Multicolor Stroom Cytometry gebaseerde kwantificering van Mitochondria en lysosomen in T cellen

Summary

Dit artikel illustreert een krachtige methode om te kwantificeren mitochondriën of lysosomen in levende cellen. De combinatie van lysosoom - of mitochondriën-specifieke kleurstoffen met fluorescently geconjugeerde antilichamen tegen oppervlakte markeringen zorgt ervoor dat de kwantificering van deze organellen in gemengde cel populaties, zoals primaire cellen geoogst van weefselmonsters, met behulp van Multicolor stroom cytometry.

Abstract

T-cellen maken gebruik van verschillende metabole programma's op maat van hun functionele behoeften tijdens de differentiatie en proliferatie. Mitochondriën zijn cruciale cellulaire componenten verantwoordelijk voor het verstrekken van de energie van de cel; overtollige mitochondriën produceren echter ook reactieve zuurstof soorten (ROS), die leiden celdood tot kan. Het aantal mitochondriën moet daarom voortdurend worden aangepast aan de noden van de cellen. Deze dynamische verordening wordt ten dele bereikt door de functie van lysosomen dat overschot/beschadigde organellen en macromoleculen verwijderen. Vandaar, cellulaire mitochondriale en lysosomale inhoud zijn belangrijke indicatoren voor de evaluatie van de metabole aanpassing van cellen. Met de ontwikkeling van sondes voor organellen, zijn goed gekarakteriseerd lysosoom of mitochondriën-specifieke kleurstoffen beschikbaar gekomen in verschillende formaten om te etiketteren cellulaire lysosomen- en mitochondriën. Multicolor stroom cytometry is een gemeenschappelijk instrument om profiel cel fenotypen, en heeft de mogelijkheid om te worden geïntegreerd met andere testen. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol over het organel-specifieke kleurstoffen combineren met oppervlakte markeringen voor het meten van de hoeveelheid lysosomen- en mitochondriën in andere T-cel populaties op een stroom cytometer kleuring.

Introduction

De activering en de proliferatie van T cellen zijn kritische stappen voor de montage van de succesvolle immuunrespons. Recente vooruitgang suggereren dat het cellulaire metabolisme strak gekoppeld aan zowel de ontwikkeling en de functies van T-cellen is. Bijvoorbeeld, vertrouwen naïef T cellen grotendeels op oxidatieve fosforylatie (OXPHOS) om te voldoen aan de vraag naar energie tijdens de recirculatie onder secundaire lymfoïde organen. Na activatie ondergaan naïef T cellen drastische metabole herprogrammering, met inbegrip van de inductie van aërobe glycolyse ATP productie te verhogen en om te voldoen aan de enorme metabole eisen tijdens celdifferentiatie en prolife....

Protocol

De muis weefsel oogst beschreven procedure hier is goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de nationale universiteit van de Yang-Ming.

1. voorbereiding van de lymfocyt schorsing van lymfoïde organen

1. De muis door een erkende methode zoals CO₂ inademing in een transparant acryl kamer gevolgd door cervicale dislocatie om dood euthanaseren.
   Opmerking: Houd het debiet van CO₂ voor een verplaatsing van de 20% per minuut van de kamer, en niet hoger dan 5 psi (pond per vierkante inch). Het duurt 2-3 min voor een muis aan het bewustzijn verliezen. Gedurende de CO₂ str....

Results

Identificatie van belangrijke T cel subsets in de milt en de thymus

Kortom, waren eencellige schorsingen van de milt en de thymus lysed van rode bloedcellen, geïncubeerd met 2.4G2 supernatant, gevolgd door organel-specifieke kleurstof en oppervlakte marker kleuring met fluorescentie-geconjugeerde antilichamen (tabel 1). De ontwikkelingstoxiciteit progressie van thymocytes kan worden beschreven m.......

Discussion

Dit protocol combineert organel-specifieke kleurstoffen en oppervlakte marker vlekken om te kwantificeren van het bedrag van de mitochondriën of lysosomen in andere T-cel populaties. Deze methode is ontwikkeld om te overwinnen de beperking van cel nummer en homogeniteit eisen voor traditionele methoden, zoals elektronenmicroscopie en immunoblot analyse. Het is vooral nuttig in zeldzame cel populaties te analyseren en gelijktijdig behandeling van meerdere celtypen tegelijk.

De duur van de proce.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Graefe forceps (straight and serrated)	Dimeda
11 cm Iris scissors (straight with sharp/sharp heads)	Dimeda
15 mL centrifuge tube	Thermo Fisher Scientific	339650
5 mL syringe	TERUMO
6 cm Petri dish	α-plus
70 µm nylon cell strainer	SPL Lifesciences	93070
Ammonium chloride (NH4Cl)	Sigma	A9434
Anti-mouse CD25	Biolegend	102007	Clone:PC61
Anti-mouse CD4	Biolegend	100453	Clone:GK1.5
Anti-mouse CD44	Biolegend	103029	Clone:IM7
Anti-mouse CD62L	Biolegend	104407	Clone:MEL-14
Anti-mouse CD8	Biolegend	100713	Clone:53-6.7
Anti-mouse TCRβ	Biolegend	109233	Clone:H57-579
BD LSRFortessa	BD Biosciences
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Bio basic	6381-92-6
FALCON 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube (FACS tube)	BD Biosciences	352052
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	ATD161145
Flowjo, LLC	BD Biosciences
Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Sigma	H4034
L-glutamine (200 mM)	Gibco	A2916801
LysoTracker Green DND26	Thermo Fisher Scientific	L7526
MEM Non-essential amino acids (100X)	Gibco	11140050
MitoTracker Green FM	Thermo Fisher Scientific	M7514
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
Potassium bicarbonate (KHCO3)	J.T.baker	298-14-6
Propidium iodide solution	Sigma	25535-16-4
RPMI 1640 medium (powder)	Gibco	31800089
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma	S5761
Sodium pyruvate (100 mM)	Gibco	11360070