Sperma collectie van differentiële kwaliteit met behulp van dichtheid kleurovergang centrifugeren

Summary

In deze paper willen we de prestaties van de dichtheid kleurovergang centrifugeren techniek en de toepassing ervan in sperma fysiologie onderzoek beschrijven.

Abstract

In de geslachtelijke voortplanting, een mannelijke gameet of spermacel combineert met een vrouwelijke gameet te bewerkstelligen van bevruchting. Echter, zijn een groot aantal zaadcellen met het bevruchten van vermogen vereist voor interactie met een vrouwelijke gameet om bevruchting. Als zodanig, is het waardegevende bestanddelen vermogen van individuele zaadcellen essentieel voor succesvolle voortplanting. Dichtheid kleurovergang centrifugeren is gebruikt voor enkele tientallen jaren als een reproduceerbaar, snelle, doeltreffende, doelmatige en uiterst flexibele methode voor het verzamelen van alleen hoge kwaliteit sperma in gesubsidieerde reproductieve technologie moet worden gebruikt. De protocollen die we hier beschreven focus op het gebruik van de discontinue Percoll dichtheid kleurovergang centrifugeren (PDGC)-techniek om te isoleren van drie afzonderlijke populaties van Haan sperma door hun kwaliteit. We konden verzamelen van lage-, Midden- en hoge kwaliteit sperma. Ook beschrijven we reproduceerbare protocollen die bepalende potentieel van de vruchtbaarheid van het sperma door de beoordeling van de levensvatbaarheid, de mobiliteit en de werkkleding met zich meebrengen. Verzameling sperma door hun kwaliteit met behulp van PDGC techniek zou zinvol zijn om nauwkeurig en grondig typeren sperma met differentiële vruchtbaarheid potentiële.

Introduction

In gewervelde dieren ondergaan de mannelijke gameten selectieve druk; Daarom is reproductieve fitness van een man cruciaal voor het bereiken van de succesvolle bevruchting. Mannetjes van een bepaalde gewervelde dieren moeten zitten kundig voor produceren van zaadcellen in grote hoeveelheden en van voldoende kwaliteit om te voldoen aan de behoeften van bevruchting. Zaadcellen, met zowel een sperma-hoofd en een flagellum, zijn de meest gepolariseerde cellen in het lichaam. Ze zijn ook zeer heterogene in kwaliteit van sperma (levende en dode morfologisch normale en abnormale en immobiel, lage mobiele en hoge mobiele), die is geopenbaard wordt door de grote variatie in reproductieve efficiëntie van de mannetjes. Hoe groter het aandeel van hoge kwaliteit sperma, de minder het aantal verparingen moeten met succes het bevruchten van de eicel. Echter, om te bereiken vruchtbaarheid, morfologisch normale zaadcellen rekenen op voortstuwende krachten gegenereerd door hun flagellen om de site van bevruchting ook over het penetreren van de zona zitten¹ te bereiken (ZP; in het geval van zoogdieren) of inner perivitelline laag² (IPVL; in het geval van vogels en reptielen) van de eicel na natuurlijke paring of kunstmatige inseminatie (AI). Bepalen van sperma kwaliteit is noodzakelijk voor gebruik in geassisteerde voortplanting technologieën³ (kunst) en selectie van fokken mannetjes worden gebruikt in AI programma's⁴. Aan de andere kant, berust het succes van ART uitsluitend op de nauwkeurige evaluatie van de kwaliteit van het sperma. Een aantal laboratoriumtests hebben ontwikkeld om te bepalen van de functionele kenmerken van sperma. De belangrijkste parameters zijn levensvatbaarheid, mobiliteit, sperma morfologie, rechtsbevoegdheid (aviaire-sperma vereisen geen rechtsbevoegdheid⁵), Acrosoom reactie (AR; exocytose en vrijlating van een Proteolytische enzymen uit het Acrosoom van het sperma-hoofd), sperma penetratie van ZP of IPVL en bevruchting^{6,7,8,9,10,11}. Maatregelen van de vruchtbaarheid alleen bieden niet een nauwkeurige evaluatie van de waardegevende bestanddelen vermogen van een sperma bevolking¹¹. Maatregelen van de verschillende evenementen die aanloop naar bevruchting van een eicel is voorzien van een passende vertegenwoordiging van de prestaties van individuele spermatocyten⁷.

De methodologie ontwikkeld voor het meten van sperma functie is voornamelijk soortspecifieke. Bijvoorbeeld, in aviaire-sperma zijn levensvatbaarheid, de mobiliteit en de penetratie van IPVL de meest voorkomende parameters gebruikt om te beoordelen van sperma kwaliteit^8,11,12. Het aantal levende zaadcellen in het ejaculaat speelt een cruciale rol voor het voortbestaan van sperma, omdat de aanwezigheid van een groot aantal dode zaadcellen in het sperma is van invloed op de kwaliteit van sperma. Dit verhoogt de productie van reactieve zuurstof soorten in het sperma en oxidatieve schade veroorzaakt aan de levende zaadcellen¹³. Sperma mobiliteit, de capaciteit voor flagellar verkeer van aviaire-sperma tegen weerstand op lichaamstemperatuur, is bekend dat een directe rol in het bewerkstelligen van bevruchting⁸spelen. Het is reeds lang gevestigd dat mobiliteit is positief gecorreleerd met vruchtbaarheid en daarom is het een primaire determinant van vruchtbaarheid⁸. Een mobiele sperma moet echter ook de mogelijkheid te ondergaan een AR en te doordringen van de IPVL-¹¹. IPVL penetratie testen rekening voor elke sperma die in het proces van bevruchting^{11 participeert}.

Bij de toepassing van ART, wordt ejaculaat meestal verwerkt om de concentratie van hoge kwaliteit sperma te maximaliseren en minimaliseren van de concentratie van lage kwaliteit sperma. Na het verzamelen van sperma, kan het aandeel van hoge kwaliteit sperma worden verrijkt door sperma scheiding procedures gebruikte in zowel de industrie als de onderzoek praktijken. Veel van deze procedures zijn ontwikkeld, allemaal met de respectieve voordelen en beperkingen, maar allemaal gebruik maken van het heterogene karakter van de zaadcellen te verzamelen van alleen het sperma met hoog vermogen van de waardegevende bestanddelen. Deze procedures omvatten sperma migratiemethoden, naleving van kolom filtratie en dichtheid kleurovergang centrifugeren (DGC)^{14,15,16,17,18,19 , 20}. onder de beschikbare technieken, DGC gebleken te zijn zeer eenvoudig, herhaalbaar, kosteneffectieve en efficiënte in het isoleren van de maximale hoeveelheid kwalitatief hoogwaardige sperma voor gebruik in de kunst met als doel het maximaliseren van kans op bevruchting^{14 , 15}. Bovendien, DGC is niet schadelijk voor de celmembraan van sperma. In tegenstelling, sperma migratiemethoden verzamelen slechts geleidelijk mobiele sperma^18,19, maar de hoeveelheid sperma verzameld is erg laag, waardoor het inefficiënt bij het verzamelen van grote hoeveelheden sperma^{18, 20}. naleving van kolom filtratie is zeer efficiënt in het filteren van uiterst mobiele sperma van sperma¹⁷; Nochtans, neigt het naar schadelijk voor sperma membranen^20,21zijn.

Bij het DGC techniek is de meest gebruikte substraat voor het genereren van het verloop van de dichtheid Percoll, die uit deeltjes van de colloïdale silica gecoat in polyvinylpryrolidone bestaat. Percoll dichtheid kleurovergang centrifugeren (PDGC) kan continue of discontinue maar een discontinue verloop wordt meestal gebruikt voor hoog rendement isolatie voor zeer mobiele sperma^13,16,20. In een discontinue verloop zweeft lagere dichtheid media boven hogere dichtheid media, maken een verloop dat toename van de dichtheid van de bovenkant naar de onderkant van een conische buis. Hierdoor grenzen op het raakvlak tussen de twee media van verschillende dichtheid. De efficiëntie van de PDGC is afgeleid van twee factoren: 1) de voortstuwende vermogen van individuele zaadcellen en 2) de neiging van de zaadcellen met hoge structurele integriteit te hebben een hogere dichtheid. Sperma met hogere mobiliteit zijn beter in staat te steken uit lagere dichtheid media en doordringen in een hogere dichtheid-media. Lagere mobiliteit sperma zijn meer kans om te worden opgesloten op de grens gemaakt door de interface tussen media van verschillende dichtheid. Hebben een hogere dichtheid dan dood, abnormale of laag zaadcellen mobiele meestal zaadcellen met hoge structurele integriteit en mobiliteit. Wanneer de middelpuntvliedende kracht wordt toegepast in PDGC, vergemakkelijkt dit het verkeer van sperma met verschillende dichtheden naar hun respectieve plaats in het verloop.

In de huisartspraktijk, nadat PDGC wordt uitgevoerd, de zachte pellet van sperma met hoge vruchtbaarheid potentiële aan de onderkant van de conische buis wordt verzameld, en de rest wordt weggegooid. Een onderbenutte voordeel van deze techniek is echter de mogelijkheid om te scheiden van zaadcellen in verschillende groepen op basis van de kwaliteitsverschillen. Voor onderzoeksdoeleinden zorgt scheiding van sperma door mate van kwaliteit met behulp van de PDGC-techniek voor de studie van de kwaliteit van het sperma als het gaat om fysiologische, metabolomic en Proteoom verschillen. Hier willen we in detail hoe deze techniek kan worden gebruikt voor het scheiden van sperma door kwaliteit, evenals het aantonen van deze verschillen in kwaliteit, met behulp van de vitale kleuring van tevoren vastgelegde eosine-Nigrosine voor de levensvatbaarheid, de Accudenz assay voor mobiliteit en sperma-IPVL interactie assay voor werkkleding.

Protocol

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Georgia.

1. wassen met behulp van traditionele centrifugeren

1. Bereiden fosfaatbuffer (PBS). Toevoegen van 8,0 g NaCl, KCl, 1,44 g nb₂HPO₄ en 0,24 g van KH₂PO₄ tot 800 mL gedestilleerd water (dH₂van O) 0.2 g. Breng de pH op 7.4 met behulp van 0,1 N HCl en breng de oplossing aan 1 L met behulp van dH₂O.
2. Motility buffer voor te bereiden. Voeg 6,5 g NaCl, 4.5 g van glucose, 0.444 g CaCl₂ en 11,5 g N - tris-[hydroxymethyl] methyl-2-amino-ethanesulfonic acid (TES) tot 800 mL dH₂O. Breng de pH op 7.4 met behulp van de 1 M NaOH en breng de oplossing aan 1 L met behulp van dH₂O.
3. Pipetteer 0,5 mL sperma in een polypropyleen microcentrifuge buis. Voeg 1,0 mL PBS en meng voorzichtig.
4. Centrifugeer bij 1.500 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT) en verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet sperma met PBS tot 1,5 mL.
5. Centrifugeer bij 1.500 x g gedurende 10 min op RT. resuspendeer de zaadcellen met motiliteit pellet buffer tot 0,5 mL.

2. uitvoeren van de PDGC-techniek

Opmerking: Voer het hele proces van PDGC bij kamertemperatuur.

1. Breng 3,0 mL 1,08 g/mL en 1,07 g/mL Percoll oplossingen in twee afzonderlijke buizen.
   1. Voeg 1.712 mL 1.13 g/mL in een schone reageerbuis, oorspronkelijke Percoll tot 0,3 mL van 1,5 M NaCl-oplossing. Voeg 0.988 milliliters dH₂O en meng door zachte inversie 3,0 mL een 1,08 g/mL dichtheid om oplossing te maken.
   2. Voeg 1.482 mL 1.13 g/mL in een schone reageerbuis, oorspronkelijke Percoll tot 0,3 mL van 1,5 M NaCl-oplossing. Voeg 1.218 milliliters dH₂O en meng door zachte inversie 3,0 mL een 1,07 g/mL dichtheid om oplossing te maken.
2. Verdun in een schone reageerbuis, 1,0 mL sperma monster 1:2 met 2,0 mL PBS. Meng zachtjes door pipetteren.
3. Pipetteer 3,0 mL van de oplossing van de dichtheid 1,07 g/mL in een steriele 15 mL conische buis. Zorgvuldig Pipetteer 3,0 mL van de oplossing van de dichtheid 1,08 g/mL onder de oplossing van de dichtheid 1,07 g/mL. Ervoor zorgen dat de twee lagen niet vermengen. Een lange vorm (9 inch) Pipet van Pasteur kunt gemakkelijker deze stap.
4. Pipetteer 3,0 mL verdunde sperma overtreffen de PDG. Om ervoor te zorgen dat het sperma monster niet mengen met de PDG, zachtjes de conische buis met de PDG onder een hoek van 45° te kantelen. Pipetteer van de monster langs de wand van de buis en laat ze vloeien in de buis en over de PDG.
5. Een lege buis aan de massa van de PDG met overlay monster voor te bereiden. Beide buizen bij 1500 x g centrifugeren voor 20 min. Wees voorzichtig om de discontinue verloop tijdens het overzetten van de buizen van de Bank naar het evenwicht en vervolgens naar de centrifuge.
   Opmerking: Gebruik niet de rem aan het eind van centrifugeren.
6. Bekijk het resultaat. Zorg ervoor dat de drie afzonderlijke sperma lagen hebben gevormd in de buis, zoals te zien in Figuur 1.
7. Gecombineerd geïsoleerde sperma lagen met een pipet. De bovenste laag van sperma eerst verzamelen, het midden tweede laag, en last van de harde pellet aan de onderkant van de buis. Elk aan een schoon en steriel polypropyleenmicrocentrifuge buis.
8. Verdun elk monster tot 1,5 mL met PBS. Centrifugeer bij 1500 x g gedurende 10 minuten.
9. Giet af het supernatant. Sperma pellet met motiliteit buffer door zachte pipetteren reconstrueren.
   Opmerking: Alternatieve dichtheden mogen worden gebruikt om de behoeften van de onderzoeker. Bepalen hoeveelheid ingrediënten gebruikt met de volgende vergelijking, waarbij v₀ volume van voorraad dichtheid oplossing gebruikt, v is eindvolume van oplossing wensen, p is de dichtheid van de dichtheid van de definitieve oplossing wensen en p₀ is de dichtheid van de voorraad dichtheid oplossing:
   
   Gebruik altijd 0.3 mL 1.5 M NaCl in voorbereiding van dichtheid oplossingen ter vervanging van de concentratie van NaCl van fysiologische zoutoplossing.

3. bepaling van de kwaliteit van het sperma

1. Bereken dat de concentratie sperma²²zoals hiervoor is beschreven.
2. Voer eosine-Nigrosine vitale kleuring als eerder beschreven¹² met de volgende wijzigingen:
   1. Bereiden 100 µL van sperma oplossing bij een concentratie van 1 x 10⁸ cellen/mL.
   2. Pipetteer 50 µL van sperma oplossing in een buis van de polypropyleen microcentrifuge met een gelijke hoeveelheid eosine-Nigrosine vlek. Laat het mengsel gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur inwerken.
   3. Plaats een 20 µL drop van gebeitst spermastaaltje aan het ene uiteinde van een glasplaatje en uitstrijkje gelijkmatig in een manier die vergelijkbaar is met die welke gebruikt voor bloed uitstrijkjes. Luchtdroog de vlekkerig dia's bij kamertemperatuur gedurende 3-5 minuten.
   4. Observeer de uitstrijkjes onder een microscoop. Tellen van het aantal levende zaadcellen (geen vlek) en dode zaadcellen (roze gekleurd) en bereken het percentage van levende zaadcellen.
3. Het uitvoeren van de bepaling van de Accudenz, zoals eerder is gevalideerd voor het sperma van de kip, objectief beoordelen de sperma mobiliteit⁸ met de volgende wijzigingen:
   1. Pipetteer 1,0 mL van 6% assay oplossing in polystyreen cuvettes, zoals geïllustreerd in Figuur 2. Incubeer tot 41 ° C.
      Opmerking: 41 ° C wordt gebruikt om te voldoen aan de inwendige temperatuur van een duivin. De incubatietemperatuur moet overeenkomen met die van het vrouwelijke voortplantingssysteem van de soorten onderzocht.
   2. Bedekken de voorverwarmde assay-oplossing met 100 µL van het sperma monster bij een concentratie van 5 x 10⁸ cellen/mL.
   3. Plaats de cuvette bevat bedekt spermastaaltje in de spectrofotometer. Opnemen van de waarde van de extinctie bij 550 nm.
4. IPVL-penetratie test uitvoeren als eerder beschreven¹¹ met de volgende wijzigingen:
   1. Knip een stukje (0,5 x 0,5 cm) niet-germinal disc regio intact IPVL.
   2. Aanpassen van sperma concentratie tot 4 x 10⁶ cellen/mL
   3. Incubeer sperma in de motiliteit buffer met IPVL in een kleine glazen flesje gedurende 15 minuten bij 37 ° C, zoals geïllustreerd in Figuur 3.
   4. Dompel het stuk van de IPVL in 3% NaCl om te stoppen met de interactie tussen de IPVL en sperma.
   5. Het IPVL stuk monteren op een microscoopglaasje en de vlek met Schiff van reagens voor 10 min na fixatie met 10% formaline voor 20 s.
   6. Observeren van de IPVL onder een Microscoop voor succesvolle sperma penetratie gaten en Tel het aantal alle zichtbare gaten per 0,25 mm² bij 40 X vergroting.

Results

De techniek van de PDGC resulteerde in de duidelijke scheiding van de drie lagen van sperma door mate van kwaliteit over alle parameters. Sperma worden gescheiden in een kwalitatief hoogwaardige laag onder de hogere dichtheid oplossing, een midden-kwaliteit laag tussen de hogere en lagere dichtheid oplossing en een lage kwaliteit laag boven de lagere dichtheid oplossing. Deze verschillen in kwaliteit zijn blijkt door duidelijke verschillen in levensvatbaarheid (Figuur...

Discussion

Vruchtbaarheid niet alleen bepaalt de rentabiliteit van de dierlijke productie, maar fungeert ook als een middel van natuurlijke selectie van soorten voor bestaan. De uiteindelijke functie van een zaadcel is een eicel te bevruchten. Het oviduct van een vrouwelijke selecteert alleen deze sterkste zaadcellen met het oog op de bevruchting van de eicel^23,24. In vitro studies is gebleken ook een nauw verband tussen kwalitatieve sperma karaktertrekken en bevru...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accudenz	Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY, USA	AN7050
Percoll	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	P7828
Schiff’s reagent	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	3952016
TES	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	T1375
Eosin Y	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	E4009
Nigrosin	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	198285
ST 40R Centrifuge	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	75004524
DU 530 Life Sciences UV/Vis Spectrophotometer	Beckman Coulter, Brea, CA, USA		Geen catalogus gevonden
Olympus IX 71 Inverted Fluorescence and Phase Contrast Microscope	Olympus America Inc., PA, USA		Geen catalogus gevonden