- Als een tussentijdse meting noodzakelijk is, plaatst u de muis onder verdoving en meten van de muis zoals hiervoor is beschreven. De aansporing kan worden voortgezet na de muis die herstellende is van de verdoving.
- Reinig de kooi ten minste tweemaal per week.
Opmerking: Deze hulp om de duidelijkheid van de lens. Brengen van een net tussen de muis en de bodem van de kooi naar het filtraat van de restjes eten kan ook nuttig zijn. - Het lichaamsgewicht en grove gedrag controleren. Vergelijk ze met de zelfde leeftijd onaangeroerd muizen tijdens de hele experimentele proces.
Opmerking: Met uitzondering van enkele krassen gedrag, geen significante verandering met inbegrip van het lichaamsgewicht is gevonden tussen experiment muizen met onbehandelde muizen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
At, eerst als alle de benodigde onderdelen zijn bereid (Figuur 1a). Een voorbeeld van een stuk van gemonteerde brillen is weergegeven in Figuur 1b. Met uitzondering van de hoofdmacht van de frames en de moer zijn alle andere onderdelen beschikbaar voor elke muis. Een set van voltooide brillen is afgebeeld in Figuur 1 c. Het wijzigen van de hoek tussen de twee frames voor aanpassing aan de muis met ve...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Controleer of de bril vast te stellen stabiel op de kop van de muis, moeten verschillende stappen in dit protocol veel aandacht worden besteed. Het beenvlies moet volledig worden verwijderd voordat u de tandheelkundige zelfklevende systeem. Het bloed op de schedel ook moeten met zorg worden opgeruimd. Een beetje fijnafstelling die aanvaardbaar is direct na de toepassing van de lijm, Verplaats niet de stick vaak voordat het zelfklevend systeem opdrogen. Volg de instructie van de zelfklevende systeem zorgvuldig, met name d...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Het ontwerp van de muis lenzenvloeistof heeft aangevraagd een octrooi (Application no. 201741349).
Dankbetuigingen
Wij danken M.T. Pardue voor advies over de SDOCT, F. Schaeffel voor advies over metingen van breking en hoornvlies kromming, Mr. Sanshouo voor het herscheppen van de driedimensionale framegegevens, M. Miyauchi; K. Tsubota; Y. Tanaka; S. Kondo; C. themaoman; M. Ibuki; Y. Miwa; Y. Hagiwara; A. Ishida; Y. Tomita; Y. Katada; E. de Yotsukura; K. Takahashi; en Y. Wang voor kritische discussies. Dit werk werd gesteund door subsidies inAid voor wetenschappelijk onderzoek (KAKENHI, nummer 15K 10881) van het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie (MEXT) TK. Dit werk wordt ook ondersteund door de subsidie voor bijziendheid onderzoek van Tsubota laboratorium, Inc (Tokio).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| schroef | NBK | SNZS-M1.4-10 | |
| schroefvinger | MonotaRO | 42166397 | |
| moer | MonotaRO | 42214243 | |
| stok | DMM Make | none | ontworpen door auteurs en geproduceerd door de 3D-printer gehuurd van DMM Make. |
| frame | DMM Make | none | ontworpen door auteurs en geproduceerd door de 3D-printer gehuurd van DMM Make. |
| lenzen | RAINBOW CONTACT LENS | none | aangepast voor gebruik door muizen door het bedrijf |
| cyanoacrylaatlijm | OK MODEL | MP 20g | |
| tandheelkundig hechtmiddelharscement | SUN MEDICAL | super bond | bevat de etsvloeistof die wordt gebruikt voor het verwijderen van het periosteum van de muizenschedel |
| infraroodfotorefractor | Steinbeis Transfer Center | none | ontworpen en aangeboden door Dr. Frank Schaeffel van de universiteit van Tübingen |
| Spectral domain OCT | Leica | R4310 | |
| Tropicamide, Fenylephrine Hydrochloride-oplossing | Santen | Mydrin-P | |
| midazolam | Sandoz K.K. | SANDOZ | componenten voor het anestheticum |
| medetomidine | Orion Corporation | Domitor | componenten voor het anestheticum |
| butorphanol tartraat | Meiji Seika Pharma | Vetorphale | componenten voor het anestheticum |
| 0,1% gezuiverd natriumhyaluronaat | Santen | Hyalein | |
| atipamezole hydrochloride | Zenoaq | antisedan |
Referenties
- Dolgin, E. The myopia boom. Nature. 519 (7543), 276-278 (2015).
- Ohno-Matsui, K. Pathologic Myopia. Asia-Pacific Journal of Ophthalmology (Philadelphia, Pa). 5 (6), 415-423 (2016).
- Morgan, I. G., Ashby, R. S., Nickla, D. L. Form deprivation and lens-induced myopia: are they different. Ophthalmic & Physiological Optics. 33 (3), 355-361 (2013).
- Jiang, X., et al. A highly efficient murine model of experimental myopia. Scientific Reports. 8 (1), 2026(2018).
- Torii, H., et al. Violet Light Exposure Can Be a Preventive Strategy Against Myopia Progression. EBioMedicine. 15, 210-219 (2017).
- Smith, E. L. 3rd, et al. Effects of Long-Wavelength Lighting on Refractive Development in Infant Rhesus Monkeys. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6490-6500 (2015).
- Gawne, T. J., Siegwart, J. T., Ward, A. H., Norton, T. T. The wavelength composition and temporal modulation of ambient lighting strongly affect refractive development in young tree shrews. Experimental Eye Research. 155, 75-84 (2017).
- Wu, Y., et al. Early quantitative profiling of differential retinal protein expression in lens-induced myopia in guinea pig using fluorescence difference two-dimensional gel electrophoresis. Molecular Medicine Reports. , (2018).
- Schaeffel, F., Burkhardt, E., Howland, H. C., Williams, R. W. Measurement of refractive state and deprivation myopia in two strains of mice. Optometry and Vision Science. 81 (2), 99-110 (2004).
- Tkatchenko, T. V., Shen, Y., Tkatchenko, A. V. Mouse experimental myopia has features of primate myopia. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1297-1303 (2010).
- Faulkner, A. E., Kim, M. K., Iuvone, P. M., Pardue, M. T. Head-mounted goggles for murine form deprivation myopia. Journal of Neuroscience Methods. 161 (1), 96-100 (2007).
- Gu, Y., et al. A Head-Mounted Spectacle Frame for the Study of Mouse Lens-Induced Myopia. Journal of Ophthalmology. 2016, 8497278(2016).
- Siegwart, J. T. Jr, Norton, T. T. Goggles for controlling the visual environment of small animals. Laboratory Animal Science. 44 (3), 292-294 (1994).
- Tkatchenko, T. V., Tkatchenko, A. V. Ketamine-xylazine anesthesia causes hyperopic refractive shift in mice. Journal of Neuroscience Methods. 193 (1), 67-71 (2010).
- Chou, T. H., et al. Postnatal elongation of eye size in DBA/2J mice compared with C57BL/6J mice: in vivo analysis with whole-eye OCT. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3604-3612 (2011).
- Park, H., et al. Assessment of axial length measurements in mouse eyes. Optometry and Vision Science. 89 (3), 296-303 (2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
