Gelijktijdige metingen van intracellulair Calcium en membraanpotentiaal in vers geïsoleerd en Intact muis cerebrale endotheel

Samenvatting

Hier gedemonstreerd zijn protocollen voor het isoleren van (1) vers intact cerebrale endothelial "buizen" en (2) gelijktijdige metingen van endothelial calcium en membraanpotentiaal tijdens endotheel afkomstige hyperpolarisatie. Verder, deze methoden toestaan voor farmacologische tuning van endothelial cel calcium en elektrische signalering als individuele of interactieve experimentele variabelen.

Samenvatting

Cerebrale bloedvaten en hun respectieve microcirculatie leveren zuurstof en voedingsstoffen naar de hersenen via bloed stroom verordening. Endotheliale cellen lijn het lumen van de bloedvaten en de opdracht wijzigingen in vasculaire diameter desgewenst de metabole vraag van neuronen te voldoen. Primaire endotheel-afhankelijke signaalroutes voor hyperpolarisatie van de membraanpotentiaal (V,_m) en stikstofmonoxide werken meestal parallel aan bemiddelen vaatverwijding en daardoor de bloedtoevoer. Hoewel integraal te coördineren vasodilatatie over enkele millimeters van vasculaire lengte, onderdelen van endotheel afkomstige hyperpolarisatie (EDH) historisch moeilijk geweest te meten. Deze onderdelen van EDH inhouden intracellulaire Ca^{2 +} [Ca^{2 +}]_ik verhoogt en verdere activering van kleine - en middenniveau huidgeleiding Ca^{2 +}-geactiveerd K⁺ (SK_Ca/IK_Ca) kanalen.

Hier presenteren we een vereenvoudigde afbeelding van het isolement van verse endotheel van muis cerebrale bloedvaten; gelijktijdige metingen van endothelial [Ca^{2 +}]_ik en V_m met Fura-2 fotometrie en intracellulaire scherpe elektroden, respectievelijk; en een continue superfusion van zoutoplossingen en farmacologische agenten onder fysiologische omstandigheden (pH 7.4, 37 ° C). Posterieure cerebrale bloedvaten uit de cirkel van Willis worden verwijderd vrij van de posterieure communiceren en de arteria slagaders. Enzymatische spijsvertering van schoongemaakte posterieure cerebrale arteriële segmenten en latere verpulvering vergemakkelijkt verwijdering van adventitia, gerelateerde zenuwen en zachte spiercellen. Resulterende posterieure cerebrale arteriële endothelial "buizen" vervolgens onder een Microscoop zijn beveiligd en onderzocht met behulp van een camera, fotomultiplicator, en één of twee elektrometers terwijl onder continue superfusion. Collectief, kan deze methode gelijktijdig wijzigingen in endotheel [Ca^{2 +}]_ik en V_m in discrete cellulaire locaties, naast de verspreiding van EDH via gap kruispunten tot millimeter afstanden langs de intact meten endotheel. Deze methode wordt verwacht dat het rendement van een high-throughput analyse van de onderliggende mechanismen van bloed stroom verordening in de hersenen van normale en zieke endothelial hersenfunctie.

Inleiding

Doorbloeding in de hersenen wordt geregeld door de coördinatie van vasodilatatie onder cerebrale bloedvaten en arteriolen in vasculaire netwerken¹. Endotheliale cellen voering cerebrale weerstand slagaders commando veranderingen in vasculaire diameter als nodig is om de metabole vraag van neuronen^1,2,3te voldoen. In het bijzonder tijdens endotheel afkomstige hyperpolarisatie (algemeen bekend als EDH), intracellulaire Ca^{2 +} ([Ca^{2 +}]_ik) en elektrische signalering in de coördinaat vasodilatatie endotheliale cellen onder endotheliale cellen en hun omliggende zachte spiercellen via gap kruispunten voor arteriële ontspanning⁴. Fysiologische inleiding van EDH inhoudt achtereenvolgens stimulatie van de G_q-receptoren (GPCRs), een toename van [Ca^{2 +}]_iken activering van endothelial kleine - en intermediair-Ca^{2 +}combinatie-geactiveerd K⁺ (SK_Ca/IK_Ca) kanalen aan cerebrale endothelial membraan potentiële (V,_m)^5,6,7hyperpolarize. Dus is de intieme relatie van endothelial [Ca^{2 +}]_ik en V_m integraal aan de bloed stroom verordening en onontbeerlijk voor cardio- en cerebrovasculaire functie^6,8. In de bredere literatuur, tal van studies hebben melding gemaakt van de associatie van vasculaire endothelial dysfunctie met de ontwikkeling van chronische ziekten (bijvoorbeeld hypertensie, diabetes, hartfalen, coronaire hartziekten, chronisch nierfalen, ziekte van de perifere slagader)^9,10, waarin het belang van het bestuderen van endothelial functie in fysiologische en pathologische omstandigheden.

Vasculaire endotheel is onlosmakelijk verbonden met de productie van hyperpolarisatie, vasodilatatie en perfusie van het weefsel en dus, onderzoek van de inheemse cellulaire eigenschappen is van cruciaal belang. Als een algemene studie-model, is voorbereiding van de arteriële endothelial buis muismodel gepubliceerd vóór voor skeletspieren^11,12, gut¹³, Long¹⁴, en onlangs de hersenen⁶. Studies van gelijktijdige [Ca^{2 +}]_ik en V_m metingen zijn in het bijzonder gepubliceerd voor skeletspieren arteriële endotheel^15,16 , alsmede lymfatische vaartuig endotheel¹⁷. Naast primaire studies gebruik te maken van de aanpak van het endotheel buis, kan een algehele herziening van de voor- en nadelen⁸ worden geraadpleegd om te bepalen of deze experimentele rol geschikt voor een specifieke studie is. Kortom, een voordeel is dat de fysiologische kerncomponenten van endothelial cel functie worden bewaard (bv., Ca^{2 +} toestroom en intracellulaire release, hyperpolarisatie van V_m tot de Nernst potentieel voor K⁺ via SK_Ca/IK_Ca activering en endotheel intercellulaire koppeling via de kruispunten van de kloof) zonder verstorende factoren zoals gerelateerde zenuw input, gladde spieren spanning-gated kanaal functie en contractility, omloop van het bloed en hormonale invloeden⁸. Daarentegen gebruikte cel cultuur benaderingen introduceren aanzienlijke veranderingen in de morfologie¹⁸ en ion kanaal expressie¹⁹ op een wijze die sterk vergelijkingen op fysiologische opmerkingen bepaald ex vivo kan verduisteren of in vivo. Beperkingen omvatten een gebrek aan integratie met andere essentiële onderdelen voor de regulering van de doorbloeding, zoals de gladde spieren en beperkte flexibiliteit in een experimentele planning, als dit model optimaal binnen de 4 uur van intact vasculaire segment isolatie getest is van het dier.

Gebouw uit een vorige video protocol geschreven door Socha en Segal¹² en recente experimentele ontwikkelingen in de tussentijdse^6,15,16, wij hierbij laten zien dat de isolatie van verse endotheel van posterieure cerebrale bloedvaten en gelijktijdige metingen van endothelial [Ca^{2 +}]_ik en V_m met Fura-2 fotometrie en intracellulaire scherpe elektroden, respectievelijk. Dit experiment houdt bovendien continu superfusion van zoutoplossingen en farmacologische agenten tijdens de fysiologische omstandigheden (pH 7.4, 37 ° C). We kozen de posterieure cerebrale slagader, zoals het levert geïsoleerde endotheel met de structurele integriteit (cellen gekoppeld via gap kruispunten) en voldoende afmetingen (breedte ≥50 µm, lengte ≥300 µm) vatbaar voor intra- en intercellulaire signalering langs en onder endotheliale cellen. Bovendien, studies van de knaagdier posterieure cerebrale slagader zijn sterk vertegenwoordigd in de literatuur en omvatten onderzoek van fundamentele endothelial signalering mechanismen, vasculaire ontwikkeling/veroudering en pathologie^{20, 21 , 22}. deze experimentele toepassing wordt verwacht rendement van een analyse van de high-throughput of cerebrale endothelial functie (dysfunctie) en zal daardoor zorgen voor aanzienlijke vooruitgang in het begrip van bloed stroom verordening gedurende veroudering en de ontwikkeling van neurodegeneratieve ziekte.

Protocol

Voordat de volgende experimenten uitvoeren, ervoor zorgen dat alle dierenverzorgers gebruiken en protocollen zijn goedgekeurd door de institutionele dier zorg en gebruiken Comité (IACUC) en uitgevoerd in overeenstemming met de National Research Council de " "gids voor de zorg en het gebruik van Proefdieren '' (8^th Edition, 2011) en de richtsnoeren voor het aankomen. De IACUC van de Loma Linda University heeft ingestemd met alle protocollen die worden gebruikt voor dit manuscript voor mannelijke en vrouwelijke C57BL/6 muizen (leeftijd bereik: 3 tot 30 ma).

1. apparatuur en materiaal

Opmerking: Details van materialen die nodig zijn voor het protocol kunnen worden gevonden in de Tabel van de materialen, reagentia, en handleidingen of websites die zijn gekoppeld aan de respectieve leveranciers.

1. Flow kamer
   1. Zet een superfusion kamer met een dekglaasje aan glazen bodem vast in een geanodiseerde aluminium platform. Beveilig het platform met kamer in een compacte aluminium stadium.
   2. Stel een micromanipulator aan elk uiteinde van het platform op het podium van de aluminium voor het houden van de pinning pipet.
      Opmerking: Als een praktische optie, gebruik dit apparaat overdraagbaar fase met een stroom kamer eenheid beveiligd ter vergemakkelijking van de overgang van isolatie van het endotheel buis naar de prestaties van de experimenten.
2. Microscopen
   1. Gebruik stereomicroscopes (5 x 50 x vergroting bereik) uitgerust met fiber optic lichtbronnen voor macro - en micro-dissectie procedures.
   2. Voor voorbereiding van endothelial buizen, gebruikt u een omgekeerde Microscoop uitgerust met fase contrast of differentieel interferentie contrast (DIC) compatibele doelstellingen (10 x, 20 x en 40 x) en een aluminium stadium.
   3. Plaats een microsyringe pomp controller om te isoleren endothelial buizen uit gedeeltelijk verteerd bloedvaten, grenzend aan het endotheel buis voorbereiding apparaat.
   4. Gebruik voor het experimentele apparaat, een omgekeerde Microscoop uitgerust met standaard doelstellingen (4 x en 10 x) naast fluorescerende doelstellingen (20 x en 40 x, numerieke diafragma 0,75) en een handmatige aluminium podium op een vibratie isolatie tafel.
3. Intracellulaire controleapparaat
   1. De V_m van endotheliale cellen opnemen in geïsoleerde endothelial buizen verbinden met de elektrometer de compatibele headstage. Indien nodig, een functiegenerator of stimulator verbinding te maken met de elektrometer voor experimenten die huidige injectie nodig.
   2. Sluit de uitgangen van de versterker aan een data-acquisitiesysteem, hoorbare basislijn beeldschermen en een oscilloscoop. Beveilig de referentie-elektrode (Ag/AgCl pellet) in de buurt van de afrit van de kamer stroom tijdens experimenten.
   3. Gebruik een fotometrische systeem met geïntegreerde componenten een fluorescentie systeem interface, of hoge intensiteit booglamp en macht levering, hyperswitch, fotomultiplicator (PMT), en de camera om te meten [Ca^{2 +}]_ik in endotheliale cellen.
   4. Gebruik je een temperatuur controller voorzien van een inline-kachel te verhogen en houden een fysiologische temperatuur (37 ° C) gedurende het gehele experiment.
   5. Gebruik een zes-reservoir platform aangesloten op de controller van een ventiel met een inline flow control ventiel om de levering van de respectieve oplossingen aan de endothelial buis beveiligd in de zaal.
4. Micropipetten en scherpe elektroden
   Opmerking: Voor de vervaardiging van pipetten voor verpulvering en de mechanische stabilisatie van geïsoleerde endothelial buizen, gebruik van een elektronische trekker voor het trekken van de pipetten en een micro-forge voor breken en vuur polijsten.
   1. Als u wilt scheiden adventitia, gladde spieren en het endotheel buis uit het gedeeltelijk verteerd arteriële segment, verpulvering pipetten (elk met een uiteinde van de interne diameter van 80-120 µm) in voorkomend geval, met behulp van borosilicaatglas capillaire buisjes, voor te bereiden en vuur Pools de tip.
   2. Om de endothelial buis tegen de bodem van de superfusion kamer, vastmaken pipetten te gebruiken met een afgestompte, sferische einde (warmte-gepolijst, OD van 100 – 150 µm; bereid uit dun-muur borosilicaatglas buizen).
   3. Registreren V_m van een endothelial cel, bereiden scherpe elektroden met een weerstand van de tip van ~ 150 ± 30 MΩ van glazen capillaire buizen met behulp van een elektronische trekker.

2. bereiding van de oplossingen en Drugs

1. Fysiologische zoutoplossing (PSS)
   1. Voor een experiment met drug voorbereidingen, bereiden een minimum van 1 L van het gebruik van de PSS: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic zuur (HEPES) en 10 mM glucose.
   2. De vereiste oplossingen om voor te bereiden dissectie, bereiden isolatie van cerebrale slagader, en voorbereiding van de buis van het endotheel, PSS CaCl₂ (nul Ca^{2 +} PSS) ontbreekt.
   3. Bereiden alle oplossingen in ultrazuiver gedeïoniseerd H₂O en breng de pH op 7.4, hen te steriliseren door een filter (0,22 µm poriegrootte) ervoor zorgen dat de osmolaliteit van de oplossingen tussen 290 en 300 mOsm is.
      Opmerking: Oplossingen kunnen worden achtergelaten bij 4 ° C gedurende ongeveer twee weken.
2. 10% bovien serumalbumine (BSA)
   1. Los 1 g van het gelyofiliseerd poeder in een bekerglas van 10 mL nul Ca^{2 +} PSS als voorbereiding hierop 10% BSA.
   2. Dek het bekerglas af met paraffine film en laat een periode van enkele uren te geven, met langzaam roeren voor de BSA te ontbinden.
   3. Filtreer de definitieve oplossing met een 10 mL spuit plus een 0,22 µm filter en maak van 1 mL aliquots worden opgeslagen bij-20 ° C.
3. Dissectie oplossing
   1. Ter voorbereiding van dissectie 50 mL, voeg toe 500 µL van BSA (10%) aan 49,5 mL nul Ca^{2 +} PSS.
   2. Breng deze dissectie-oplossing in een petrischaal voor arteriële dissectie onmiddellijk na bereiding.
4. Dissociatie oplossing
   1. Ter voorbereiding van dissociatie 50 mL, voeg 5 µL CaCl₂ (1 M) en 500 µL van BSA (10%) aan 49,5 mL nul Ca^{2 +} PSS. Laat de oplossing om te zitten bij kamertemperatuur (RT).
5. Enzymen
   1. Voor een gedeeltelijke vertering van de arteriële segmenten, bereiden 1 mL van spijsvertering oplossing met papaïne 0.31 mg/mL, 0,5 mg/mL dithioerythritol, 0,75 mg/mL collagenase (Type H mix) en elastase 0.13 mg/mL.
      Opmerking: Enzym activiteiten kunnen variëren; echter, voor onze succesvolle protocollen, commercieel meegeleverde enzym activiteiten hebben gebruikt als volgt: papaïne ≥10 eenheden/mg; Collagenase ≥1 eenheden/mg, voor N-[3-(2-Furyl)acryloyl]-Leu-Gly-Pro-Ala of FALGPA substraat omzet; en elastase ≥ 5 eenheden/mg.
6. Voorbereiding van Fura-2 en farmacologische agenten
   1. Bereiden van voorraad concentratie (1 mM) voor Fura-2 AM kleurstof in DMSO. Bereiden een werkende concentratie (10 µM) door toevoeging van 5 µL van voorraad aan 495 µL van PSS voor laden.
   2. Bereiden ≥50 mL concentraties van farmacologische agenten (bijvoorbeeld ATP) werken in PSS zo nodig.
7. Uitvoeren van de oplossing
   1. Bereiden een dirigent oplossing, 2 M KCl, door het oplossen van KCl in gedeïoniseerd H₂O (7.455 g KCl in 50 mL H₂O).
   2. Filtreer de oplossing door een 0,22 µm spuit filter voorafgaand aan backfilling de scherpe elektroden.
8. Propidium jodide (0,1%)
   1. Los 10 mg gelyofiliseerd propidium jodide in 10 mL 2 M KCl.
   2. Meng goed en op te slaan op RT.

3. dissectie en isolatie van cerebrale slagader

Opmerking: Alle dissectie procedures vereisen specimen vergroting (50 x) via stereomicroscopes en verlichtingssterkte van fiber optic lichtbronnen. Dissectie u procedures alleen uitvoeren voor isolatie van de hersenen en bloedvaten, scherp dissectie instrumenten te gebruiken. Microdissection tools te isoleren en schoon slagaders omvatten scherp boete-tipped pincet en Vannas stijl dissectie schaar (3 tot en met 9.5 mm bladen).

1. Isolatie van muis hersenen
   1. Anesthetize een C57BL/6 muis (3-30 maanden oud; mannelijk of vrouwelijk) via inhalatie van Isofluraan (3% voor 2-3 min), dan het dier onmiddellijk na volledige inductie van de anesthesie te onthoofden. Plaatsen van het hoofd in een petrischaal (diameter 10 cm, diepte 1,5 cm) die koud (4 ° C) bevat nul Ca^{2 +} PSS onder een stereomicroscoop.
   2. Bekeken door de Microscoop, verwijder de huid en de haren over de schedel en buitensporige bloed met koude nul Ca^{2 +} PSS. Maak een incisie met behulp van alleen de toppen van standaard dissectie schaar (bijvoorbeeld 24 mm mes), beginnend met het occipitale bot en uitbreiding omhoog door het nasale bot van de schedel.
   3. Open de schedel zorgvuldig langs de incisie met behulp van grof-tipped pincet en aparte bindweefsel te isoleren van de hersenen met een intact cirkel van Willis.
      Opmerking: Als alternatief, Littauer bot-snijden pincet kan worden gebruikt om te openen de schedel en het blootstellen van de hersenen.
   4. Voorzichtig wassen de geïsoleerde hersenen met koude nul Ca^{2 +} PSS in een bekerglas van bloed verwijderen. Plaats de hersenen ventrale zijde naar boven in een cupje met koude dissectie oplossing voor isolatie van de cerebrale bloedvaten (figuur 1A).
2. Isolatie van de cerebrale bloedvaten
   Opmerking: De achterste cerebrale slagader is geselecteerd als een representatieve cerebrovasculaire endothelial studie model voor dit protocol.
   1. Beveiligen van de geïsoleerde hersenen in koude dissectie oplossing met behulp van roestvrij stalen pinnen (diameter 0.2 mm, lengte ~ 11-12 mm) in een houtskool-geïnfundeerd silicon polymeer coating onder (diepte ≥50 cm) in een glazen petrischaaltje moet worden ingevoegd.
   2. Gebruiken om te handhaven een gekoeld temperatuur van PSS tijdens dissectie, een kamer van de dissectie gekoeld door een koelmiddel systeem continu fietsen een 1:1 water-ethyleen glycol mengsel. Als alternatief, dissectie kan worden uitgevoerd op vers ijs.
   3. Operatief isoleren de posterieure cerebrale slagaders (~0.3 0.5 cm segmenten, geen axiale spanning) de posterieure communiceren en de arteria slagaders met behulp van microdissection instrumenten Vannas stijl schaar en scherp boete-tipped pincet (figuur 1B ). Gebruik van roestvrij stalen pinnen (diameter 0.1 mm, lengte ~ 13-14 mm) om veilige zowel geïsoleerd posterieure cerebrale bloedvaten in de oplossing van de dissectie in de petrischaal (Figuur 1 c).
   4. De geïsoleerde posterieure cerebrale bloedvaten zorgvuldig schoon door het verwijderen van bindweefsel met behulp van aangescherpte boete-tipped pincet (Figuur 1 d). Snijd intact slagaders in segmenten (lengte 1 – 2 mm) voor enzymatische spijsvertering (Figuur 1 d; inzet).

4. voorbereiding van Endothelial buis en Superfusion

Opmerking: De endothelial buis is bereid zoals eerder beschreven¹², met wijzigingen voor de cerebrale slagader⁶.

1. Het apparaat van de verpulvering met behulp van een microscoop voorzien van doelstellingen (10 x, 20 x en 40 x), een camera en een aluminium stadium holding een kamer en micromanipulators voor te bereiden. Veilig een microsyringe met een pomp controller grenst aan het podium en het model (figuur 2A).
2. Volledig aanvulling funderingsput een verpulvering Pipetteer met minerale olie en veilig over de micro-spuit-zuiger. Vervolgens met behulp van de micro-spuit met pomp controller, trekken dissociatie oplossing in de Pipet (~ 130 nl) op de top van de minerale olie waarbij de afwezigheid van luchtbellen in de pipet.
3. Plaats intact arteriële segmenten in 1 mL van dissociatie oplossing in een 10 mL glazen buis (figuur 2B), met papaïne 0.31 mg/mL, 0,5 mg/mL dithioerythritol, 0,75 mg/mL collagenase en elastase 0.13 mg/mL. Incubeer bij 34 ° C gedurende 10-12 minuten voor een gedeeltelijke vertering.
4. Na de vertering, door het enzym oplossing te vervangen door ~ 5 mL verse dissociatie oplossing. Met behulp van een pipet 1 mL, breng één segment in een cupje met de dissociatie oplossing op RT.
5. Plaats de pipet in de dissociatie-oplossing in de zaal en plaats het dicht bij het ene uiteinde van het verteerd schip. Stelt een tarief binnen het bereik van 2 tot en met 5 nL/s op de pomp controller voor zachte verpulvering (figuur 2C; inzet).
6. Tijdens het bekijken door middel van 100 x 200 x vergroting, trekken en uitwerpen van de arteriële segment om zich te distantiëren van de zachte spiercellen terwijl de productie van een endothelial buis. Gebruik zo nodig zorgvuldig boete-tipped pincet te scheiden van gedissocieerde adventitia en interne elastische lamina van het endotheel buis. Bevestigen dat alle zachte spiercellen zijn losgekoppeld en dat alleen endotheliale cellen als een intact "tube" (figuur 2C blijven).
7. Met behulp van micromanipulators, veilige elk uiteinde van het endotheel buis op de glazen cover slip van de superfusion kamer met behulp van borosilicaatglas pinning pipetten (figuur 2D).
8. Wash-out los adventitia en zachte spiercellen van de kamer en vervang de dissociatie oplossing met 2 mM CaCl₂ PSS. Overdracht van het mobiele platform met beveiligde endothelial buis naar de Microscoop voor superfusion en experimentele rig.
9. Gebruik 6 schone 50 mL reservoirs (figuur 3A) voor continue levering van PSS en respectieve drug oplossingen tijdens het experiment, zo nodig. Gebruik de inline flow control ventiel handmatig in te stellen het debiet in de gehele als consistent met laminaire flow terwijl het overeenkomende stroom voeden tot vacuüm zuiger. PSS aan de zaal (figuur 3B) leveren voor de superfusion van het endotheel buis voor ≥ 5 min voordat de opname van de achtergrondgegevens en kleurstof laden.

5. kleurstof Load, Wash-Out en temperatuurinstellingen

1. Alle onderdelen van de fotometrie systeem voor het meten van [Ca^{2 +}]_ikinschakelen. Kunt de Microscoop op de experimentele tuig (Figuur 3 c) bekijken de endothelial buis 400 x vergroting, en focus op de cellen in de fotometrische venster via fotometrie systeem softwaresuite.
2. Meten van de diameter van het endotheel buis en achtergrond autofluorescence waarden opnemen in overeenstemming is met 510 nm emissie tijdens alternatieve excitatie op 340 en 380 nm (≥10 Hz).
3. Om te meten [Ca^{2 +}]_ik reacties, laden de endothelial buis met Fura-2 ben kleurstof (eindconcentratie is 10 µM) op RT en toestaan ~ 30-40 min in de afwezigheid van licht.
4. Opnieuw opstarten van de superfusion van het endotheel buis met verse PSS voor ~ 30-40 min te wash-out overtollige kleurstof en laat intracellulaire Fura-2 AM to-esterify. Tijdens de wash-out periode, verhogen de temperatuur geleidelijk van RT tot 37 ° C, de temperatuur controller (figuur 3A) met een inline-kachel, dan handhaven bij 37 ° C gedurende het gehele experiment.
   Opmerking: De aanbevolen incrementele overgang tussen RT tot 37 ° C houdt in drie stappen (bijvoorbeeld 5 ° C) met een ≥5 min equilibratietijd bij elke stap.

6. Gelijktijdige meting van [Ca^{2 +}]_Ik en V_m

1. Zet alle andere apparatuur en de elektrometer softwaresuite voor het meten van V_m (Zie Figuur 3, Figuur 4). Gegevenssnelheid verwerving dienovereenkomstig aan te passen (≥10 Hz).
2. Trek een scherpe elektrode en aanvulling van de funderingsput met 2 M KCl. Koppeling via dye overdracht, aanvulling funderingsput-de microelectrodes met 0,1% propidium jodide opgelost in 2 M KCl voor studies van intercellulaire.
3. Beveilig de elektrode via een zilver draad bekleed met chloride in de houder van de pipet gekoppeld aan een elektrometer hoofd stadium beveiligd met een micromanipulator. Gebruik de micromanipulator om te kort plaatsen de tip van de elektrode in de stromende PSS in de kamer terwijl viewing via de doelstelling 4 x.
4. Stel de rust V_m op 0 als consistent met geaarde Bad potentiële. Plaats het uiteinde van de elektrode iets meer dan een cel van het endotheel buis. Indien gewenst, gebruik hoorbaar basislijn monitoren gekoppeld aan elektrometers toonhoogte geluid koppelen aan potentiële opnames.
5. Vergrotingsniveau te 400 x het streven naar 40 x uit en plaats het uiteinde van de elektrode zo nodig. De fotometrische venster met behulp van de fotometrie software focus op ~ 50 tot 80 endotheliale cellen aanpassen.
6. Zachtjes de elektrode in een van de cellen van het endotheel buis met behulp van de micromanipulator plaatsen en wacht ≥2 min voor de rust van de V_m te stabiliseren. Ook het invoegen van een tweede elektrode in een andere cel (afstand ≥100 µm) van de eerste cel gespietst met eerste elektrode.
7. Zodra rusten V_m stabiel bij de verwachte waarden is (-30 tot -40 mV)⁶, draaien op de bet op de interface van de fluorescentie bij gebrek aan licht en verwerving van intracellulaire [Ca^{2 +}]_ik door spannende Fura-2 afwisselend beginnen (10 Hz) op 340 en 380 nm terwijl het verzamelen van fluorescentie emissie bij 510 nm.
   Opmerking: Voor het testen van de intercellulaire elektrische koppeling, huidige (± 0,5-3 nb, ~ 20 s impulstijd) kan worden geleverd via een elektrometer als "Site 1", en wijzigingen van V_m kunnen worden vastgelegd met een ander elektrometer als "Site 2" (afstand ≥100 µm).
8. Zodra de gelijktijdige metingen van V_m en [Ca^{2 +}] en_ik zijn gevestigd, toestaan dat ~ 5 min. voor superfusion van endothelial buis met PSS aan een constante laminaire stroomtarief vóór het aanbrengen van drugs.
9. Toepassing van de drug (bijvoorbeeld ATP) willen de superfusion kamer met het constant debiet in de PSS. Na ~ 3 min (of een periode van tijd geschikt is voor de kinetiek van de drug) terugkeren wassen met PSS tot V_m en de F340/f-ratio met₃₈₀ naar hun uitgangssituatie. Mark respectieve opnamen als stoffelijk gesynchroniseerde over de fotometer en elektrometer software suites tijdens elke overgang van oplossingen.
10. Zodra het experiment wordt gedaan, trekken van de elektrode van de cel met behulp van de micromanipulator en merken V_m ~ 0 mV waarnaar wordt verwezen door de bad-elektrode. Respectieve opnames van V_m en [Ca^{2 +}]_ik stoppen en opslaan van de records op bestand voor data-analyse.

7. visualisatie van cel naar cel koppeling

1. Om te visualiseren van cel naar cel koppeling via propidium jodide, gebruiken een 40 x of 60 x TL doelstelling met een relatief hoge numerieke diafragma (bijvoorbeeld 0,95) en rhodamine filter ingesteld met solid-state verlichting, een high-resolution camera (bijvoorbeeld 16- Megapixels), en een imaging softwaresuite.

Resultaten

De schematische demonstratie van het protocol die hierboven beschreven wordt in de bijgevoegde cijfers weergegeven. Een hersenen van een jonge volwassen mannelijke C57BL/6N muis (5 maanden) geïsoleerd wordt weergegeven in figuur 1A. Posterieure cerebrale bloedvaten zijn zorgvuldig gescheiden van de cirkel van Willis, verwijderd zonder bindweefsel, en snijd in segmenten (figuur 1B-D). Van gedeeltelijk verteerd art...

Discussie

In het licht van recente ontwikkelingen^6,15,16,17tonen we nu de methode om te isoleren muis cerebrale arteriële endotheel in voorbereiding voor gelijktijdige meting van [Ca^{2 +}] _Ik en V_m onderliggende EDH consequent over ~ 2 h bij 37 ° C. Hoewel het technisch moeilijk, kunnen we meten aan-cel koppeling ook (zie referentie⁶, figuur 1). Op d...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Glucose	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	G7021
NaCl	Sigma	S7653
MgCl2	Sigma	M2670
CaCl2	Sigma	223506
HEPES	Sigma	H4034
KCl	Sigma	P9541
NaOH	Sigma	S8045
ATP	Sigma	A2383
HCl	ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)	A466250
Collagenase (Type H Blend)	Sigma	C8051
Dithioerythritol	Sigma	D8255
Papain	Sigma	P4762
Elastase	Sigma	E7885
BSA	Sigma	A7906
Propidium iodide	Sigma	P4170
DMSO	Sigma	D8418
Fura-2 AM dye	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	F14185
Recirculating chiller (Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Scientific	13874647
Plexiglas superfusion chamber	Warner Instruments, Camden, CT, USA	RC-27
Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm)	ThermoFisher Scientific	12-548-5M
Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm)	Warner Instruments	PM6 or PH6
Compact aluminum stage	Siskiyou, Grants Pass, OR, USA	8090P
Micromanipulator	Siskiyou	MX10
Stereomicroscopes	Zeiss, NY, USA	Stemi 2000 & 2000-C
Fiber optic light sources	Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss	Fostec 8375
Nikon inverted microscope	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA	Ts2
Phase contrast objectives	Nikon Instruments Inc	(Ph1 DL; 10X & 20X)
Fluorescent objectives	Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor)
Nikon inverted microscope	Nikon Instruments Inc	Eclipse TS100
Microsyringe pump controller (Micro4 )	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	SYS-MICRO4
Vibration isolation table	Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA	Micro-g
Amplifiers	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Headstages	Molecular Devices	HS-2A & HS-9A
Function generator	EZ Digital, Seoul, South Korea	FG-8002
Data Acquision System	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Digidata 1550A
Audible Baseline Monitors	Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA	BM-A-TM
Digital Storage Oscilloscope	Tektronix, Beaverton, Oregon, USA	TDS 2024B
Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	IonOptix Systems
Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344B or C
Inline Heater	Warner Instruments	SH- 27B
Valve Controller	Warner Instruments	VC-6
Inline Flow Control Valve	Warner Instruments	FR-50
Electronic Puller	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97 or P-1000
Microforge	Narishige, East Meadow, NY, USA	MF-900
Borosilicate Glass Tubes (Trituration)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	1B100-4
Borosilicate Glass Tubes (Pinning)	Warner Instruments	G150T-6
Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes)	Warner Instruments	GC100F-10
Syringe Filter (0.22 µm)	ThermoFisher Scientific	722-2520
Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard	Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA	DD-90-S-BLK
Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm)	World Precision Instruments	555640S, 14364
Scissors 3 & 7 mm blades	Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA	Moria MC52 & 15000-00
Sharpened fine-tipped forceps	FST	Dumont #5 & Dumont #55