Isolatie van één intracellulaire bacteriële gemeenschappen gegenereerd op basis van een lymfkliertest Model van urine landstreekbesmetting Downstream eencellige p.a.

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode om één, besmet-blaas epitheliale cellen van een lymfkliertest model van urineweginfectie te isoleren.

Samenvatting

In dit artikel schetsen wij een procedure gebruikt om te isoleren van de individuele intracellulaire bacteriële gemeenschappen van een muis die experimenteel heeft geweest septisch in de urinewegen. Het protocol kan grofweg worden verdeeld in drie secties: de infectie, oogsten van de epitheliale cellen van de blaas- en mond micropipetting isoleren van individuele geïnfecteerde epitheliale cellen. De geïsoleerde epitheliale cel bevat levensvatbare bacteriële cellen en is bijna vrij van verontreiniging van extracellulaire bacteriën, waardoor het ideaal is voor downstream eencellige analyse. De tijd genomen vanaf het begin van de infectie aan het verkrijgen van een enkele intracellulaire bacteriële Gemeenschap is ongeveer 8 h. Dit protocol is goedkoop om te implementeren en maakt gebruik van algemeen beschikbare materialen, en wij verwachten dat het ook kan worden gebruikt in andere modellen van de infectie te isoleren van enkele geïnfecteerde cellen uit cel-mengsels, zelfs als die geïnfecteerde cellen zeldzaam zijn. Echter, als gevolg van een potentieel risico in mond micropipetting, deze procedure wordt niet aanbevolen voor zeer besmettelijke agentia.

Inleiding

Infecties van de urinewegen (UTI) zijn een van de meest voorkomende bacteriële infecties. Naar schatting 40-50% van de vrouwen wordt verwacht dat de ervaring van ten minste één infectie urinewegen (UTI) tijdens hun levensduur¹. Een van de belangrijkste verwekkers van UTI is de uropathogenic E. coli (UPEC), die goed is voor meer dan 70% van ongecompliceerde UTI². Bovendien zullen ongeveer een kwart van degenen die een UTI hebben een terugkerende infectie, vaak veroorzaakt door dezelfde stam, ondanks adequate behandeling met antibiotica³hebben. De hoge incidentie van UTI vertegenwoordigt een aanzienlijke last voor de stelsels voor gezondheidszorg, kost meer dan 2 miljard dollar per jaar in de VS⁴. Bovendien, het gebruik van antibiotica voor de behandeling van UTI leidt ook tot stijgende prijzen van de antibioticaresistentie, die is een grote volksgezondheid bezorgdheid⁵.

Daarom heeft een grote inspanning gebracht in het begrip van de mechanismen waarmee UPEC infecteert de urinewegen, evenals haar vermogen tot terugkerende infecties^6,7,8. In het bijzonder is een muismodel van infectie te onderzoeken van bacteriële en gastheer kenmerken die aan de UTI^{8 bijdragen}gebruikt. Deze muismodel heeft het voordeel van de toepassing op ongewijzigde klinische stammen geïsoleerd van menselijke patiënten. Dit model heeft ook geleid tot de ontdekking van een potentieel druggable bacteriële trajecten belangrijk voor inrichting van UTI, zoals de Type 1 pilus⁹ en ijzer acquisitie systemen¹⁰.

Vergeleken met deze successen bij het bestuderen van de vroege gebeurtenissen in UTI, ontbreekt kennis van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de terugkerende UTI nog¹¹. Een hypothese is dat UPEC antibiotische therapie ontwijkt en terugkerende infecties in de blaas veroorzaakt door de vorming van intracellulaire bacteriële Gemeenschappen (IBC's) binnen de epitheliale cellen van de blaas. IBC's zijn geïdentificeerd, zowel in menselijke UTI patiënten-^12,13in lymfkliertest modellen van infectie. De aanwezigheid van IBC's in urine monsters van pediatrische patiënten van de UTI is geassocieerd met hogere tarieven van herhaling^14,15. IBC's isoleren en bestuderen van de bacteriën in hen heeft echter bewezen technisch uitdagend vanwege hun zeldzaamheid; geschat wordt dat een besmette lymfkliertest blaas doorgaans alleen 10-100 IBC's^{16 heeft}. Bovendien, de epitheliale cellen van de blaas zijn relatief groot (50-120 µm)¹⁷, maken het uitdagend om te implementeren fluorescentie bijgestaan cell sorting (FACS) gezien het feit dat typische FACS sproeiers zijn ontworpen met een diameter van 70 µm of 100 µm. Dus, worden de cellen zo groot als de epitheliale cellen van de blaas vaak verwijderd door filtratie vóór FACS om verstopping van de fluidics.

Onze lab beschreven onlangs een algemene en economische methode voor het isoleren van zeldzame geïnfecteerde cellen uit mengsels zoals geschraapt epitheliale cellen van de blaas¹⁸. Effectief isoleren IBC's, gebruikten we de traditionele mond pipetteren. Micropipetting van de mond is een techniek die al lange tijd voor micromanipulation van afzonderlijke cellen en embryo's voor downstream analyse^{19,20,21,22,23,} gebruikt heeft ^{24 , 25}. traditionele mond pipetteren van grote vloeibare volumes (in milliliter) is vaak de oorzaak geweest van laboratorium gerelateerde ongevallen en de techniek heeft terecht is gemeden door veel van de onderzoeksgemeenschap buiten traditionele embryologie en eencellige toepassingen. Ons protocol is geïnspireerd door de eencellige versies van deze techniek^19,20, die risico meebrengt kleiner maken door middel van een grote buffer (> 2 mL) van lucht tussen de onderzoeker en het monster vergeleken met de hoeveelheid vloeistof overgedragen (< 1 ΜL). Deze methode maakt ook gebruik van de fijne controle dat mond micropipetting biedt, wat zich vertaalt naar een lage eindvolume van de omringende oplossing overgedragen en hoge zuiverheid van geïsoleerde cellen. De techniek maakt gebruik van goedkope materialen (< 50 dollar), en dus om uit te voeren in alle laboratoria haalbaar moet zijn.

Dit visuele protocol beschrijft onze IBC isolatie techniek, bieden een referentie om te helpen andere onderzoekers proberen te repliceren deze techniek. De onderzoeker moet toegang tot een fluorescente ontleden Microscoop (of soortgelijke apparatuur) die kan worden gebruikt voor het visualiseren van afzonderlijke epitheliale cellen en de fluorescerende bacteriën tijdens live weergave, met een open en toegankelijke imaging stadium voor micropipetting (Zie de Tabel van materialen voor de details van de Microscoop gebruikt, hoewel andere modellen gelijkwaardig instrument kunnen ook worden gebruikt). Terwijl dit protocol zich op IBC's in een lymfkliertest model van UTI richten zal, ook soortgelijke methoden gelden voor het isoleren van geïnfecteerde cellen van cel schorsingen in andere modellen van infectie.

Protocol

Alle methoden die hier worden beschreven met betrekking tot dierlijke behandeling zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van het genoom Instituut van Singapore en biologische Resource Center van het Agentschap voor wetenschap, technologie en onderzoek, Singapore.

1. muis infectie

1. Voorbereiding van glazen capillairen
   1. Licht een open vuur-bron (Bunsenbrander of alcohol brander).
   2. Houd een glas capillaire met twee handen door knijpen stevig beide uiteinden en het midden van de buis gelijkmatig verhit totdat het glas zacht gaat. Draai het capillair zachtjes heen en weer langs de as om te helpen bij zelfs verwarming van het glas.
   3. Verwijder de glazen viscometerbuizen uit de warmtebron en onmiddellijk trekken handen uit elkaar, terwijl het handhaven van de greep op de beide uiteinden van de buis. De ideale definitieve lengte van het getrokken capillair is 3-5 cm langer dan een unpulled capillair om een passende interne diameter voor het isoleren van de epitheliale cellen van de enkele blaas.
      Let op: De buis blijft zeer warm voor een periode van tijd, dus zorg dat het capillair opzij op een warmte-veilige ondergrond voor een paar minuten afkoelen voordat u verdergaat met de volgende stap.
   4. Controleer om te zien als het midden van de glazen viscometerbuizen geworden holle smaller (Figuur 1A) en dat de binnenkant van de buis nog (Figuur 1B). Voor isolatie van IBC's is een boring grootte van 200-400 µm bruikbaar.
   5. Neem één uiteinde van de getrokken capillair met één hand. Houd een paar pincet met de andere hand, en gebruiken voor het ophalen van de getrokken glazen capillaire op het smalste punt. Zorg ervoor dat de verlostang zijn gezwaaid met genoeg kracht om het capillair stevig grip zonder aandrukken.
   6. Gebruik een snel draaiende beweging bij de hand houden van de verlostang om snap het getrokken capillair op het smalste punt maken een mond micropipetting capillaire.
      Opmerking: Met behulp van de vingers in plaats van de verlostang is eveneens aanvaardbaar, zolang er voldoende bescherming tegen glasscherven wordt gebruikt.
   7. Herhaal stappen 1.1.2-1.1.6 ten minste 4 x meer te produceren voldoende reserve micropipetting haarvaten en bieden een scala aan diameters voor IBC isolatie. Als meer dan één groep van de infectie naar verwachting, bereiden 5 aanvullende micropipetting haarvaten voor elke extra infectie-groep.
      Let op: Vergeet niet om te sluiten van het open vuur.
   8. Plaats van de getrokken haarvaten in een petrischaal van 100 mm en bloot de schotel aan UV straling voor 30 min te steriliseren van de haarvaten.
   9. Vervang het deksel op de petrischaal na UV-sterilisatie en de petrischaal met de haarvaten bij kamertemperatuur worden opgeslagen.
2. Voorbereiding van katheters voorafgaand aan infectie
   1. Urine katheters voorbereiden infectie zoals beschreven in Hung et al.⁸ en Conover et al.²⁶ ten minste één dag voordat de infectie.
3. Voorbereiding van fluorescerende uropathogenic E. coli cultuur
   1. Groeien de geselecteerde fluorophore-uiten uropathogenic bacteriële belasting volgens de vastgestelde protocollen.
      Opmerking: De keuzes van spanning en fluorophore is grotendeels afhangen van de Microscoop en de spanningen die beschikbaar zijn in individuele laboratoria. In dit voorbeeld gebruiken we een stam afgeleid van UTI89, die is een klinische isolaat oorspronkelijk van een patiënt met terugkerende blaasontsteking. Dit stam, SLC-638, draagt een plasmide (pSLC-77) die zowel vsfGFP-9 en kanamycine weerstand¹⁸uitdrukt. SLC-638 wordt geteeld in de pond-Bouillon bij 37 ° C aangevuld met 50 µg Mo/mL kanamycine.
   2. Strijk stam SLC-638 op een Luria Bertani (LB)-aangevuld met 50 µg Mo/mL kanamycine agarplaat. Incubeer de plaat bij 37 ° C's nachts.
   3. (Optioneel) Bekijk de plaat op de ontleden Microscoop te bevestigen de uitdrukking van fluorescente markeringen voor het selecteren van een kolonie.
   4. Met behulp van een lus van de bacteriële inoculatie, overdracht van de geselecteerde kolonie in een conische kolf van 125 mL met 10 mL van de pond-Bouillon aangevuld met 50 µg Mo/mL kanamycine. Incubeer de kolf statisch bij 37 ° C gedurende 24 uur.
   5. Subcultuur de bacteriën uit deze kolf door 10 µL van cultuur van de kolf en verdunnen het in 10 mL van de pond-Bouillon aangevuld met 50 µg Mo/mL kanamycine in een maatkolf van verse 125 mL (een verdunning van 1:1000). Deze tweede erlenmeyer statisch op 37 ° C gedurende een andere 24 uur incuberen.
   6. Spin down de bacteriecultuur voor 5 min op 5000 x g - en 4 ° C.
   7. Giet het supernatant en resuspendeer de pellet van bacteriële in koude PBS bij OD₆₀₀ van 0,5.
      Opmerking: Hoewel dit van cultuur tot cultuur variëren kan, meestal 1 mL van statische cultuur geeft ongeveer 4-5 mL OD₆₀₀ = 0.5 bacteriecultuur. Het totale volume van bacteriële entmateriaal nodig voor elke stam kan als volgt worden berekend: 50 µL is vereist voor elke muis en 50 µL is nodig voor het vullen van het hoofd van de naald. Een extra 10-20% (minimaal 50 µL) van de entmateriaal wordt aanbevolen voor dood volume in de spuit.
   8. Gebruik de resterende bacteriële mengsel om te bepalen van de titer van de infectie zoals beschreven in Hung et al.⁸.
      Opmerking: Deze stap kan worden uitgesteld voor een paar uur door op te slaan van het bacteriële mengsel bij 4 ° C.
4. Lymfkliertest Model van urine landstreekbesmetting
   1. Infecteren de muizen zoals beschreven door Hung et al.⁸, met een experimentele groep voor elke stam van fluorescerende E. coli gekweekt in punt 1.3.
      Opmerking: Zie ook Conover et al.,²⁶ voor visuele ondersteuning.
   2. Opmerking de tijd van de bacteriële inoculatie voor de muis of de kooi.
   3. Herhaal infecties voor de gehele experimentele groep.
      Opmerking: De infectie katheter mag worden hergebruikt voor alle muizen in dezelfde groep.
   4. Herhaal de stappen 1.4.1-1.4.3 voor elke experimentele groep gepland, ervoor te zorgen dat een nieuwe katheter en nieuwe smeermiddel gel bereid is voor elke groep.
      Opmerking: Voor experimenten met een groot aantal dieren, het is best om de dieren te verdelen in groepen van vijf en spreiding van de infecties, zodanig dat elke groep besmet ongeveer 30 min tot 1 h uit elkaar. Dit zorgt voor voldoende tijd voor de volgende stappen (punten 2 en 3).

2. blaas epitheliale cel oogsten om te verkrijgen van een celsuspensie

1. Oogsten en omkeren lymfkliertest blazen
   1. Drie 50 mL conische buizen gevuld met 45 mL 70% ethanol voor het steriliseren van chirurgische apparatuur voor te bereiden.
   2. In twee van de buizen bereid in stap 2.1.1, plaatst u een paar van schaar en een paar pincet elke. Plaats twee paar pincet (een bij voorkeur smaller zijn en met een afgeronde tip, voor de omkering van de blaas) in de derde buis.
      Opmerking: De hulpprogramma's in de eerste buis zal worden gebruikt op het externe regio, de hulpprogramma's in de tweede zal worden gebruikt bij het oogsten van de blaas en de twee paren van pincet in de laatste buis gebruikt in blaas inversie.
   3. Bij 6 h post infectie, euthanaseren van de geïnfecteerde muizen volgens de instelling gevestigde IACUC protocollen.
      Opmerking: Onze IACUC-protocol vraagt om euthanasie via cervicale dislocatie uitgevoerd terwijl de muis onder verdoving (Isofluraan is).
   4. De dieren lag plat op hun rug en gebruik een spray fles gevuld met 70% ethanol te steriliseren hun buikstreek.
   5. Met behulp van een paar pincet en chirurgische scharen uit de eerste buis (bereid in stap 2.1.2), openen maken een kleine dwarse incisie op de huid over 1 cm boven de urethrale. Vouw de incisie diagonaal naar de bovenste ledematen van de muis en het creëren van een V-vormige snede langs de gehele anterior van de muis die bloot de inhoud van het buikvlies. Zorg ervoor dat tijdens dit proces, de schaar niet de darmen van de muis (Figuur 2A, B doorsnijden doen).
   6. Overschakelen naar de tweede reeks van hulpmiddelen (bereid in stap 2.1.2). Met behulp van de bladen van de schaar of de schachten van de Tang, duw voorzichtig neer op de dikke pads in de buurt van het bekken van de muis.
      Opmerking: Deze stap zorgt ervoor dat de blaas naar buiten uitsteken en zorgt voor zichtbaarheid voor de oogsten.
   7. Greep de blootgestelde blaas op de apex met een paar pincet (Figuur 2C).
   8. Een stevige grip houden op de top van de blaas met de Tang, gesneden en gratis de blaas van de rest van het dier (weg snijden de urethra en urineleiders) met behulp van de heelkundige schaar. De verlostang houden de blaas nog vrijgeven niet .
   9. Overschakelen van de schaar aan de smallere afgeronde verlostang uit de derde conische buis (uit stap 2.1.2), breng de tip van een schacht van de afgeronde verlostang in de opening van de blaas waar het gewoon in de vorige stap (Figuur 2D knippen was). Met het puntje van de afgeronde verlostang veilig ingebracht in de opening van de blaas, laat de paar pincet aangrijpend de apex van de blaas en terug te sturen naar de tweede conische buis.
   10. Voorzichtig met behulp van de tweede paar pincet uit de derde buis, draai de blaas "inside out", eerst buiten de monding van de blaas uit de buurt van de afgeronde verlostang (Figuur 2D, pijl 1) eind trekken en begeleiden het rond en over het andere uiteinde van de afgeronde verlostang (Figuur 2D, Pijl 2).
       Opmerking: De actie kan worden vergeleken met het verwijderen van een sok uit één voet en te trekken boven de andere.
       1. Handhaven tijdens de inversie proces, de eerste afgeronde paar pincet bijna volledig gesloten. Dit biedt genoeg bewegingsvrijheid de blaas om af te trekken van de eerste as van de afgeronde verlostang, maar ook de tweede as van de afgeronde verlostang dichter brengt bij de eerste en voor de blaas te gemakkelijk worden overgedragen. Het uiteindelijke resultaat van deze stap is dat de blaas moet worden omgekeerd en op het puntje van de tweede schacht van de eerste paar pincet(Figuur 2).
       2. Met behulp van de tweede paar pincet, coax zachtjes de omgekeerde blaas uit het topje van de verlostang in 1 mL koude PBS.
          Opmerking: (Optioneel) Dit is de geschikt moment om beelden van de gehele omgekeerd, besmette blaas te observeren de algemene frequentie en de distributie van IBC's, eventueel te nemen.
   11. Herhaal de stappen 2.1.1-2.1.10 voor elke blaas in de experimentele groep (tot een maximum van vijf dieren).
2. Blaas epitheliale cel schrapen
   1. Met behulp van twee paren van verlostang schoon, voorzichtig schrapen de buitenkant van de omgekeerde blaas (dat is de interne epitheliale cellaag). De omliggende PBS moet verschijnen bewolktere als opbrengst schrapen en epitheliale cellen worden vrijgegeven in de PBS-oplossing.
   2. (Optioneel) Visueel bevestigen dat het schrapen van de blaas cellen in oplossing met behulp van een ontleden Microscoop heeft vrijgegeven. Figuur 3 A, B). De PBS bewolkt met het blote oog moet verschijnen, en de epitheliale cellen van de geschraapt individuele blaas kunnen worden gezien op 10 x vergroting.
   3. Herhaal de stappen 2.2.1-2.2.2 voor elke geoogste blaas uit stap 2.1.

3. de intracellulaire bacteriële Gemeenschap (IBC) isolatie: mond Pipetting voor IBC's

Opmerking: Alle methoden die worden beschreven in deze sectie hebben een institutionele risicobeoordeling ondergaan. Mond pipetteren draagt het inherente risico van inname van de oplossing die worden overgedragen. Dit risico is grotendeels verzacht door de nanoliter volumes die dit protocol wordt gebruikt, en we raden alle gebruikers van het protocol loon rekening houden met het voorzorgsbeginsel en praktijk notities vermeld hier en in de discussie.

1. Na de cellen hebben zijn geschraapt in de PBS, instellen van de mond micropipetting apparatuur (Figuur 3C).
   1. Steek de dikkere uiteinde van de getrokken glazen capillaire (het unpulled einde) in de rubberen stekker (witte eind) van de buis aspirator.
   2. Steek het smalle uiteinde van een 1 mL pipet tip in het andere open (rood) uiteinde van de buis aspirator, ervoor te zorgen dat er een strakke pasvorm.
   3. Sluit het smalle uiteinde van een in het open, bredere einde van het 1 mL pipet puntje zuigen Pipetteer 2 mL, opnieuw om ervoor te zorgen dat er een strakke pasvorm.
      Opmerking: De resulterende setup kan de onderzoeker mond Pipet uit het bredere, door het open einde van de zuigen pipet maken een zachte zuigkracht van de smalle uiteinde van de capillaire buis aan de andere kant van het apparaat.
   4. Test de laatste mond micropipetting-apparaat met behulp van een 100 mm petrischaal met verse gedeïoniseerd water. Een lichte zuig optreden op het open uiteinde van de zuigen Pipet (vergelijkbaar met het genot van een drankje met een rietje) moet verhogen het niveau van de vloeistof in het capillair, maar niet het veroorzaken van de gedeïoniseerd water in de buis aspirator overloopt. Gebruik één hand om de capillaire buis, tijdens het gebruik van de andere kant om het aanpassen van de positie van de petrischaal.
      Opmerking: De kracht van zuigkracht die nodig zijn voor een enkel IBC mond-pipetting zal variëren tussen onderzoekers. Het wordt echter aanbevolen dat elke onderzoeker probeert deze techniek begint met een zwakke zuigkracht en Verhoog langzaam het als geen vloeistof stroomt van het capillair. Er is geen behoefte aan een kracht groter is dan het zuigen op een rietje drinken. Als het capillair niet lijkt te worden tijdens de test in stap 3.1.4 oppakken van vloeistof, is het mogelijk dat het capillair of de zuigen buis is geroteerd en moet worden vervangen. Verder is het raadzaam dat alle nieuwe onderzoekers eerste praktijk beheersen zuig in de mond pipetting apparaat met behulp van gesteriliseerd water. Bovendien, er rekening mee dat de controle van het volume in beslag genomen door de mond pipetting apparatus door het gebruik van de tong van de onderzoeker is. De tong kan fijn aanpassen van de kracht van zuiging toegepast, evenals fungeren als een noodstop.
   5. Na het bereiken van succesvolle opname van vloeistof, test u de mogelijkheid om het verdrijven van de capillaire door zachtjes blazen in het open uiteinde van de pipet zuigen. Ervoor zorgen dat er geen luchtbellen worden gemaakt in het proces van uitzetting van de vloeistof om te voorkomen dat besmetting van de IBC's tijdens stap 3.5.
      Opmerking: Als afzuigen, zal de kracht van positieve druk uitgeoefend door de onderzoeker tot uitzetting van de IBC in de centrifugebuis variëren tussen onderzoekers. Het wordt aanbevolen voor onderzoekers nieuw voor dit protocol naar praktijk stap 3.1 een paar dagen voordat de werkelijke infectie. Een suggestie voor beoefenen mond micropipetting is om praktijk kleine volumes gesteriliseerd water vermengd met een paar druppels van voedsel kleurstof (voor zichtbaarheid) met behulp van de mond micropipet apparaat overbrengen.
2. Plaats de geschraapt celsuspensie onder de Microscoop ontleden en identificeren van de IBC's als grote fluorescerende aggregaten (Figuur 3A, B). Het ideale bereik van vergroting is 20-40 x. Het mooie einde van de glazen capillaire duik in een verse buis van PBS voor 1 s te verminderen de opname van ongewenste volume via capillair actie.
3. Kijkend naar de Microscoop, de IBC van belang te identificeren en breng langzaam het open uiteinde van de capillaire buis richting de IBC. Gebruik het mooie einde van de glazen capillaire te vegen weg extra cellen in de buurt van elke IBC om te voorkomen dat de ambitie van twee of meer cellen of te breken uit elkaar grotere aggregaten van de cellen.
4. Terwijl u door de Microscoop, een geringe zuigkracht van toepassing op het einde (zuigen pipet) van het apparaat micropipetting mond bij het IBC in de glazen viscometerbuizen.
5. Na het oppakken van de IBC, het capillair naar een centrifugebuis lege 1,5 mL en een lichte overdruk tot uitzetting van de druppel en de IBC in de centrifugebuis (Figuur 3D) van toepassing.
6. Herhaal stap 3.3-3.6 op zo vele IBC's van de huidige blaas, voordat u doorgaat naar de volgende blaas zijn nodig. Zuigen pipetten en haarvaten vaak om te voorkomen dat de opbouw van speeksel wijzigen.
   Let op: Wanneer u werkt met besmettelijke (of klinische) stammen van bacteriën, voortdurend toezicht op het niveau van de oplossing in het capillair. Laat niet het niveau van de vloeistof wordt afgepipetteerde overloop van de rand van het capillair in de aspirator buis. Als dit gebeurt, onmiddellijk overschakelen naar een andere aspirator buis, en negeren de vorige set up.
7. Herhaal stap 3.2-3.6 op alle geoogste blazen, of totdat voldoende aantal biologische monsters zijn verzameld voor de experimentele groep.
8. (Optioneel) Herhaal stap 3.6 en 3.7 totdat alle experimentele groepen (of muizen) hebben al euthanized en voldoende biologische monsters uit elke groep zijn geoogst.

Resultaten

Naast bevestiging (Figuur 3D) van de aanwezigheid van een enkele geïsoleerde IBC in de buis van de collectie via de ontleden Microscoop, kan de zuiverheid van de geïsoleerde IBC ook worden bevestigd door confocale microscopie. Zoals blijkt uit Figuur 4A, de geïsoleerde cellen moeten vlekken voor zowel de E. coli en de uroplakin, en de verwachte grootte voor IBC's (50-120 µm)¹⁷. Bovendien, E. coli kleuring is niet aanwezig in de omliggende vloeistof. Op basis van onze gegevens, zijn meer dan 90% van de cellen geïsoleerd met deze techniek IBC's¹⁸. Na de isolatie, kunnen de aanwezigheid en de levensvatbaarheid van de bacteriële cellen in de individuele IBC worden bevestigd door middel van de kolonie vormende eenheid (CFU) opsomming (Figuur 4B) of kwantitatieve polymerase-kettingreactie (qPCR) voor genomic equivalenten ( Figuur 4 C). Figuur 4C toont ook aan dat niet-geïnfecteerde epitheliale cellen geïsoleerd met hetzelfde protocol geen meetbare hoeveelheid bacteriën hebben. Op basis van deze gegevens, schatten we dat het bereik van CFUs in een enkele IBC 10²-10³ in het lymfkliertest model van infectie van de urinewegen is. Een van de hoofddoelen van één IBC isolatie is het uitvoeren van downstream analyses uitgevoerd, zoals RNA sequencing. Om te verifiëren dat de methode van onze isolatie kunnen verkrijgen van RNA van bacteriën in IBC's voor analyse, wij kwantitatieve omgekeerde transcriptie polymerase kettingreactie (qRT-PCR) kwantificering van drie genen (16S, cyoB, en frdA) uitgevoerd voor een bereik van individueel geïsoleerd en gegroepeerde IBC's (Figuur 4D). Alle gegevens weergegeven in Figuur 4 is aangepast met toestemming van Duraiswamy et al.¹⁸. Een schematisch overzicht van onze IBC isolatie protocol kan worden gezien in Figuur 5, dat is overgenomen van Duraiswamy et al.¹⁸.

Figuur 1 : Hand-getrokken haarvaten behouden smalle openingen. (A) monsters van hand-getrokken capillaire buisjes worden weergegeven op een zwarte achtergrond voor contrast. Van beneden naar boven, een unpulled capillair, een capillair die niet in voldoende mate werd getrokken, worden een capillair die kan worden gebruikt voor het oogsten van de epitheliale cellen van de enkele blaas, en een capillair die werd getrokken te dun (en dus gescheiden in twee stukken) weergegeven. Een 15 cm liniaal wordt geplaatst aan de onderkant van het beeld voor schaal. De geschatte punt voor magnetisch uitlijnen uit het bruikbaar capillair wordt aangeduid op de figuur met de rode pijl. (B)-foto genomen met een ontleden Microscoop bevestigen de holle inwendige diameter van een getrokken capillair (onder). Een unpulled capillair is gepositioneerd boven om aan te tonen het verschil van de relatieve grootte van de twee haarvaten. Schaal bar = 4.0 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2 : Dissectie van de muis om te oogsten van de epitheliale cellen van de blaas. (A) een afbeelding van een muis met witte lijnen toegevoegd om aan te geven van de geschatte locatie en hoek van insnijdingen bloot de lymfkliertest peritoneale Holte en blaas. (B) een beeld van de blootgestelde muis peritoneale holte na insnijding. (C) een beeld van de blootgestelde blaas (rode pijl) uitsteken tussen de dikke pads. (D) een beeld van de lymfkliertest blaas met het topje van de verlostang ingevoegd in het lumen, met pijlen om aan te geven van de richting van de beweging die nodig zijn voor het omkeren van de blaas. De blaas wordt eerst getrokken iets naar buiten, dan rond en uit de eerste as van de verlostang. De aanwijzingen van de beweging voor beide acties zijn zoals aangegeven door witte pijlen met nummers 1 en 2. (E) een afbeelding toont het definitieve standpunt van de omgekeerde blaas ingevoegd op de tweede as van de verlostang. De schachten van de verlostang worden aangeduid in beide deelvensters D en E met rode pijlen en tekst. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3 : IBC oogsten van cellen van de blaas. (A) een besmette en omgekeerde blaas in koude PBS oplossing vóór cel schrapen. (B) een afbeelding toont geschraapt cellen van de blaas zoals gezien onder een microscoop. IBC's kunnen worden geïdentificeerd als grote groene fluorescerende aggregaten in beide afbeeldingen (zie rode pijlen). (C) een beeld van de voltooide mond micropipetting apparaat. De pipet zuigen, pipette uiteinde, aspirator buis en getrokken capillair zijn geïdentificeerd met genummerde pijlen zoals aangegeven op het recht. (D) een beeld van een enkele geïsoleerde IBC binnen een collectie 1,5 mL tube (aangegeven in rood). Schaal bars (zoals aangegeven) worden vertegenwoordigd door witte lijnen in panelen A, B en D. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4 : Geoogste IBC's zuiver zijn en kan worden gebruikt voor downstream analyse. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Duraiswamy et al.¹⁸. (A) beelden van twee geïsoleerde GFP-positieve cellen die werden gekleurd met anti-uroplakin en anti -E.coli antilichamen. De eerste cel (IBC 1) heeft beelden van afzonderlijke kanalen (bij lage-vergroting) aan de linkerkant, en de samengevoegde afbeelding van een high-vergroting ligt aan de rechterkant. De tweede cel (IBC 2) wordt weergegeven in de hoge vergroting in samengevoegde en afzonderlijke kanalen. Schaal bars zijn zoals aangegeven. DNA is gekleurd met 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) en vertegenwoordigd in het blauwe kanaal. Anti -E. coli is gekleurd met een secundair antilichaam geconjugeerd met fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) en vertegenwoordigd in het groene kanaal. Anti-uroplakin is gekleurd met een secundair antilichaam geconjugeerd met tetramethylrhodamine-isothiocyanaat (TRITC) en vertegenwoordigd in het rode kanaal. (B) bacteriële CFUs van geïsoleerde IBC's. IBC's werden direct verwerkt, of geïncubeerd in 0,1% Triton-X voor 10 of 30 min. gebundeld CFU graven van individuele IBC's geïsoleerd van n = 3 aparte experimenten worden weergegeven. Aantoonbaarheidsgrens = 0.7 log₁₀ CFUs/IBC. Rode stippen uitgezet op de grens van detectie geven monsters waarvoor geen kolonies werden teruggevonden. Alle IBC-bevattende monsters zijn niet significant verschillend (p > 0,05, Mann-Whitney-test); de niet-geïnfecteerde epitheliale cellen zijn sterk afwijkt van de IBC (10 min) gegevens (p < 0.001, Mann-Whitney-test). (C) de kwantificering van de qPCR van bacteriën op individuele IBC's en niet-geïnfecteerde epitheliale cellen na een incubatie 10 min in 0,1% Triton-X (*, p < 0,0001, Mann-Whitney test, n = 4). Aantoonbaarheidsgrens = 1,18 log₁₀ bacteriële genoom equivalenten/IBC. Rode punten geven aan monsters waarvoor geen kolonies werden teruggevonden op titering in deelvenster B. (D) kwantificering van het 16S rRNA, cyoB, en frdA genen voor verschillende aantallen individueel geïsoleerd en gegroepeerde IBC's (n = 1 experiment; elk punt geeft het gemiddelde van 3 technische replicatieonderzoeken). NC = geen negatieve controle van DNA. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 5 : Een schema en de bijbehorende foto's vertegenwoordigen de isolatie van IBC's via mond micropipetting van besmette muizen blazen. Dit cijfer is gereproduceerd van Duraiswamy et al.¹⁸. (A) A geoogst hele blaas; (B) een omgekeerde hele blaas bloot het GFP uiting van IBC's; (C) een close-up van de rand van een geschraapt blaas tonen van individuele IBC's in suspensie in de aangrenzende buffer; (D) een honkslag geïsoleerd IBC afgepipetteerde in een buis. Rode pijlen in deelvenster B geven aan voorbeelden van GFP-positieve IBC's op het luminal oppervlak van de blaas. De rode stippellijn in deelvenster C geeft aan de rechterrand van de omgekeerde blaas (aangegeven als 'BL'); rode pijlen in deelvenster C geven aan duidelijk afzonderlijke GFP-positieve epitheliale cellen zijn van het oppervlak van de blaas afgeschraapt hebben. Witte gestippelde lijn in deelvenster D geeft een micropipetted sub-microliter droplet met een geïsoleerde IBC, die wordt aangegeven door een witte pijl. Schaal bars = 2 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussie

Het protocol dat wij hebben beschreven staat voor de isolatie van één IBC's uit een lymfkliertest model van UTI. Dit protocol isoleert IBC's met haalbare intracellulaire bacteriën, die kunnen worden geverifieerd door het kweken voor kve. De resultaten van de protocol bij intracellulaire bacteriën van IBC's met weinig verontreiniging door extracellulaire bacteriën, waardoor verdere karakterisering van beide bacteriën en gastheer van de cel van een IBC (Figuur 4C). Laten we ook zien dat de bacteriën uit een enkele IBC kunnen worden gebruikt in downstream toepassingen zoals qPCR (Figuur 4C), wat suggereert dat onze techniek kan worden gebruikt om proces IBC's voor andere in vitro analyses. Door het bundelen van de bacteriën geoogst uit zo weinig als 5 IBC's, we verder laten zien ons vermogen om qRT-PCR-analyses uit te voeren op drie bacteriële genen, suggereren dat goede kwaliteit RNA kan worden geoogst van de bacteriën in onze geïsoleerde IBC's (Figuur 4D). Gecombineerd, de gegevens die we hebben laten zien aangeven dat het uitvoeren van genoom-brede analyse van de RNA (zoals RNA sequencing) op één IBC's mogelijk met behulp van deze isolatie-techniek kan zijn.

In dit protocol hebben we gericht op het punt 6 h tijd want dat is bij IBC nummers piek in het blazen van zwarte 6 muizen geïnfecteerd door UTI89²⁷. Bovendien hebben we ook een statische bacteriecultuur systeem gebruikt ter verbetering van het niveau van type 1 pilus expressie in UTI89. De expressie van type 1 pilus is essentieel voor E. coli te hechten aan en blaas epitheliale cellen²⁸te infecteren. Deze expressie is strak gereguleerde²⁹ echter en milieu signalen zijn gekend om te veranderen het³⁰. Teneinde een consistente infectie fenotype en een voldoende aantal IBC's, raden we een 2 x 24 h statische bacteriecultuur (licht gewijzigd van Hung et al.⁸) en het tijdstip van 6 h infectie wanneer werken met eerder E. coli getest stammen zoals NU14 en UTI89^28,29. Het is echter mogelijk dat deze variabelen worden aangepast in andere soorten van UTI of in andere soorten muizen moeten te verkrijgen van het ideale aantal IBC's van elke infectie.

Het protocol van Hung et al.⁸ gebruikt alleen vrouwelijke muizen, zijn andere vastgestelde protocollen voor de vaststelling van urineweginfectie bij mannelijke muizen gerapporteerde³¹geweest. In dit model gevolgd blaasontsteking bij mannelijke muizen ook het IBC-traject. Zoals het blazen van mannelijke en vrouwelijke muizen vergelijkbaar in grootte zijn, verwachten wij dat onze IBC isolatie protocol kan worden gebruikt op besmette mannelijke muizen als goed.

De relatief eenvoudige technologie gebruikt in dit protocol zorgt er ook voor dat het kan worden ingezet in de meeste laboratoria. Een van de belangrijkste stappen die betrokken zijn bij dit protocol is het trekken van glas haarvaten maken microcapillaries voor het selecteren van het celtype van belang. Deze stap zorgt voor flexibiliteit in de diameters van microcapillaries gemaakt, en dus de methode kan worden uitgebreid naar meerdere soorten van de cellen van de verschillende doelgroepen. Echter, als gevolg van de inherente variatie in het creëren van deze capillairen, moet worden gezorgd om ervoor te zorgen dat de definitieve diameter in een bruikbare bereik. Als de haarvaten te smal, verzuimen te halen van de cel van belang, maar als ze te breed zijn gemaakt, meerdere cellen kunnen worden geselecteerd in een enkele poging. Bovendien draagt het gebruik van een open vuur tijdens het proces van de capillaire trekken een inherent risico van brandwonden en brand, zodat de onderzoeker probeert te maken van de microcapillaries zorgen moet om te voorkomen dat dergelijke gebeurtenissen die zich voordoen. Om de variabiliteit evenals de open brandgevaarlijk zijn betrokken bij het maken van deze haarvaten, de onderzoeker kon maken gebruik van een traditionele micropipet trekken machine, zoals die worden gebruikt voor elektrofysiologische experimenten (bijvoorbeeld PC-100, Narishige groep). Aangezien deze machines maken gebruik van de zwaartekracht of robotic platforms te trekken van de haarvaten, zij kunnen worden aangepast aan de behoeften van het model van de infectie. De brede waaier van micropipet machines beschikbaar trekken betekent echter dat de individuele onderzoeker zal moeten gaan via bepaalde trial and error om te bepalen van de juiste definitieve capillaire diameter voor gebruik met dit protocol.

Het gepresenteerde protocol maakt gebruik van bacteriën die uiting geven aan een fluorescerende tag om visueel identificeren de IBC. Dus, deze techniek wordt beperkt door de onderzoekers kunnen de besmettelijke organisme genetisch te wijzigen. Speciaal voor UPEC, zijn IBC-vormende stammen zoals CFT073 en NU14 met succes veranderd met GFP-uiten plasmiden^32,33,34; Daarom moet deze geschikt voor gebruik in hetzelfde protocol. Gebaseerd op het gebied van de muis blaas (70 mm²)³⁵, de lengte van de afzonderlijke epitheliale cellen (50-120 µm)¹⁷en de frequentie van de IBC's in een enkele blaas¹⁶, een conservatieve schatting voor de incidentie van IBC's is over 1 in 1000 cellen (of 0,1%). Deze raming toont het nut van onze cel isolatie protocol te richten op zeldzame gebeurtenissen. De precisie van de celselectie via onze protocol en het brede scala van capillaire diameters die kan worden getrokken suggereren dat dit protocol kan worden gebruikt om te isoleren van de intracellulaire bacteriën van andere modellen van het in vivo en in vitro van infectie. Inderdaad, hebben we met succes deze techniek gebruikt om te isoleren van de epitheliale cellen van de besmette gekweekte blaas (gegevens niet worden weergegeven).

Een van de meer technisch uitdagende stappen in het protocol is het omkeren van de blaas om de epitheliale cellen voor schrapen bloot te stellen. We hebben gemerkt dat het ook mogelijk te maken van een sneetje op de blaas aan splay het uit voor het schrapen. Maar die zorg moet worden genomen ter beperking van de schade aan de epitheliale cellen van de blaas tijdens het proces van snijden open; ideaal moet een enkele snede worden gebruikt om de blaas open splay. Bovendien moet de cut in koude PBS, ter voorkoming van verlies van cellen of blaas weefsel tijdens het proces worden gemaakt.

Mond pipetteren van de IBC's in dit protocol biedt meer controle over het selectieproces van de cel, evenals het beperken van het uiteindelijke volume van de oplossing samen met de cel overgedragen. De fijne controle en de grote scheiding van de oplossing van de onderzoekers mond maximaliseert ook de veiligheid van de onderzoeker, zoals de volumes overgedragen zijn binnen de nanoliter microliter bereik. Onze ervaring met de moderne micropipet is daarentegen dat het de neiging om meer omliggende vloeistof en cellen met de IBC, potentieel leiden tot verontreiniging met extracellulaire luminal bacteriën overbrengen. Onze bevinding dat mond pipetteren een hogere prestaties over andere eencellige isolatie methoden biedt is ook gemeld door andere laboratoria^22,23,24. Afgezien van enkele cel isolatie, is mond pipetteren zelfs gebruikt in eencellige electroporation voor neuronen²⁵, die verder toont het nut en de minuut controle die een getrainde onderzoeker met de techniek bereiken kan. Veiligheid is van primair belang echter, en wij stellen eventuele aanvullende maatregelen die kunnen worden genomen, afhankelijk van de ziekteverwekkers wordt gebruikt voor: (i) de uitbreiding van de buffer van de lucht tussen de onderzoeker en het biologisch materiaal, bijvoorbeeld met behulp van een zuigen Pipetteer met een groter volume (bijvoorbeeld 5 mL), of (ii) het toevoegen van een fysieke filter zoals katoen, wol in de zuigen pipet om op te treden als een extra barrière.

In gevallen waar een risicobeoordeling tot de conclusie leidt dat mond pipetteren nog steeds te riskant is, kunnen verkrijgbare robotic opstellingen (zoals die worden gebruikt voor nanoinjections) worden gecombineerd met de andere gedeelten van onze techniek om een veiligere methode voor isoleren van geïnfecteerde cellen van gemengde bevolkingsgroepen. Opgemerkt moet worden dat onze ervaring met het gebruik van een robotachtige micromanipulator blijk heeft gegeven van een verminderde tarief van IBC isolement ten opzichte van mond pipetteren, zoals de grote intra experimentele variatie van de grootte van de epitheliale cellen van de blaas het uitdagend voor de gebruiker maakt van een robotachtig wapen om te bepalen van de kracht die nodig is te halen enkele IBC's. Toch blijft het een haalbare, hoewel duurder, optie voor degenen die werken met zeer besmettelijke agentia van ziekte.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1.5 mL eppendorf tube			Voor statische bacteriële cultuur en OD-meting
100% ethanol			Voor Alcoholbrander
15 mL conische buis			Voor statische bacteriële cultuur en OD-meting
1 mL Tuberculin-spuit	BD Biosciences	302100
3% Bacteriële Agar			Voor statische bacteriële cultuur en OD-meting
70% ethanol			Voor statische bacteriële cultuur en OD-meting
Aesculap anatomisch tang	Braun/Kruuse	BD222R	Voor initiële dissectie van muis (huid, fascia)
Alcoholbrander	Wheaton	237070
Aspirerende pipet	BD Biosciences	357558
Aspiratiebuis	Sigma-Aldrich	A5177
Bacteriele lussen			Voor statische bacteriële cultuur en OD-meting
Benchtop centrifuge	Eppendorf	5424	Elke centrifuge voor 1.5ml eppendorf buisjes
Conische kolven			Voor statische bacteriële cultuur en OD-meting
Digitale camera voor microscoop	Olympus	DP71	Voor beeldvastlegging en het oogsten van IBC's. Elke andere fluorescente microscoop met een GFP-kanaal is voldoende
Glazen capillairen	Kimax	6148K07
Iris Schaar STR SS 110MM	Braun	BC110R
Isofluraan (Isothesia)	Henry Schein Animal Health	29405
Kanamycin Sulfaat	Calbiochem	420311	Voor statische bacteriële cultuur en OD-meting
LB bouillon (Miller)	Thermo/Gibco	10855021	Voor statische bacteriële cultuur en OD-meting
Lichtbron voor microscoop	Olympus	LG-PS2	Voor beeldvastlegging en het oogsten van IBC's. Elke andere fluorescente microscoop met een GFP-kanaal is voldoende
Smeermiddel	KY		Elke vergelijkbare commerciële medische smering is voldoende
Macro fluorescentiemicroscoop	Olympus	MVX10	Voor beeldvastlegging en het oogsten van IBC's. Elke andere fluorescente microscoop met een GFP-kanaal is voldoende
Micropipet + micropipet tips			Voor statische bacteriële cultuur en OD-meting
PBS 1x			Voor statische bacteriële cultuur en OD-meting
Pipetregelaar + Pipetten			Voor statische bacteriële cultuur en OD-meting
Polyethyleen Buizen	BD Intramedic	427401
Precision Glide naald 30 G	BD Biosciences	305107	Mogelijk onder nieuw catalogusnummer (305106)
Splintertang gekromd	Braun	BD312R
Spuitfles (voor ethanol)			Voor statische bacteriële cultuur en OD-meting
Vierkante cuvetten	Elkay	127-1010-400	Voor statische bacteriële cultuur en OD-meting
Sterilgard III Advance Veiligheidskast	Baker	SG403	Elke bioveiligheidskast met een UV-irradiator
Sterilin 90mm Standaard Petri Schaal	Thermo	101VR20	Elke steriele petrischaal
Stevens, vaat- en peesschaar, gebogen, delicaat, 110 mm	Braun	OK366R	Aanbevolen voor het oogsten van blaas
Chirurgische schaar STR S/B 105MM	Braun	BC320R
Tabel Centrifuge	Eppendorf	5810R	Elke gekoelde centrifuge voor 15ml conische buizen
WPA C08000 celdichtheid meter	Biowave (Biochrom)	80-3000-45	Voor statische bacteriële cultuur en OD-meting