Multicolor Stroom Cytometry gebaseerde kwantificering van Mitochondria en lysosomen in T cellen

Summary

Dit artikel illustreert een krachtige methode om te kwantificeren mitochondriën of lysosomen in levende cellen. De combinatie van lysosoom - of mitochondriën-specifieke kleurstoffen met fluorescently geconjugeerde antilichamen tegen oppervlakte markeringen zorgt ervoor dat de kwantificering van deze organellen in gemengde cel populaties, zoals primaire cellen geoogst van weefselmonsters, met behulp van Multicolor stroom cytometry.

Abstract

T-cellen maken gebruik van verschillende metabole programma's op maat van hun functionele behoeften tijdens de differentiatie en proliferatie. Mitochondriën zijn cruciale cellulaire componenten verantwoordelijk voor het verstrekken van de energie van de cel; overtollige mitochondriën produceren echter ook reactieve zuurstof soorten (ROS), die leiden celdood tot kan. Het aantal mitochondriën moet daarom voortdurend worden aangepast aan de noden van de cellen. Deze dynamische verordening wordt ten dele bereikt door de functie van lysosomen dat overschot/beschadigde organellen en macromoleculen verwijderen. Vandaar, cellulaire mitochondriale en lysosomale inhoud zijn belangrijke indicatoren voor de evaluatie van de metabole aanpassing van cellen. Met de ontwikkeling van sondes voor organellen, zijn goed gekarakteriseerd lysosoom of mitochondriën-specifieke kleurstoffen beschikbaar gekomen in verschillende formaten om te etiketteren cellulaire lysosomen- en mitochondriën. Multicolor stroom cytometry is een gemeenschappelijk instrument om profiel cel fenotypen, en heeft de mogelijkheid om te worden geïntegreerd met andere testen. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol over het organel-specifieke kleurstoffen combineren met oppervlakte markeringen voor het meten van de hoeveelheid lysosomen- en mitochondriën in andere T-cel populaties op een stroom cytometer kleuring.

Introduction

De activering en de proliferatie van T cellen zijn kritische stappen voor de montage van de succesvolle immuunrespons. Recente vooruitgang suggereren dat het cellulaire metabolisme strak gekoppeld aan zowel de ontwikkeling en de functies van T-cellen is. Bijvoorbeeld, vertrouwen naïef T cellen grotendeels op oxidatieve fosforylatie (OXPHOS) om te voldoen aan de vraag naar energie tijdens de recirculatie onder secundaire lymfoïde organen. Na activatie ondergaan naïef T cellen drastische metabole herprogrammering, met inbegrip van de inductie van aërobe glycolyse ATP productie te verhogen en om te voldoen aan de enorme metabole eisen tijdens celdifferentiatie en proliferatie. De cellen die niet te volgen via de metabolische behoeften sterven door apoptosis^1,2. Tijdens de metabole herprogrammering, spelen mitochondria een belangrijke rol omdat zij de organellen grotendeels verantwoordelijk voor de productie van ATP om energie voor de cel, en de inhoud van de cellulaire mitochondriën tijdens metabole schakelaars schommelt in de gehele T cel ontwikkeling en activering³. Echter, de accumulatie van overtollige of beschadigde mitochondriën overtollige ROS die schade van DNA, lipiden en proteïnen, en kan uiteindelijk leiden tot de dood⁴ cel kan produceren

De mitochondriën van het overmatig of beschadigd ten gevolge van metabolische omzetting worden verwijderd door een gespecialiseerde vorm van autophagy⁵, bekend als mitophagy. Mitochondriën zijn verpakt door autophagosomes en vervolgens gesmolten met lysosomen voor afbraak. Dit sluit communicatie tussen mitochondriën en lysosomen hebben gegenereerd grote belangstelling^6,7. Bijvoorbeeld, oxidatieve stress stimuleert mitochondriën om te vormen van de mitochondriën-derived vesicles (MDVs) die op lysosomen voor afbraak in een fosfatase en Tenzin homolog (PTEN gericht zijn)-geïnduceerde putatief kinase 1 (PINK1) en parkin (een E3 ubiquitin ligase) afhankelijke wijze⁸. Ook bleek dat mitophagy is essentieel voor beige-naar-wit adipocyte overgang^9,10. Nog belangrijker, zijn lysosomen niet alleen een aantasting van het compartiment, maar ook een regulator van cellulaire signalering. Buitensporige substraat accumulatie te wijten aan de tekortkomingen van het enzym leidt tot een lysosomale dysfunctie door het verstoren van de lysosomale membraan permeabiliteit en Ca^{2 +} homeostase¹¹beïnvloedt. De T cel functionele defecten in lysosomale zure lipase (LAL)¹² of lysosomale metaboliet vervoerder knockout muis model¹³ bleek verder het belang van lysosomen in het handhaven van de T cel homeostase. Mitochondriën zowel lysosomen zijn onlosmakelijk met elkaar verbonden delen van cellulaire metabole verordening. Daarom is de meting van het cellulaire mitochondriale een cruciale indicator om te evalueren van de T cel metabole en functionele status geweest.

Gebruikte te kwantificeren van cellulaire mitochondriale of lysosomale inhoud testen omvatten immunoblot, elektronenmicroscopie immunefluorescentie (IF) kleuring en PCR analyse van mitochondriaal DNA kopie nummers^{14,15, 16}. terwijl immunoblot kwantitatief eiwitniveaus over verschillende monsters en elektron of vergelijken kan als microscopie morfologische kenmerken van deze organellen¹⁷kunt visualiseren, deze gehaltebepalingen dragen bepaalde technische nadelen. Bijvoorbeeld, is het tijdrovend te verwerven van voldoende aantal cel beelden met hoge vergroting en resolutie of wilt vergelijken in de niveaus van de expressie van een proteïne over tientallen monsters, maken deze gehaltebepalingen beschouwd als lage doorvoersnelheid methoden. Deze testen kunnen bovendien alleen worden toegepast, tot homogene celpopulatie, zoals cellijnen, maar niet tot weefselsteekproeven dat bestaat uit een gemengde bevolking.

Het is ook moeilijk toe te passen deze gehaltebepalingen op zeldzame populaties, waarvoor de eis voor minimale cel nummers van 10⁶ tot 10⁸ onmogelijk is om te voldoen aan. Ten slotte, cellen zijn meestal lysed of vaste tijdens het proces, waardoor ze onverenigbaar zijn met andere methoden verder om informatie te extraheren. Vergeleken met de traditionele methoden, TL gebaseerde stroom cytometry heeft een relatief hoge doorvoersnelheid - de informatie van alle cellen binnen een steekproef samengesteld van gemengde cel bevolking kan worden geanalyseerd en gelijktijdig verzameld. Daarnaast kan detecteren meer dan 10 parameters op dezelfde cel en sorteren van de cellen op basis van gewenste fenotypen voor verdere testen. Reactieve fluorescerende sondes zijn gebruikt om het label lysosomen- en mitochondriën in levende cellen en kunnen worden gedetecteerd door stroom cytometry^18,19. Deze organel-specifieke sondes zijn cel doorlaatbare en fysisch-chemische eigenschappen die de mogelijkheid moet worden geconcentreerd in de specifieke subcellular locaties of organellen. Deze sondes zijn gunstig, beschikbaar in verschillende TL formaten, zodat hun toepassing voor multicolor analyse.

Dit protocol beschrijft in detail hoe combineren oppervlakte marker kleuring met lysosoom - of mitochondriën-specifieke kleurstoffen aan label lysosomen of mitochondriën in levende cellen. Dit is vooral handig voor monsters die zijn gegenereerd op basis van primaire weefsels en organen, die vaak bestaan uit heterogene cel populaties. Onderzoekers kunnen identificeren cel populaties van belang door hun oppervlakte marker-expressie en specifiek meten de lysosomale of mitochondrial inhoud via organel-specifieke kleurstoffen in deze cellen. Hier tonen we de gedetailleerde procedure voor flow cytometrische analyse die wordt geëvalueerd als de lysosomale of mitochondrial massa in de grote milt T cel subpopulaties.

Protocol

De muis weefsel oogst beschreven procedure hier is goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de nationale universiteit van de Yang-Ming.

1. voorbereiding van de lymfocyt schorsing van lymfoïde organen

1. De muis door een erkende methode zoals CO₂ inademing in een transparant acryl kamer gevolgd door cervicale dislocatie om dood euthanaseren.
   Opmerking: Houd het debiet van CO₂ voor een verplaatsing van de 20% per minuut van de kamer, en niet hoger dan 5 psi (pond per vierkante inch). Het duurt 2-3 min voor een muis aan het bewustzijn verliezen. Gedurende de CO₂ stroom ten minste 1 min nadat het dier is gestopt met ademen (5-7 min algemene).
2. Plaats de muis op de rug op een schoon bord (bijvoorbeeld een polystyreen plastic board) en monteren van de ledematen met tape. Spoel met 70% ethanol.
3. Oogst van de milt, gesneden en openen van de buikholte met een 11-cm ontleden schaar (de milt is onder de buik en boven de linker nier). Verwijder de milt met pincet en reinig van bindweefsel (gebruik schaar indien nodig).
4. Het verkrijgen van de zwezerik, knippen het middenrif en de ribbenkast aan weerszijden met het ontleden van de schaar. Gebruik pincet te verheffen van het borstbeen te onthullen de hele borstholte. Scheiden van de thymus zorgvuldig uit de omliggende weefsels met een schaar, en verwijder eventuele resterende bindweefsel op een papieren handdoek bevochtigd met PBS.
5. Mechanisch distantiëren de weefsels met een zuiger van de spuit in een 6-cm schotel met 5 mL ijskoud FACS buffer (PBS aangevuld met 2% foetale runderserum (FBS) en 1 mM EDTA). Breng de eencellige een centrifugebuis 15 mL; wassen van de 6-cm schotel met extra 2 mL FACS buffer en de wash combineren met celsuspensie ook.
6. Centrifugeer de celsuspensie (300 x g, voor 5 min bij 4 ° C) en verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet met 2 mL van Ammonium-Chloride-kalium (ACK) lysing van buffer (155 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃ en 0.1 mM nb₂EDTA) voor 1 minuut bij kamertemperatuur (RT) lyse van de rode bloedcellen. Neutraliseer de ACK buffer door het toevoegen van 10 mL FACS buffer aan de celsuspensie.
7. Centrifugeer de celsuspensie (300 x g, voor 5 min bij 4 ° C) en verwijder het supernatant. Resuspendeer de cellen in 5 mL van volledige RPMI medium (RPMI 1640 medium, aangevuld met 44 mM NaHCO₃10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic zuur (HEPES), 100 U/mL penicilline, 100 mg/mL streptomycine, 2 mM L-glutamine, 1 mM natrium pyruvaat, 1% MEM niet-essentiële aminozuren en 10% FBS).
8. Filter celsuspensie door een zeef (porie grootte 70 µm) van de cel te verwijderen van de bosjes van de cel. Cellen tellen met een hemocytometer of geautomatiseerde cel teller.

2. kwantificering van Mitochondria en lysosomen

Opmerking: Voer het organel-specifieke kleurstof vlekken eerst omdat de optimale kleuring voorwaarde voor deze kleurstoffen incubatie bij 37 ° C. is De oppervlakte marker kleuring kan aanzienlijk worden verkleind door antilichaam aftopping en internalisering bij die temperatuur.

1. 1 x 10⁶ cellen om ronde-onderlaag FACS buizen, centrifugeer cellen (300 x g, voor 5 min bij 4 ° C) en weggeworpen toevoegen.
2. Verdun de voorraadoplossingen van de sonde te werken eindconcentratie (100 nM MitoTracker Green of LysoTracker Green; voortaan mitochondriën - of lysosoom-specifieke kleurstof, respectievelijk) in serumvrij cultuurmedium voorverwarmde 37 ° C. Dit is de werkoplossing voor lysosoom - of mitochondriën-specifieke kleurstof.
   Opmerking: Test meerdere concentraties, met inbegrip van het aantal werkende concentraties voorgesteld door fabrikant (20-200 nM voor de mitochondriën-specifieke kleurstof) en 50-75 nM voor de lysosoom-specifieke kleurstof gebruikt hier om het verkrijgen van de beste kleuring van efficiëntie. Kies een celpopulatie die erom bekend te hebben goede uitdrukking voor de kleuring van de doelgroep (bijvoorbeeld lysosomen) als positieve controle (bijvoorbeeld menselijke CD14⁺ monocyten). Kies van de concentratie van de werken op basis van goede scheiding tussen positieve en negatieve kleuring, evenals een levensvatbaarheid van de goede cellen.
3. Resuspendeer de cellen in 100 µL van de lysosoom - of mitochondriën-specifieke kleurstof werkoplossing en incubeer in 5% CO₂ incubator bij 37 ° C voor 15 min of 30 min, respectievelijk.
4. Voeg 1 mL ijskoud FACS buffer om te stoppen met de reactie. Pellet cellen door middel van centrifugeren (300 x g, voor 5 min bij 4 ° C) en weggeworpen. Cellen zijn nu klaar voor oppervlakte marker kleuring.

3. oppervlakte Marker kleuring

1. Blok Fc receptoren met 100 µL van gepretitreerde 2.4G2 hybridoma supernatant op ijs voor 10 min. Wash cellen met 1 mL van FACS buffer en centrifuge (300 x g, voor 5 min bij 4 ° C). Vloeistof wordt weggeworpen.
2. Incubeer de cellen met 50 µL gepretitreerde fluorescentie-geconjugeerde antilichaam combinatie in FACS buffer op ijs gedurende 20 minuten licht.
   Opmerking: Bereiden afzonderlijke kleur gebeitste cellen omvatten alle de fluorescerende antilichamen aanwezig in het antilichaam combinatie en cellen behandeld slechts organel-specifieke kleurstof voor het instellen van spanningen van elke fluorescentie detector en compensatie aanpassing op stroom cytometer. Op dezelfde manier bereiden de fluorescentie min één (FMO) als achtergrond controles met behulp van cellen met alle de antilichamen, maar zonder kleuring met organel-specifieke kleurstoffen gekleurd.
3. De cellen door toevoeging van 1 mL van FACS buffer en pellet door middel van centrifugeren (300 x g, voor 5 min bij 4 ° C) wassen. Vloeistof wordt weggeworpen.
4. Resuspendeer de cellen in 300 µL van FACS buffer met 1 µg/mL propidium jodide (PI) en onmiddellijk het analyseren van de monsters op stroom cytometer.

4. sample collectie op stroom Cytometer

1. Inschakelen van de computer, stroom cytometer, FACS acquisitie software en andere accessoire apparaten afhankelijk van het platform van de machine. Voer PBS voor ongeveer 1 minuut om de stroom lijn is gevuld met PBS en schede buffer. Zorg ervoor dat de stroom stroom op wieltjes loopt.
2. Open nieuw experiment en selecteer cytometer parameters (fluorescerende detectoren) volgens instructies van de fabrikant. Filteren van cellen tot en met 70-µm cel zeef en vortex voorafgaand aan de overname van elk monster klontjes en doublet vorming te voorkomen.
3. Maken van dot percelen van voorwaartse scatter (FSC) en kant scatter (SSC), die respectievelijk Celgrootte en granulariteit, vertegenwoordigen. Optimaliseer de spanningen van de FSC en SSC om ervoor te zorgen dat de cellen van belang in de percelen worden weergegeven. Maken van de dot percelen van FSC-A vs. FSC-W (of FSC-H) en teken een poort voor de afzonderlijke cellen.
4. Stip percelen van elke fluorescerende parameter maken Onbevlekt cellen worden gebruikt voor het bepalen van de achtergrond signaal en één kleur gebeitste besturingselementen gebruiken en aan te passen spanningen van elke fluorescerende parameter, zodat positieve en negatieve cel populaties duidelijk te onderscheiden zijn binnen het dynamisch bereik van de overname.
5. Nadat alle de spanningen zijn ingesteld, gebruik van auto-compensatie indien beschikbaar, of handmatig aanpassen van de schadevergoeding met onbevlekt en één kleur gebeitste besturingselementen te corrigeren van de spectrale spill-over. Toepassing van de vergoeding op monsters.
6. Maak een stip plot voor elke parameter en poorten volgens uw experimentele reeks stelt. Bijvoorbeeld FSC-A vs. FSC-H (of FSC-W) uit te sluiten van paren, gevolgd door FSC-A vs. SSC-A voor lymfocyt gating; SSC-A vs. PI (levende cellen) en CD4 vs. CD8 (Figuur 1).
7. Het verzamelen van genoeg gebeurtenissen (totale celaantal) voor zinvolle vergelijking tussen populaties. Normaal gesproken moeten ten minste 1.000 gebeurtenissen in de bevolking van belang²⁰worden verkregen.
8. Nadat alle monsters zijn verworven, stroom gegevens exporteren naar door stroom cytometry analysesoftware worden geanalyseerd. Het experiment opslaan als sjabloon de cytometer instelling en de parameters voor de toepassing van soortgelijke experimenten in de toekomst te bewaren.

5. de gegevensanalyse

Opmerking: Er zijn veel tools om stroom cytometrische gegevens, zowel commercieel als vrije software te analyseren. De software van de overname van de flow cytometers kan ook werken voor data-analyse. Hier wordt FlowJo gebruikt als voorbeeld.

1. Start de software en sleep de FCS-bestanden naar de werkruimte. Klik op een voorbeeld om een grafisch venster te openen. Selecteer parameters worden gepresenteerd op X- en Y-as door te klikken op de X- en Y-assen. Gebruik de werkbalk om te tekenen poorten volgens differentially uitgedrukte markeringen of gedefinieerde fenotypes van cel populaties.
2. Toevoegen van poorten van elke parameter zoals aangegeven in Figuur 1. Sleep poorten naar alle monsters in de werkruimte, zodat ze identiek gating.
3. Sleep de percelen aan layout editor om grafische rapporten te maken.
4. De gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) voor elke bevolking van belang weergeven door te klikken op de knop Statistieken (Σ) in een grafisch venster en "Verstaan" en de juiste parameter, bijvoorbeeld het kanaal gebruikt voor het opsporen van organel-specifieke kleurstof te kiezen. Klik vervolgens op "Toevoegen".
5. Klik op het tabelpictogram editor en sleep MFI naar tabel editor om statistische rapporten te maken. Opslaan als Excel-, tekst- of CSV-bestand voor het berekenen van de delta MFI (ΔMFI) als MFI (organel-specifieke kleurstoffen) - MFI (FMO).
   Opmerking: Kan niet berekenen MFI tussen monsters verworven met verschillende cytometer instellingen (spanningen, fluorescerende kanalen of compensatie). Vergelijkingen van de waarden die zijn afgeleid van experimenten met verschillende instellingen zijn zinloos en vooringenomen.
6. Alle waarden uit de werkruimte en de percelen van de redacteur van de lay-out exporteren voor het maken van tabellen en figuren.

Results

Identificatie van belangrijke T cel subsets in de milt en de thymus

Kortom, waren eencellige schorsingen van de milt en de thymus lysed van rode bloedcellen, geïncubeerd met 2.4G2 supernatant, gevolgd door organel-specifieke kleurstof en oppervlakte marker kleuring met fluorescentie-geconjugeerde antilichamen (tabel 1). De ontwikkelingstoxiciteit progressie van thymocytes kan worden beschreven m...

Discussion

Dit protocol combineert organel-specifieke kleurstoffen en oppervlakte marker vlekken om te kwantificeren van het bedrag van de mitochondriën of lysosomen in andere T-cel populaties. Deze methode is ontwikkeld om te overwinnen de beperking van cel nummer en homogeniteit eisen voor traditionele methoden, zoals elektronenmicroscopie en immunoblot analyse. Het is vooral nuttig in zeldzame cel populaties te analyseren en gelijktijdig behandeling van meerdere celtypen tegelijk.

De duur van de proce...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Graefe forceps (straight en getand)	Dimeda
11 cm Iris schaar (recht met scherp/scherpe koppen)	Dimeda
15 mL centrifugebuisje	Thermo Fisher Scientific	339650
5 mL spuit	TERUMO
6 cm Petri-schaal	α-plus
70 µm nylon celfilter	SPL Lifesciences	93070
Ammoniumchloride (NH4Cl)	Sigma	A9434
Anti-muis CD25	Biolegend	102007	Clone:PC61
Anti-muis CD4	Biolegend	100453	Clone:GK1.5
Anti-muis CD44	Biolegend	103029	Clone:IM7
Anti-muis CD62L	Biolegend	104407	Clone:MEL-14
Anti-muis CD8	Biolegend	100713	Clone:53-6.7
Anti-muis TCRβ	Biolegend	109233	Clone:H57-579
BD LSRFortessa	BD Biosciences
Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)	Bio basic	6381-92-6
FALCON 5ml Polystyreen Ronde-Bodembuis (FACS buis)	BD Biosciences	352052
Fetaal bovien serum (FBS)	Hyclone	ATD161145
Flowjo, LLC	BD Biosciences
Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic zuur (HEPES)	Sigma	H4034
L-glutamine (200 mM)	Gibco	A2916801
LysoTracker Green DND26	Thermo Fisher Scientific	L7526
MEM Niet-essentiële aminozuren (100X)	Gibco	11140050
MitoTracker Green FM	Thermo Fisher Scientific	M7514
Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL)	Gibco	15140122
Kaliumbicarbonaat (KHCO3)	J.T.baker	298-14-6
Propidium jodide oplossing	Sigma	25535-16-4
RPMI 1640 medium (poeder)	Gibco	31800089
Natriumbicarbonaat (NaHCO3)	Sigma	S5761
Natriumpyruvaat (100 mM)	Gibco	11360070