In Vitro Kras Assay om aan te tonen van de gevolgen van arsenicum huid cel migratie

Samenvatting

Deze studie richt zich op een in vitro model voor wond genezing (kras assay) als een mechanisme om te bepalen hoe milieu aanwezige contaminanten zoals arsenicum invloed cellulaire migratie. De resultaten tonen aan dat deze in vitro -assay snelle en vroege aanwijzingen van wijzigingen in cellulaire migratie vóór in vivo experimenten biedt.

Samenvatting

Inzicht in de fysiologische mechanismen van wondgenezing heeft jarenlang de focus van het lopende onderzoek. Dit onderzoek is rechtstreeks vertaalt van veranderingen in de klinische normen gebruikt voor de behandeling van wonden en dalende morbiditeit en mortaliteit voor patiënten. Wondgenezing is een complex proces dat vraagt om strategische cel- en weefseltransplantaties interactie en functie. Een van de vele kritisch belangrijke functies van de wondgenezing is de individuele en collectieve cellulaire migratie. Op schade migreren verschillende cellen uit het bloed, omringende bindweefsel en epitheliale weefsels snel naar de site van de wond door middel van chemische en/of fysieke stimuli. Deze reactie van de migratie kunt grotendeels dicteren de resultaten en het succes van een genezende wond. Inzicht in deze specifieke cellulaire functie is belangrijk voor translationeel geneeskunde die kan leiden tot verbeterde wond genezing van resultaten. Hier beschrijven we een protocol dat wordt gebruikt om cellulaire migratie beter te begrijpen als het gaat om de wondgenezing, en hoe de veranderingen in de cellulaire omgeving dit proces kunnen aanzienlijk veranderen. In dit voorbeeld studie, waren dermale fibroblasten gegroeid in media aangevuld met foetale runderserum (FBS) als enkelgelaagde culturen in weefselkweek kolven. Cellen werden aseptisch overgebracht in Weefselkweek behandeld 12-Wells-platen en uitgegroeid tot 100% samenvloeiing. Bij het bereiken van samenvloeiing, waren de cellen in de enkelgelaagde verticaal krabde met behulp van een p200 Pipetteer tip. Arseen verdund in kweekmedia aangevuld met FBS werd toegevoegd aan individuele putjes op ecologisch relevante doses variërend van 0.1-10 M. beelden werden gevangen elke 4 uren (h) over een periode van 24 uur met behulp van een omgekeerde lichte Microscoop te observeren van cellulaire migratie (wond sluiting). Beelden werden afzonderlijk geanalyseerd met behulp van de software van de analyse van de afbeelding en procent wond sluiting werd berekend. Resultaten tonen aan dat arseen wondgenezing vertraagt. Deze techniek biedt een snelle en goedkope eerste scherm voor evaluatie van de effecten van verontreinigingen op de wondgenezing.

Inleiding

Wondgenezing bestaat uit een complexe reeks van stappen waarbij diverse celtypen, signalering moleculen en onderdelen van de extracellulaire matrix¹overlapping. Deze componenten werken samen in concert wond resolutie of reparatie, die uiteindelijk tot de vorming van een beschermende fibrotische litteken afhankelijk van de mate van trauma^{1 leidt}te bereiken. Om vast te leggen van de afzonderlijke processen en functies van wond is genezing in één experiment moeilijk; afzonderlijke stappen binnen de wond genezing proces moeten worden geïdentificeerd en afzonderlijk getest. Onder de vele stappen van wondgenezing, het proces van cellulaire migratie heeft geweest als kritiek beschouwd bij de beoordeling van genezing tarieven². Cellulaire migratie in alle fasen van wondgenezing kan worden waargenomen en dus noodzakelijk verder inzicht in hoe wijzigingen in cel migratie invloed op wond sluiting hebben kunnen. Cellulaire migratie is bijvoorbeeld te zien in beide vroege en late fase ontsteking, met bloed van stolling en bloedplaatjes aggregatie aan de wond site³. Deze gebeurtenissen voorkomen overmatig bloedverlies door de vorming van een tijdelijke verstopping te vullen gewonde gebieden verstoken van weefsel³. Bloedplaatjes in omloop zullen synthetiseren en afscheiden van vasoactieve mediatoren samen met Chemotactische factoren, welke samen signaal voor inflammatoire migratie (witte bloedcellen) aan de gewonde weefsel voor reparatie⁴. Opnieuw epithelialization gebeurt binnen uur van weefsel schade en omvat die betrekking hebben op de site van de wond door middel van activiteit en migratie van epitheliale keratinocyten om verdere besmetting te voorkomen of invasie van lichaamsvreemde deeltjes naar de wond site². Deze voorbeelden leggen alleen een paar van de vele cel migratie functies gekoppeld wondheling.

De kras assay is beschreven en gebruikt om beter te begrijpen cel migratie en haar vele rollen in de wond genezing van^5,6. Deze test wordt beschouwd als simplistisch, biedt high-throughput en maakt van de onderzoeker om representatieve cel migratiegegevens te verzamelen. Migratie testen hebben succesvol gebleken dat bepaalde verbindingen kunnen versnellen of vertragen van het tempo van de cellulaire migratie⁶. Bovendien zorgen deze test resultaten translationeel fysiologische informatie die kan worden gebruikt voor het formuleren van de doelstelling behandelingen, doseren van concentraties en genen van belang vóór in vivo experimenten. De bepaling vereist fundamentele cel cultuur technieken en leveringen, een cellijn van keuze en imaging technologie te vangen verkeer over tijd of beweging in reactie op de behandelingen.

De bepaling kan gemakkelijk worden gemanipuleerd of afgestemd op de behoeften van de onderzoeker. Echter, er zijn vier fundamentele vragen om te overwegen vóór experimenten. Welke algemene of specifieke vragen/die is/zijn de onderzoekers proberen te beantwoorden? Dit geldt voor de meeste hypothesen gedreven onderzoek; het is echter cruciaal voor deze test, omdat het bepalend zijn voor veel van de parameters die nodig zijn om nauwkeurig en volledig antwoord op de vragen. Wat cell lijn of cellijnen (als er meerdere) moeten worden gebruikt voor het vertegenwoordigen van het fysiologische systeem bestudeerd? Bijvoorbeeld, in een cutane wond genezing studie dermale fibroblast^5,6,7, stamcel⁸of epidermale Keratinocyt⁹ overwogen kan worden te vertegenwoordigen de bevolking van de cel die normaal worden gevonden in overvloed in de huid weefsel¹⁰. Anderzijds kon neutrofiele granulocyten, macrofagen of andere ontstekingscellen in dit systeem te vertegenwoordigen cel migratie van andere componenten van de wondgenezing binnen de huid weefsel¹⁰worden geëvalueerd. Bovendien zal identificeren van de specifieke cellenvariëteit wordt geëvalueerd helpen om te identificeren welke reagentia zijn optimaal te gebruiken om de metabole activiteit van de cel. Hoe zal de cel migratie worden bijgehouden/beeld? Er zijn een aantal technieken voor het observeren van cel migratie in een maatkolf of plaat. Verven of fluorescently tagging van cellen en cellen herkennen met behulp van fluorescentie- of confocal imaging biedt bijvoorbeeld een sterk contrast, waarmee de onderzoeker om duidelijk te definiëren cellulaire vs. niet-cellulair locaties en cellulaire verkeer¹¹ . Een andere gemeenschappelijke techniek, zoals beschreven in deze studie is het gebruik van de lichte microscopie van de omgekeerde met fase contrast^6,7. Dit alternatief voor cel kleurstoffen en fluorescentie kan de gebruiker levende spoor cellen zonder terminaal cellen vóór imaging vast te stellen en ook zorgt voor het vastleggen van beelden van hetzelfde individuele wells bevattende gewonden monolayers van cellen over tijdstippen. Welke resultaten maatregelen zal worden gebruikt voor analyse? Met behulp van de afbeeldingen verzameld tijdens de studie, gegevens kunnen worden gegenereerd waarin wijzigingen in cellulaire migratie tarieven kunnen worden begrepen. In ons lab, microscopische opnamen die zijn gemaakt op de omgekeerde lichte Microscoop zijn geüpload naar de software van de analyse van de afbeelding en het percentage wond sluiting en opgeteld gebied onder de curve (AUC) worden berekend.

We zullen het specifieke gebruik van deze test ophelderen van wijzigingen in dermale fibroblast migratie in de aanwezigheid van een bekende milieu verontreiniging, arseen benadrukken. Arseen is een natuurlijk voorkomende metalloïde gevonden binnen de aardkorst. Verschillende locaties heb gevonden met verhoogde niveaus van arseen, die een risico vormen voor personen die in de buurt van deze locaties wonen. Dientengevolge, is voedsel en water bronnen gebleken hebben verhoogde niveaus van arseen besmetting, die vergroot u de kans voor particulieren om te worden blootgesteld aan arseen. Milieu arseen blootstelling is aangetoond dat langdurige gevolgen voor de gezondheid in menselijke populaties boven of zelfs onder de huidige Verenigde Staten Environmental Protection Agency (USEPA) Max verontreinigingen niveau (MCL) van 10 ppb (10 µg/L)^{12, 13}. Hoewel de USEPA heeft ingesteld deze MCL en achtte het veilig om te drinken van grenzen, arseen concentraties die deze limiet overschrijden zijn niet ongewoon in waterbronnen wereldwijd. In de Verenigde Staten, zijn talrijke grondwater, goed water en bronnen gedocumenteerd te bevatten met betrekking tot de niveaus van arseen¹⁴. Montezuma goed bevat bijvoorbeeld in Verde Valley, AZ, 210 µg/L van arseen¹⁵. Grondwater rond de Verde River, AZ bevat 16 µg/L van arseen gemiddeld met piekwaarden 1,3 mg/L^15,16te bereiken. Met name, arseen concentraties in vele putten in de rivier Verde water schuur hoger zijn dan 50 µg/L^15,16. Met deze kennis, milieu relevante arseen concentraties waren geselecteerd dat bereik onder de MCL op 0.1 µM (7,5 ppb), boven het MCL op 10 µM (750 ppb) in de huidige studie^{14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20} _.

De verzamelde informatie uit deze experimenten zal worden gebruikt als een vroege indicator van potentiële wijzigingen in cellulaire migratie tarieven in een in vivo wond verontreinigd met arseen. Daarna, signalering moleculen kunnen worden geselecteerd op basis van hun rol bij het vergemakkelijken van de wondgenezing en cellulaire migratie, en toekomstige kwantitatieve polymerase kettingreactie (qPCR) gebaseerd gen expressie experimenten kunnen worden ingesteld na afloop van de huidige studies. Als migratie tarieven in deze bepaling in aanwezigheid van arseen wijzigt, kunnen specifiek gen doelen die betrokken zijn bij cellulaire migratie het doel voor de schadelijke effecten van arseen, en dus mag het mechanisme van verstoring.

Protocol

1. bereiding van een kabinet van bioveiligheid II (BSC)

Opmerking: De in dit protocol omschreven methoden moeten worden uitgevoerd met persoonlijke beschermingsmiddelen, tijdens het gebruik van goede laboratoriumpraktijken te bereiken van aseptische techniek.

1. Heffen het glas BSC beschermende aan operationele hoogte en inschakelen van laminaire flow fans.
   1. 70% waterige oplossing van isopropanol en gebruiken voor het uitvoeren van een sanitaire voorzieningen veeg van het werkgebied. BSC veeg uit de achterwand en zijwanden en werken tot de grondplaat.
   2. Veeg alle materialen die worden gebruikt in de test met 70% alcohol (isopropanol of EtOH) en plaats hen binnen de BSC.

2. menselijke dermale fibroblasten zaaien in een maatkolf van T75

1. Flesjes met de gewenste cryopreserved cellijn (neonatale menselijke dermale fibroblasten [hDFn], bij cel concentratie van 500.000 cellen/injectieflacon en bij passage p3-p5) te verkrijgen.
   1. Plaats een flacon met cellen in een 1.0-cm-diep waterbad bij 37 ° C te laten ontdooien. Ontdooi flacon tot ongeveer 70% van de cell oplossing gesmolten. Veeg neer flacon met 70% alcohol en flacon plaats in flacon rek binnen de BSC.
      Opmerking: Zorg ervoor dat water komt niet in contact met draden of GLB van flacon om potentiële verontreiniging tijdens cel zaaien te voorkomen. Voorkomen dat volledig ontdooien van cellen in water bad omdat niet te doen leiden onbedoelde celdood tot kan.
2. Trekken uit 10 mL van de media, aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS). Kunt een automatische pipet en 10 mL pipet tip gecombineerd in T75 weefselkweek maatkolf. Het toestaan van media volledig verzadigen de base van de kolf door zachtjes de kolf heen en weer schommelen.
   1. Open flacon met cel voorraad en aspirate oplossing van de flacon, wordt zich bewust van pipetting snelheid, zoals celmembranen kwetsbaar van cryopreservatie zal worden.
   2. Cellen overbrengen in een maatkolf van T75 weefsel met media. Uitwerpen ontdooide cel in de kolf van het weefsel, opnieuw wordt zich bewust van pipetting snelheid.
      Opmerking: Zaaien van dichtheid van de cellen in de kolf van het weefsel wordt benaderd om 6.600 cellen/cm². Zaaien van dichtheid kan worden gewijzigd zodat de gebruiker en de gewenste timing van experimenten.
   3. Meet media uit T75 weefsel kolf 1 mL en breng volume terug in het flesje. Volume van de flacon overbrengen terug in de maatkolf van T75.
      Opmerking: Het uitvoeren van deze stap helpt maximaliseren van de opbrengst van de cel van de flacon.
   4. Draai de dop van de kolf weefselkweek en zachtjes rock cellen in suspensie gelijkmatig te verspreiden over het hele oppervlak. Selectievakje voor gelijkmatige verdeling van cellen met behulp van een omgekeerde Microscoop.
3. Label kolf met celtype, datum, initialen, geslacht, en het doel (bijvoorbeeld, hDFn, 07/11/2018, NDC, Passage 4, arseen Scratch Assay). Plaats weefselkweek kolf in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5,0% CO₂ voor 72 uur.
   Opmerking: Groeimedium moet gewijzigde 12-24 uur na de eerste zaaien om te verwijderen sporen van dimethylsulfoxide (DMSO) cryoprotectieve en vervolgens gewijzigd elke 48 h na dat cellen worden goed gevoed. De periode van incubatie en groei hangt af van het berekende aantal cellen die nodig zijn voor de kras assay. De verdubbeling tijd voor hDFn cellen is doorgaans 16-24 uur onder normale omstandigheden. Echter, verdubbeling tarief kan veranderen als gevolg van misbruik, pH, temperatuur, vochtigheid, middellange type, enz., en moet worden rekening gehouden bij de planning van experimenten.

3. cel tellen en subcultuur in 12-Well weefsel cultuur plaat

1. De T75 weefselkweek kolf ophalen incubator. Observeren van zelfklevend cellen met behulp van een omgekeerde Microscoop op objectieve vergroting van 10 X (100 X totale vergroting) en de samenvloeiing van de geschatte cel bepalen.
   1. De meerderheid van de kolf weefselkweek worden gescand wanneer observeren samenvloeiing om ervoor te zorgen het meest representatief percentage wordt benaderd. Evalueren van individuele cel morfologie voor eventuele afwijkingen of voor bacteriële en/of schimmel besmetting.
2. Monteer de automatische pipet met een 10 mL pipet tip. Gebruik pipet om het volledige volume van de media van de oplossing T75 en overdracht aan een afval container gecombineerd. Verhinderen dat de tip Pipetteer contact opnemen met het daaraan vastzittende celoppervlak. Gooi pipette uiteinde in een opslaglocatie biohazard.
   1. Monteer de automatische pipet met een 5 mL-pipet-tip. 5 mL van de evenwichtige zout oplossing gecombineerd, afzien in de kolf en zachtjes rock de erlenmeyer te spoelen de overtollige media, dode cellen en afvalproduct.
   2. Het volume trekken de T75 en afzien in de afval container. Gooi het uiteinde van de pipet in de bak van biohazard.
   3. De automatische pipet met een 5 mL-pipet-adapter te monteren. Gecombineerd 2 mL trypsine uit voorraad, afzien in de kolf en zachtjes rock de kolf het verspreiden van het enzym over de zelfklevend cellen. Zorgen voor volledige verzadiging van het aanhangend oppervlak. Plaats de kolf van het weefsel in de incubator voor 2-3 minuten (min).
      Opmerking: De maximale enzym-substraat reactie mag niet hoger zijn dan 10 min.
   4. Observeer de kolf weefsel onder een omgekeerde Microscoop bij een 10 X objectief vergroting (100 X totale vergroting). Zachte trillingen om mobiele-detachement van toepassing.
   5. Veeg de T75 kolf met 70% alcohol en plaats binnen de BSC.
   6. Monteer de automatische pipet met een 5 mL-pipet-tip. 5 mL van media uit de voorraad gecombineerd en voeg aan de maatkolf weefsel T75 om te stoppen met de enzym-substraat reactie. De media: trypsine verhouding moet 3:1. Pipetteer op en neer de base van de kolf 2 - 3 keer te spoelen en zorg ervoor dat de reactie heeft gestopt. Het volledige volume van de vloeistof uit de kolf en de overdracht in een steriele 15 mL conische buis gecombineerd.
   7. Vul een tweede conische tube van 15 mL met een identieke volume van media.
   8. Plaats beide 15 mL conische buizen in een antipodale positie aan elkaar. 200 g van middelpuntvliedende kracht gedurende 5 minuten bij 25° C toepassing door apparatuur van lopende parameters.
   9. Veeg de conische tube van 15 mL met Ingehuld cellen met 70% alcohol en plaats binnen de BSC.
   10. Gebruik de automatische pipet met een 5 mL-gehechtheid aan Pipetteer af media, ongeveer 250 µL van vloeistof en cel pellet achterlatend. Let op de locatie van het uiteinde van de pipet, zoals de cel pellet ongestoord moet blijven. Afzien van het volume verzameld in een afvalcontainer en negeren de tip in een opslaglocatie biohazard.
   11. Gebruik een microcentrifuge buis rek aan de onderkant van de conische buis lopen over de flacon-slots, maken een snelle trilling, om te verstoren en resuspendeer de pellet van de cel (ook wel "rack harken" genoemd).
       Opmerking: Vermijd het gebruik van een vortex-mixer voor het uitvoeren van deze stap. Zwaartekracht krachten gemaakt door vortex mixers cel g-force drempelwaarden overschrijden en kunnen leiden tot lysing. Wanneer correct uitgevoerd, verschijnt de nieuwe oplossing van de cel als een troebel mengsel met geen resterende pellet. Diligence uitvoeren van deze stap ontstaat vaak een enkele celsuspensie, leidt tot grotere nauwkeurigheid bij het tellen van de cellen.
   12. Voeg 2 mL media aan de cel voorraad of resuspensie. Pipetteer de cellen zachtjes naar beneden van de kant van de buis 20 keer te breken klontjes. Opnemen van de cel Totaal schorsing volume en zet opzij kort.
3. Pipetteer 20 µL van Trypan Blue voorraad (0,4%) in een lege putje van een 96-wells-plaat met behulp van een steriele Pipetteer.
   1. Meng de voorraad cell oplossing voor het genereren van een uniforme celsuspensie vóór de overdracht. Gebruik een steriele Pipetteer tip te verwijderen 20 µL van cel voorraad (vermijden van het raken van de muren van de buis). Voeg toe aan de 20 µL van Trypan Blue oplossing in de 96-wells-plaat.
   2. Pipet zachtjes te mengen van inhoud. Pipetteer 10 µL van het mengsel tussen het dekglaasje aan en het tellen kamer op de hemocytometer.
   3. Observeer de cellen en het raster onder een 10 X doelstelling. Observeren van negen grote pleinen binnen het gezichtsveld. Cellen alleen in het midden en 4 hoek vierkantjes (totaal van 5 vierkantjes) tellen.
      Nota: Kijk voor een gelijkmatige verdeling van cellen over de gehele raster om ervoor te zorgen een nauwkeurige tellen.
   4. Overeen alle cellen (transparant en blauw) op de 5 geïdentificeerde pleinen van het raster. Afzonderlijk, tally alleen de nonviable (blauw) cellen in de dezelfde 5 vierkantjes.
   5. Bereken met behulp van levensvatbare cellen tellen:
      waar x = levensvatbare cellen tellen, een = totaal aantal cellen, b = niet-levensvatbare cellen
   6. Bereken de levensvatbare cellen dichtheid met behulp van:
      waar x = dichtheid van de levensvatbare cellen en y = totale som van levensvatbare cellen.
   7. Totaal aantal levensvatbare cellen te berekenen:
      waar x = totaal aantal levensvatbare cellen, y = dichtheid van de levensvatbare cellen, f = volume (mL) van de opschorting van de cel.
   8. Bereken de levensvatbaarheid van de cellen van de %:
      waar x = procentuele levensvatbaarheid, y = levensvatbare cellen geteld op grid, f = totaal aantal cellen geteld op grid.
4. Markeer een horizontale lijn over de bodem van de 12-well plaat om te dienen als referentietekens tijdens imaging.
   1. De dichtheid van de levensvatbare cellen (berekend in 3.3.7) gebruiken voor het berekenen van het volume van media om te verdunnen van de voorraad van de cel in voor het zaaien van een 12-well weefselkweek plaat.
      Opmerking: De optimale cel dichtheid voor hDFn cellen zaaien is 5.000 cellen/cm².
   2. Cel voorraad tot 19.000 cellen/mL verdund met behulp van de media en het zaad van elke goed met 1 mL cel voorraad. Meng cel voorraad regelmatig om ervoor te zorgen zelfs cel zaaien over alle 12 putjes.
   3. Label elke plaat met het celtype, het geslacht, de initialen van de gebruiker en het doel. Plaats de platen in incubator ingesteld op 37 ° C en 5,0% CO₂. Cellen groeien totdat 100% samenloop wordt bereikt voor kras assay toestaan.

4. arseen (As) stamoplossingen en berekeningen

1. Natrium arsenite (NaAsO₂) rechtstreeks in de cel voedingsbodems met 10% verdunnen FBS bij werken concentraties van 10, 1,0, 0,1 en 0,01 µM als.
2. Hiervoor maken een eerste 1 mM voorraad als oplossing door verder verdunnen van 3,9 mg natrium arsenite in 30 mL van de media. Serieel Verdun de voorraad van de 1 mM voor de resterende als oplossingen.

1000 µM als voorraad Berekeningen	Werken van voorraad concentraties arseen	M1V1= M2V2	Volume vorige arseen oplossing	Volume van Media	Totale hoeveelheid arseen werken voorraad
NaAsO2 moleculair gewicht: 129.9 g/mol	10 µM als	(x mL) (1.000 µM) = (30 mL)(10 µM) x = 0,3 mL	0.3 mL = 300 µL van 1mM als oplossing	29,7 mL media	30
.03 L x.001 mol/L-x 130 g/mol = 3,9 mg arseen	1.0 µM als	(x mL) (10 µM) = (30 mL)(1 µM) x = 3 mL	3 mL van 10 µM als oplossing	27 mL van media	30
3.9 mg natrium arsenite verdund tot 30 mL media	0.1 µM als	(x mL) (1 µM) = (30 mL)(0.1 µM) x = 3 mL	3 mL 1 µM als	27 mL van media	30
	0,01 µM als	(x mL) (0.1 µM) = (30 mL)(0.01 µM) x = 3 mL	3 mL 0.1 µM als	27 mL van media	30

Tabel 1. Arseen voorraden en seriële verdunningen. Deze tabel verklaart de berekeningen gebruikt voor het maken van de voorraadoplossingen van As en werken van stamoplossingen voor behandelgroepen.

5. Kras Assay techniek en arseen besmetting

1. Het verkrijgen van een 12-well plaat met cellen uit de incubator. Cellen op een 10 X objectieve vergroting (100 X totale vergroting) bekijken. Cel samenvloeiing binnen elk putje te bepalen.
   Opmerking: Elke individuele goed moet bereiken 100% samenvloeiing voorafgaand aan krabben. Deze kritieke stap zorgt voor consistentie in de bepaling en helpt assay protocollen in alle experimenten standaardiseren. Als alle putten niet hebben bereikt 100% samenvloeiing, cellen om te broeden voor extra tijd totdat alle putjes hebben bereikt 100% samenvloeiing toestaan. Extra groei tijd in putten die reeds hebben bereikt 100% samenvloeiing zal niet worden beïnvloed. Confluente cellen zal meestal groei gearresteerd worden en blijven als een enkelgelaagde cultuur, terwijl het toestaan van sub confluente putten te bereiken 100% samenvloeiing.
2. Monteren van een automatische pipet met een 10 mL pipet tip. De groei-media uit alle putjes gecombineerd. Beschikken over het volume in vloeibare afvalstoffen en het uiteinde van de pipet op de opslaglocatie raadplegen.
   1. Monteren van een pipet p200 met een 1-200 µL steriele tip. In elk putje, produceren een kras "mock wond" door het glijden van de tip over celoppervlak van een 12-uur naar 6-uur locatie.
      Opmerking: Drie factoren die van grote invloed zal zijn op de consistentie zijn snelheid, druk, en de hoek van het uiteinde. De kras moet snel worden uitgevoerd met een constante druk, tijdens het bewust van de hoek van de tip verblijft loodrecht op de basis van de plaat. Krabben langzaam zorgt voor kromme lijnen, overdruk kan permanent scoren cel daaraan vastzittende oppervlakken en een hoek van het uiteinde minder dan 90° zal beperken de kras breedte. Om het even welk van deze gemeenschappelijke fouten kan resulteren in gewijzigde migratie tarieven en patronen.
   2. Duidelijke weg overtollige puin en cel klontjes door spoelen met 1 mL van evenwichtige zoutoplossing per putje. Rock de plaat links-naar-rechts om wassen. De evenwichtige zout oplossing verwijderen uit putten en gooi in een afvalcontainer. Beschikken over het uiteinde van de pipet 5 mL in de bak raadplegen.

Figuur 1: schematische weergave van de kras assay. Al het werk is gedaan in een aseptische veld te verminderen de kans op besmetting. Cellen zijn zaadjes bij een gewenste dichtheid in weefselkweek kolven en gekweekt in een incubator ingesteld op menselijke fysiologische omstandigheden (5% CO₂, 37 ° C). Bij het bereiken van een gewenste samenloop, worden cellen aseptisch sub gekweekt in 12-well weefselkweek platen op een gewenste seeding dichtheid. Cellen worden gekweekt tot 100% samenkomst in elk putje van de plaat 12-well en gekrast met behulp van een steriele Pipetteer tip. Deze "scratch" creëert een in vitro mock wond (aangeduid met dubbele vierkoppige pijl), waarin cellen natuurlijk migreren om te sluiten van de open ruimte. Elk goed kan worden uniek geconditioneerd en cellulaire migratie tarieven kunnen worden waargenomen en gekwantificeerd in reactie op de behandeling van de verschillende voorwaarden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

3. Kunt een p1000 pipet met een 1.000 µL tip Pipetteer 1.000 µL van arseen voorraden in putten die willekeurig met een behandelde groep toegewezen zijn. Gebruik een nieuwe Pipetteer tip voor elk putje te voorkomen van kruisbesmetting. Neem de tijd wanneer behandelingen worden toegevoegd. 12-Wells-platen in een incubator vastgesteld op 37 ° C en 5,0% CO₂plaatsen.

6. imaging

1. Foto's vastleggen van elk putje op 10 X objectieve vergroting elke 4 uur over een periode van 24 h (0, 4, 8, 12, 16, 20 en 24 h). Verwijst naar de regel eerder getekend op de bodem van de plaat om het imago van dezelfde locatie langs de kras binnen elk putje op latere tijdstippen.
   Opmerking: Het is noodzakelijk dat de dezelfde locaties zijn gefotografeerd op elk punt van de tijd toe te staan voor nauwkeurige beeldanalyse en om representatieve gegevens te verkrijgen.

7. de beeldanalyse

1. Upload afbeeldingen die zijn vastgelegd op de omgekeerde lichte Microscoop met een computer en opslaan als een JPEG-afbeelding met een gedetailleerde bestandsnaam.
2. Open ImageJ.
3. Upload een afbeelding van een fase micrometer met bekende afstanden naar de software voor het converteren van pixels naar millimeters (mm) bij het nemen van afbeelding metingen door slepen en neerzetten het bestand in het venster software.
   Opmerking: De micrometer moeten lijnen afbakening van een bekende 1 mm lengte en de afbeelding moet worden genomen op de dezelfde vergroting gebruikt voor het vastleggen van beelden van cellen. Bijvoorbeeld, in deze studie beelden werden genomen bij 100 X totale vergroting, werd dus het beeld van de etappe micrometer genomen op 100 X totale vergroting.
   1. Klik op de rechte, Segmentedof Freehand lijnen opties.
   2. Trek een lijn van bekende afstand op de micrometer afbeelding met behulp van de maatstreepjes met een lengte die is gekoppeld aan elke teek merken. Om een rechte lijn te tekenen: muisklik, houden, Sleep de cursor naar de gewenste locatie, dan laten gaan van de muis.
   3. Selecteer analyseren en vervolgens Instellen schaal.
   4. Bekend afstand ingesteld op de bekende lengte van de lijn in de vorige stap.
   5. Lengte-eenheid ingesteld op mm.
   6. Het globale selectievakje.
   7. Selecteer OK om af te sluiten uit het menu.
   8. Sluit uit de fase micrometer afbeelding.
4. Upload een afbeelding van de kras assay naar ImageJ door te slepen en te laten vallen-afbeeldingsbestand in het venster.
   1. Een rechte lijn tekenen over de breedte van de kras (vanaf linkerrand leidt tot toonaangevende rechterrand).
   2. Druk op de letter M op toetsenbord te registreren van de meting van de rechte lijn getrokken. Een klein venster resultaten verschijnt onmiddellijk na het typen van de letter M. Dit is waar de breedte meting zal worden.
5. Herhaal stap 7.4 totaal 10 keer 10 metingen langs de lengte van de kras te verkrijgen.
   Opmerking: Het is belangrijk voor het genereren van de meest representatieve waarden van de breedte beneden de hele lengte van de kras. Zorg ervoor dat de metingen van de 10 breedte even langs de lengte van de kras van boven naar beneden uitspreiden.
6. Een kras assay-werkbladbestand te kopiëren en plakken van de metingen te maken.
   1. Kopieer en plak de 10 breedte metingen vanuit het venster resultaten in juiste kolom in een spreadsheet-bestand (tabel 2).
      Opmerking: Wanneer de metingen uit het venster resultaten gekopieerd en in het werkblad geplakt, zal er vreemde kolommen met waarden; deze waarden moeten worden geschrapt, en behoud alleen de 10 breedte metingen.

10 willekeurige breedte metingen	0 h	4 h	8 h	12 h	16 h	20 h	24 h
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Gemiddelde van 10 metingen

Tabel 2. Ruwe breedte maten tabel formaat. In deze tabel staan de organisatiestructuur voor de ruwe metingen verkregen.

7. Herhaal de bovenstaande stap voor de rest van de kras assay-beelden.
8. Bereken het gemiddelde van de 10 metingen op elk tijdstip (0-24 h) voor elke goed.
9. Bepalen procent sluiting berekeningen met behulp van waarden uit stap 7,8.
   1. Een tabel maken van werkblad met een adellijke titel "breedte meting gemiddelden" onderaan (tabel 3).
   2. Kopieer en plak die de rij Gemiddelde van 10 metingen berekend in stap 7,8 in de tabel "breedte meten gemiddeld".
   3. Een andere tabel naast de Breedte meten gemiddelden -tabel te maken. Deze titel tabel Procent wond sluiting (tabel 4).
      Opmerking: De waarde in de kolom 0 h voor elk putje moet 0 omdat de kras 0 is % gesloten bij de eerste 0 h foto voor alle putjes.
   4. Navigeer naar de volgende kolom over (4 h).
   5. Bereken het percentage sluiting voor 4, 8, 12, 16, 20 en 24 h tijdstippen:
      
      waar x = percentage sluiting, ik kras beginbreedte (0 h breedte), = f = laatste kras breedte (4, 8, 12, 16, 20, of 24 h breedte).

Goed breedte gemiddelden	0 h	4 h	8 h	12 h	16 h	20 h	24 h
1a
2a
3a
4a
1b
2b
3B
4b
1c
2c
3c
4c

Tabel 3. Breedte meten gemiddelden tabelopmaak. In deze tabel staan de organisatiestructuur voor de breedte meten gemiddelden berekend aan de hand van de ruwe breedte metingen in tabel 2.

Goed	0 h	4 h	8 h	12 h	16 h	20 h	24 h
1a	0
2a	0
3a	0
4a	0
1b	0
2b	0
3B	0
4b	0
1c	0
2c	0
3c	0
4c	0

Tabel 4. Procent wond sluiting tabelopmaak. Deze tabel ziet u de organisatiestructuur voor het percentage wond sluiting waarden berekend met behulp van de meting breedte gemiddelden in tabel 3.

10. Een andere tabel naast de tabel Procent wond sluiting maken. Deze titel tabel van de AUC (tabel 5).
    1. Berekenen van de 0-4 h gebied onder de curve (AUC) waarde in de 0-4 h kolom voor elk putje:
       
       waar x = 0-4 h AUC-waarde, a = % sluiting waarde voor 0 h, b = % sluiting waarde voor 4 h, h = de tijd tussen de twee maatstaven (4 h in deze studie).
    2. Berekenen van de 4-8 h oppervlakte onder de curve (AUC) waarde in de kolom 4-8 h voor elk putje:
       
       Waar x = 4-8 h AUC waarde, een waarde van de sluiting van de % gedurende 4 uur, b = = % sluiting waarde voor 8 h, h = de tijd tussen de twee maatstaven (4 h in deze studie).
       Opmerking: Één AUC waarde moet worden berekend voor elk interval van 4 uur tijd in de 24-uurs periode voor elk putje.
    3. Som van alle waarden van de AUC van 0-24 h (berekend in stappen 7.10.1-7.10.2) een opgeteld AUC om waarde te krijgen voor elk putje. Zorgen dat deze waarden worden correct opgeslagen voor statistische analyse.

Goed	0-4 h	4-8 h	8-12 h	12-16 h	16-20 h	20-24 uur	Opgeteld AUC
1a
2a
3a
4a
1b
2b
3B
4b
1c
2c
3c
4c

Tabel 5. AUC tabelopmaak. Deze tabel ziet u de organisatiestructuur voor de AUC waarden berekend met behulp van het percentage wond sluiting waarden in tabel 4.

8. statistische analyse

1. Bepaal de methode van statistische analyse die het beste past bij zowel de proefopzet en opgeteld AUC waarden verkregen tijdens de test.

Resultaten

Omvang van de steekproeven (n) voor alle groepen van de behandeling was n = 28. Cellen werden met succes gekweekte volgende aseptische technieken en lab protocollen (Figuur 1). Uniforme krassen werden waargenomen van alle fracties van de behandeling met de gemiddelde kras breedte meten van 0,8 mm 0.4 mm (Figuur 2). Controlegroepen had een gemiddelde opgeteld oppervlakte onder de curve-waarde van 1,355.83; 0,01 µM als behandelgroepen had een gemiddelde vatte gebied onder de curve-waarde van 1,366.21; 0.1 µM als behandelgroepen had een gemiddelde opgeteld gebied onder de curve-waarde van 1,326.24, 1.0 µM als de behandelde groep hadden gemiddeld vatte gebied onder de curve-waarde van 1,295.10; en ten slotte de 10 µM zoals behandelde groep had een gemiddelde opgeteld oppervlakte onder de curve-waarde van 535.12, die statistisch lager was in vergelijking met alle andere groepen (p < 0,05) (Figuur 3). R-programma voor statistische analyse werd gebruikt voor het uitvoeren van een one-way ANOVA met een Tukey post hoc aanpassing om statistische verschillen tussen groepen van de behandeling (p < 0,05) te bepalen.

Figuur 2: vertegenwoordiger kras assay beelden over een periode van 20u. Beelden A-D vertegenwoordigen cellulaire migratie van de cellen; afbeeldingen E-H vertegenwoordigen cellulaire migratie van cellen besmet met 1.0 µM als; beelden L vertegenwoordigen cellulaire migratie van cellen besmet met 10 µM als. Van deze beelden is het duidelijk dat de cellulaire migratie in aanwezigheid van arseen is vertraagd. De controle-afbeeldingen tonen een volledig "genezen" kras na 20u, terwijl de andere twee als-behandelgroepen niet "genezen werden". De 10 µM als behandeling geremd volledige sluiting helemaal na 24 h. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3: arseen vertraagt cellulaire migratie in de scratch assay. Beelden werden gemaakt over een periode van 24 uur te observeren wijzigingen in cellulaire migratie tarieven in aanwezigheid van uiteenlopendeconcentratiesverkrijgbaar van arseen. RAW-beelden zijn geanalyseerd met behulp van een geautomatiseerde software (bijvoorbeeldin MATLAB), welke in eerste instantie gemeten wond breedte, dan berekend percentage sluiting en tenslotte gebied onder de curve (AUC). Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde. De 10 µM als de behandelde groep statistisch vertraagd cellulaire migratie van menselijke dermale fibroblasten neonatale (hDFn), blijkt uit een statistisch lagere waarde van de AUC, in vergelijking met alle andere behandelgroepen een one-way ANOVA met een Tukey post hoc aanpassing (p < 0,05). Statistische verschillen worden vertegenwoordigd door de letters "A" en "B", die zijn verkregen door het gebruik van de methode compacte brief Display beschikbaar in R-programma. Behandelingen die het niet eens met een gemeenschappelijke brief zijn statistisch significant van elkaar (p < 0,05). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussie

Toepassing van deze bepaling biedt een high-throughput en tijdige evaluatie van cellulaire migratie en kunt direct vertalen naar complexe fysiologische systemen^5,6,7. Om deze reden is de voorgestelde Bank-topmodel afgestemd en geoefend om te evalueren van de gevolgen van de verschillende therapeutische agenten en milieu-toxines voor wond genezing van⁶. De concentraties van arseen gebruikt in de huidige studie werden geacht milieu relevante door uitgebreide literatuurstudie van bekende blootstellingsniveaus en van retroactieve herziening van verschillende gegevens baseert^{14,15, 16,17,18,19,20,21}. Gebruik van deze kras assay in vitro aangetoond dat de blootstelling aan een concentratie arseen binnen de hoge, maar ook vanuit milieuoogpunt relevant bereik, vertraagd wond sluiting (cellulaire migratie).

Dit topmodel van bank werkte ook te isoleren en bestuderen van een afzonderlijke cellijn (fibroblast) om verder te begrijpen hoe fibroblast migratie draagt bij aan de wond genezing resultaten. Bovendien is het moeilijk om te bestuderen van de functies van een afzonderlijke cellijn in complexe in-vivo systemen met vele andere cellen en weefsels aanwezig die de analyse verstoren kunnen. Daarnaast biedt de bepaling een middel voor het bereiken van semi-kwantitatieve percentage wond sluiting gegevens die kan worden gebruikt voor het richten van specifieke cellulaire mechanismen via welke verbindingen invloed op wondgenezing hebben kunnen. Bijvoorbeeld cellen die worden gebruikt in de scratch bepaling kunnen worden verzameld en opgeslagen in een gewenste reagens en gebruikt in de expressie van genen (signaal mRNA) of eiwit expressie testen²². Deze informatie kan nuttig zijn om de onderzoeker worden als ze proberen te begrijpen wat signalen of eiwitten grotendeels aan veranderingen in de cellulaire migratie in de aanwezigheid van verschillende behandelingen (bijvoorbeeld arseen)^{22 bijdragen kunnen}.

Menselijke neonatale dermale fibroblasten werden geselecteerd voor dit werk op basis van hun rol in de wondgenezing. Echter dit kras assay-protocol is geïmplementeerd met behulp van verschillende celtypes en voor een aantal onderzoeksdoeleinden. Bijvoorbeeld, is de kras bepaling goedgekeurd op het gebied van oncologie voor het bestuderen van de remming van de migratie van chemotherapie drugs²³; voor skeletspieren cel migratie, proliferatie en diffusie²⁴; studie van het effect van plantenextracten op cellulaire migratie²⁵; en om te begrijpen hoe Keratinocyt migratie en proliferatie bijdragen tot wond genezing⁹. Een eerdere papier door Pinto et al. geëvalueerd daarnaast de effecten van uranium (U) en platelet-rich plasma (PRP) op hDFn migratie met behulp van de kras assay-⁶. Het doel van dit werk was om te begrijpen welke waarnaar deze bepaling kan het testen van het effect van een agent gedacht te vertragen cellulaire migratie (U), evenals een agent dacht te versnellen van cellulaire migratie (PRP). Zoals kan worden gezien in het bovengenoemde werk en onderzoek door andere onderzoekers, toepassing van de kras bepaling heeft groot potentieel voor gebruik in verschillende experimentele modellen²⁶. Ondanks de details binnen de methoden geleverd, worden variantie tussen onderzoekers en experimenten verwacht. Cellulaire migratie tarieven zullen bijvoorbeeld waarschijnlijk op basis van de cellijn in gebruik, naast de vereiste micronutriënten die nodig zijn voor de unieke celtypes schommelen. Veel van de belangrijke opmerkingen om hulp in cel opbrengst en levensvatbaarheid staan als notities in dit protocol. Het is echter sterk aanbevolen dat onderzoekers volgen de aanbevelingen van de fabrikant voor optimale groei-omstandigheden, en gebruik deze methode als aanvullende instructie voor de algemene cel cultuur werk.

Hoewel de kras bepaling zeer veelzijdig voor studie van cellulaire activiteit is; onvoorziene vertekeningen kunnen optreden in de meettechnieken. Bijvoorbeeld, wanneer u ImageJ handmatig traceren cel migratie fronten, kan variatie bestaan tussen gebruikers, die kunnen nauwkeurigheid en verzamelen van representatieve gegevens beperken. Ook opgemerkt moet worden dat migratie fronten blind aan de behandeling tot een minimum beperken gebruiker bias moeten worden gelezen. Bovendien handmatig identificeren van migratie fronten kan leiden tot misrekening van gemiddelde afstand reisde ontstaan door de vorming van de pseudopod door de cellen en hun vermogen om vorm focal verklevingen, die visueel misleidend kunnen zijn te bereiken. Op dezelfde wijze, het gebruik van TL "cel tracker" kleurstoffen op celoppervlak of nucleaire eiwitten te detecteren migratie onbedoeld cellen resulterend in onjuistheden bij het meten van cellulaire migratie na verloop van tijd kunnen vaststellen. Het is aanbevolen dat passende positieve en/of negatieve controles in het experiment te volledig ezels worden ingeschreven het effect van behandeling op de cellijnen. Praktijk van deze bepaling moet worden ingevuld als erkenning voor zijn beperkingen. Deze bepaling garandeert niet dat cellulaire migratie resultaten uit in vitro experimenten direct naar in vivo uitkomsten. vertalen zal Wond genezing en cellulaire migratie in een complexe levende systeem omvat een veelheid van celtypes en moleculaire signalen; elk daarvan heeft het potentieel om genezing reacties beïnvloeden.

Kortom, de kras assay gebleken om high-throughput screening van cellulaire migratie in reactie op veranderende omgevingen^6,25. Wij specifiek gebruikt dit protocol om met succes de opsporing van wijzigingen in cellulaire migratie als gevolg van arseen blootstelling bij verschillende milieu relevante doses. Deze gegevens hebben verstrekt rechtvaardiging voor het gebruik van de kras assay voor verdere studie en evalueren de mechanistische trajecten van de cellulaire migratie in deze test en hoe deze trajecten zijn gewijzigd door arseen blootstelling.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Class II A/B3 Biologische Veiligheidskasten	Forma Scientific	15201-816
Nitril Handschoenen	Kimberly-Clark	55082
Waterbad	Precision	Model 182
Omgekeerd Microscoop	Leica	Q080318
CPR Centrifuge	Beckman	349702
Analytische Weegschaal	Ohaus	I093 1125062111P
Weegpapier	VWR	H351125781212A
Biohazard zakken	Fisherbran	01-830A
Water Jacketed CO2 Incubator	Thermo Scientific	309739-31053
Hanks Balanced Salt Solution	Gibco	14175-095
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	10566-016
Fetaal Runderserum	Gibco	26140-079
Automatische Pipettor	Drummond	140685
p200 Pipet	Gilson
p20 Pipet	Gilson
Denominator	Fisher Scientific	D59707
Trypan Blauw Stain	Gibco	15250-061
T75 weefselfles	Corning	430725U
15 mL Conische Buizen	Fisherbrand	05-539-5
50 mL Conische Buizen	VWR	21008-178
5 mL Pipet	Fisherbrand	13-678-11D
10 mL Pipet	Fisherbrand	13-678-11E
Weefsel Marker	Securline	92167
Doekjes	Kintech	34155
70% Ethanol	Fisher	63-67-0
Niet-Filter Pipet Tips	Fisherbrand	16160210
Bleekmiddel	Great Value	220-04
96-well	Falcon	353915
Cryovial Rack	Nalgene	5030-0505
Hemacytometer	Gizmo Supply	B00SCOGY56
TrypLE Express	Gibco	12605-028
Conische Buizen Rack	n/a	n/a
12-well plate	Corning	3598
Afval Beker	n/a	n/a
1 mL Pipet	Fisherbrand	13-678-11B
Lijnrechte Ruler	n/a	n/a
Human neonatal dermal fibroblasten (hDFn)	lot: 1734, 2902	106-05n
Rstudio Statistisch Software		ver: 3.5.1
Image J	NIH	ver: 1.8.0_112