Oprichting van virale infectie en analyse van Host-Virus interactie bij Drosophila Melanogaster

Summary

Dit protocol wordt beschreven hoe om virale infectie in vivo bij Drosophila melanogaster met behulp van de methode van de nano-injectie en de basistechnieken voor het analyseren van virus-gastheer interactie.

Abstract

Verspreiding van het virus is een belangrijke oorzaak van epidemische ziekten. Inzicht in de interactie tussen het virus en de host is dus heel belangrijk om uit te breiden onze kennis van preventie en behandeling van virale infectie. De fruitvlieg Drosophila melanogaster heeft bewezen als een van de meest efficiënte en productieve modelorganismen scherm voor antivirale factoren te onderzoeken van virus-gastheer interactie, als gevolg van krachtige genetische hulpmiddelen en zeer geconserveerde aangeboren immuun Signaalroutes. De hier beschreven procedure toont een nano-injectie methode om te zetten virale infectie en induceren systemische antivirale reacties in volwassen vliegen. De nauwkeurige controle van de virale injectie dosis bij deze methode kan hoge experimentele reproduceerbaarheid. Protocollen die zijn beschreven in deze studie zijn de voorbereiding van vliegen en het virus, de injectie methode overleving tarief analyse, de meting van de lading virus en eenbeoordeling van de antivirale traject. De effecten van de invloed van virale infectie door het vliegen achtergrond werden hier vermeld. Deze infectiemethode is gemakkelijk uit te voeren en kwantitatief herhaalbare; het kan worden toegepast op het scherm voor host/virale factoren betrokken bij virus-gastheer interactie en ontleden de Overspraak tussen aangeboren immuun signalering en andere biologische trajecten in reactie op virale infectie.

Introduction

Virale infecties, met name door arboviruses, zoals het Chikungunya virus¹, opkomende het Dengue-virus, het gele koorts virus² en de Zikavirus³, zijn een enorme bedreiging voor de volksgezondheid door het veroorzaken van pandemieën ⁴. zo een beter begrip van virus-gastheer interactie is steeds belangrijker geworden voor epidemische controle en behandeling van virale ziekten bij de mens. Voor dit doel, worden meer passende en efficiënte modellen vastgesteld om de onderzoeken van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de virusinfectie.

Protocol

Opmerking: Voordat u begint experiment, de cellijnen en vliegen voorraden gebruikt mag niet verontreinigd zijn door andere ziekteverwekkers, met name voor virussen zoals DCV, FHV, Drosophila X virus (DXV), en aviaire nefritis virus (ANV). Idealiter worden RNA sequencing of een eenvoudiger PCR-gebaseerde identificatie gebruikt voor het detecteren van de besmetting^10,45. Als er besmetting optreedt, de cellijnen en vliegen voorraden dient niet meer totdat zij zijn ontsmet volledig⁴⁶.

1. virus en vliegen voorbereiding

1. Vermeerdering van het virus....

Results

Resultaten van deze afdeling worden verkregen na DCV infectie van D. melanogaster. Figuur 1 toont het stroomschema van virale infectie in Drosophila. Vliegen tijdens thoracically worden ingespoten, en vervolgens de monsters worden genomen voor de meting van de virale TCID₅₀ en het genoom RNA niveau (Figuur 1). Virusinfectie kan veroorzaken lysis van de cel en CPE is waargenomen bij 3 dagen post infectie (figuur 2A). De virus belasting gemeten.......

Discussion

In dit artikel presenteren we een gedetailleerde procedure op hoe een systeem te zetten virale infectieziekten bij volwassen Drosophila melanogaster gebruik nano-injectie. De protocollen zijn de voorbereiding van de passende vliegen lijnen en virus voorraad, infectie technieken, de evaluatie van besmettelijke indicatoren en het meten van de antivirale reactie. Hoewel DCV wordt gebruikt als een voorbeeld van een virale ziekteverwekker, zijn tientallen verschillende soorten virus met succes toegepast voor studie i.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22um filter	Millipore	SLGP033RS
1.5 ml Microcentrifuge tubes	Brand	352070
1.5 ml RNase free Microcentrifuge tubes	Axygen	MCT-150-C
10 cm cell culture dish	Sigma	CLS430167	Cell culture
100 Replacement tubes	Drummond Scientific	3-000-203-G/X
15 ml tube	Corning	352096
ABI 7500 qPCR system	ABI	7500	qPCR
Cell Incubator	Sanyo	MIR-553
Centriguge	Eppendof	5810R
Centriguge	Eppendof	5424R
Chloroform	Sigma	151858	RNA extraction
DEPC water	Sigma	95284-100ML	RNA extraction
Drosophila Incubator	Percival	I-41NL	Rearing Drosophila
FBS	Invitrogen	12657-029	Cell culture
flat bottom 96-well-plate	Sigma	CLS3922	Cell culture
Fluorescence microscope	Olympus	DP73
Isopropyl alcohol	Sigma	I9516	RNA extraction
Lysis buffer (RNA extraction)	Thermo Fisher	15596026	TRIzol Reagent
Lysis buffer (liquid sample RNA extraction)	Thermo Fisher	10296028	TRIzol LS Reagent
Microscope	Olympus	CKX41
Nanoject II Auto-Nanoliter Injector	Drummond Scientific	3-000-204	Nanoject II Variable Volume (2.3 to 69 nL) Automatic Injector with Glass Capillaries (110V)
Optical Adhesive Film	ABI	4360954	qPCR
Penicillin-Streptomycin, Liquid	Invitrogen	15140-122	Cell culture
qPCR plate	ABI	A32811	qPCR
Schneider’s Insect Medium	Sigma	S9895	Cell culture
statistical software	GraphPad Prism 7
TransScript Fly First-Strand cDNA Synthesis SuperMix	TransScript	AT301	RNA extraction
Vortex	IKA	VORTEX 3	RNA extraction