Bepaling van regelgevende T cel Subsets in lymfkliertest Thymus, alvleesklier aftappen lymfeklier en milt met behulp van Stroom Cytometry

Samenvatting

Hierin presenteren wij een protocol om te bereiden enkele cellen uit lymfkliertest thymus, alvleesklier aftappen lymfeklier en milt aan verdere studie deze cellen met behulp van stroom cytometry. Bovendien, werd dit protocol gebruikt voor het bepalen van de deelverzamelingen van regulatoire T-cellen met behulp van stroom cytometry.

Samenvatting

Ons immuunsysteem bestaat uit een aantal en de verscheidenheid van immune cellen, met inbegrip van regulatoire T-cellen (Walter) cellen. Treg cellen kunnen worden onderverdeeld in twee subgroepen, serie afgeleide Treg (tTreg)-cellen en ook geïnduceerde Treg (pTreg) cellen. Ze zijn in verschillende organen van ons lichaam aanwezig en kunnen worden onderscheiden door specifieke markers, zoals Helios en Neuropilin 1. Er werd gemeld dat de tTreg cellen functioneel meer onderdrukkende dan pTreg cellen zijn. Het is daarom belangrijk om te bepalen van het aandeel van zowel tTreg als pTreg cellen, bij het onderzoeken van heterogene cel populaties. Hierin, verzameld wij serie klieren, de alvleesklier zuig lymfklieren en de milt van normoglycemic nietzwaarlijvige diabetesmuizen te onderscheiden van de tTreg cellen van pTreg cellen met behulp van stroom cytometry. Wij kunnen handmatig eencellige schorsingen van deze organen. Fluorescerende geconjugeerd oppervlakte CD4, CD8, CD25 en Neuropilin 1 antilichamen werden gebruikt om de cellen vlek. Ze waren 's nachts in de koelkast bewaren. Op de volgende dag waren de cellen gekleurd met fluorescerende geconjugeerd intracellulaire Foxp3 en Helios antilichamen. Deze markeringen werden gebruikt voor het karakteriseren van de twee subsets van Treg cellen. Dit protocol toont een eenvoudige, maar praktische manier voor te bereiden enkele cellen uit lymfkliertest thymus, alvleesklier aftappen lymfeklier en milt en ze gebruiken voor latere flow cytometrische analyse.

Inleiding

Regulatoire T (Walter) cellen zijn kritisch voor de homeostase van het immuunsysteem. Treg cellen worden gedefinieerd door de uitdrukking van oppervlakte antigenen CD4 en CD25, en de transcriptie factor forkhead vak P3 (Foxp3)^1,2,3. Sakaguchi et al. toonde eerst dat CD25 constitutively op T suppressor cellen in muizen⁴, die een baanbrekende constatering voor de identificatie van menselijke Treg cellen wordt uitgedrukt. Treg cellen spelen een centrale rol bij immuun tolerantie door uit te oefenen een onderdrukkende mogelijkheid via diverse mechanismen, met inbegrip van cytolysis via de secretie van granzymes voor het opwekken van apoptosis, cytokine consumptie en remming door middel van de expressie van cytotoxische T-lymfocyten antigeen 4⁵. Bovendien kunnen ze remmende cytokines zoals transformeren groeifactor bèta (TGF-β), interleukine-10 (IL-10) en IL-35⁵afscheiden. Treg cellen kunnen natuurlijk worden afgeleid uit de thymus, in welk geval zij serie afgeleide Treg (tTreg)-cellen zijn aangewezen, of ze kunnen in dat geval heten ook geïnduceerde Treg (pTreg) cellen in het perifere organen worden opgewekt.

Helios, een lid van de familie Ikaros transcriptie factor werd gemeld dat een marker voor onderscheid te maken tussen tTreg cellen en pTreg cellen⁶. Later, twee andere groepen gemeld dat Neuropilin 1 (Nrp1), een semaphorin III-receptor, als een oppervlak marker voor tTreg cellen onder bepaalde voorwaarden^{7,8 dienen kan}. Toch, Singh et al. is gebleken dat Helios een betere marker in dit verband in naïef muizen⁹.

De deelverzamelingen van Treg cellen spelen een centrale rol in het behoud van de homeostase van het immuunsysteem en de bescherming tegen autoimmuniteit en infectie. Daarom is het belangrijk om de getallen en verhoudingen van deze populaties in zowel de lymfoïde en de niet-lymfoïde weefsels. Om dit te bereiken, moet een eencellige schorsingen van deze organen voor te bereiden. Een aantal protocollen zijn beschreven of gebruikt in eerdere studies. Automatische dissociators werden vooral gebruikt in eerder gepubliceerde rapporten^10,11. Met behulp van de automatische dissociators is handig en tijdbesparend, maar het is een dure procedure. Daarom hebben we een handmatige methode gebruikt om te bereiden eencellige schorsingen van lymfkliertest serie klieren, de alvleesklier zuig lymfklieren (PDLNs) en de milt van normoglycemic nietzwaarlijvige diabetesmuizen (NOD) en geïsoleerde afzonderlijke cellen van deze organen. Deze methode is gebruikt in onze eerdere studies en we vonden dat de handmatige methode voor het opstellen van één celsuspensie zo efficiënt als automatische dissociator methode^{9,12,13,14 is}. Bovendien, we stroom cytometry gebruikt om te bepalen van de verhoudingen van CD4⁺CD8^-CD25⁺Foxp3⁺ Treg cellen en de subsets van Treg cellen tTreg en pTreg cellen. De tTreg en pTreg cellen werden onderscheiden met behulp van Helios en Nrp1 als markeringen voor tTreg cel. Zo blijkt uit onze resultaten dat de handmatige methode voor het voorbereiden van de afzonderlijke cellen efficiënt werkt en de schorsingen bereid eencellige verder kunnen worden gebruikt voor studies met stroom cytometry.

Protocol

Het Comité van de lokale dierlijke ethiek aan de Universiteit van Uppsala goedgekeurd de dierproeven.

1. het oogsten van organen van dieren

1. Offeren de muizen door cervicale dislocatie.
2. Plaats serie klieren en milt in 20 mL Scintillatie flesjes of 15 mL conische buizen gevuld met 5 mL Hanks´ evenwichtig zoutoplossing (HBSS). Plaats PDLNs in 1,5 mL micro buizen gevuld met 1 mL RPMI 1640. Gebruik de hele zwezerik en milt, en alle van de PDLNs.
   Opmerking: Organen moeten worden gehouden op het ijs gedurende de hele procedure en de onderzoeker moet proberen om snel bij de voorbereiding van eencellige schorsingen, vooral bij het verwerken van serie weefsel aangezien serie immune cellen kunnen snel worden afgebroken bij hoge temperaturen.

2. enkele cel los van zwezerik en milt

1. Knijp de zwezerik en milt grondig met een pincet om de immune cellen vrij te geven. Gooi de resterende serie en milt capsule.
2. De celsuspensie overbrengen in een conische tube van 15 mL en centrifugeer bij 433 x g gedurende 5 min bij 4 ° C tot het vormen van een pellet. Verwijder het supernatant.
3. Om lyse van de rode bloedcellen, resuspendeer de celsuspensie in 5 mL 0,2 M NH₄Cl en Incubeer bij kamertemperatuur voor 10 min. omkeren de buizen ondersteboven zachtjes elke 2 min. Voeg 5 mL van HBSS aan het eind van de incubatie om te stoppen met de lysis.
4. Centrifugeer de buizen bij 433 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
5. Resuspendeer de pellet cel in ongeveer 5 mL HBSS. Vul de buizen met HBSS.
6. Centrifugeer de buizen bij 433 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
7. Resuspendeer de pellet cel in ongeveer 5 mL HBSS. Vul de buizen met HBSS.
8. Centrifugeer de buizen bij 433 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
9. Resuspendeer de pellet cel in in HBSS voor thymus 5 mL en 10 mL voor de milt.
10. 1 mL van de serie celsuspensie overdracht en 500 µL van de milt celsuspensie tot 5 mL ronde onderkant buizen met de kappen van de zeef van de cel. De celsuspensie toepassen op de cel zeef caps.
    Opmerking: Een 35 µm nylon gaas is opgenomen in het GLB. Ongeveer 5-10 miljoen cellen werden verzameld in elke buis.

3. enkele cel los van PDLN

1. Plaats een steriele 250 µm metalen gaas over een conische tube van 15 mL in een rack. Spoel de Maas met 1 mL RPMI.
2. De lymfklieren overbrengen in de metalen gaas en vermalen hen via de Maas met behulp van een pincet. 1 mL van de RPMI van toepassing op de metalen gaas voor het spoelen van de cellen in de buis. Herhaal 3 keer en verwijderen van de Maas.
3. Centrifugeer de buizen bij 433 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
4. Resuspendeer de pellet cel in ongeveer 5 mL RPMI. Vul de buizen met RPMI.
5. Centrifugeer de buizen bij 433 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
6. Resuspendeer de pellet cel in ongeveer 5 mL RPMI. Vul de buizen met RPMI.
7. Centrifugeer de buizen bij 433 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
8. Resuspendeer de pellet cel in 2 mL zuiver RPMI. Overdracht de celsuspensie 2 mL tot 5 mL ronde onderkant buizen met de kappen van de zeef van de cel. De celsuspensie toepassen op de cel zeef caps.

4. Stroom Cytometry

1. Centrifugeer de cel schorsingen van zwezerik, PDLN en milt bij 433 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
2. De cellen met de volgende oppervlakte antilichamen in 100 µL van stroom cytometry buffer (FACS buffer) kleuring vlekken: 0,75 µg/100 µL CD4 FITC-geconjugeerd antilichaam, 0.60 µg/100 µL CD8 APC-H7-geconjugeerde antilichaam, 0,30 µg/100 µL CD25 PE-geconjugeerde antilichaam, 5 µL (1:20) APC-geconjugeerde antilichaam Nrp1. Incubeer de buizen op ijs voor 40 min.
3. Voeg 200 µL van FACS buffer toe aan elke buis. Centrifugeer de buizen bij 433 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant. Herhaal nog een keer.
4. Lossen en permeabilize van de cellen door het resuspending van de cel pellet in 500 µL van Permeabilization fixatie Buffer (PFB).
   Opmerking: PFB is bereid door mengen 1 deel van fixatie/Permeabilization concentreren met 3 delen van fixatie/Permeabilization verdunningsmiddel.
5. De buizen in de koelkast bewaren bij 4 ° C's nachts.
   Opmerking: Een 1 uur incubatie werkt ook.
6. Centrifugeer de buizen bij 433 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
7. Resuspendeer de pellet cel in 500 µL van Permeabilization wassen Buffer (PWB). Centrifugeer de buizen bij 433 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
   Opmerking: PWB wordt bereid door verdunning van Permeabilization Buffer (10 x) 1:10 in gedestilleerd water.
8. Vlekken van de cellen met de volgende intracellulaire antilichamen in 100 µL van PWB: 0,30 µg/100 µL Foxp3 PE-Cy7-geconjugeerde antilichaam, 4 µL (1:25) Helios PacificBlue-geconjugeerd antilichaam. Incubeer de buizen op het ijs gedurende 1 uur.
9. Voeg 500 µL van PWB aan elke buis. Centrifugeer de buizen bij 433 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
10. Resuspendeer de pellet cel in 500 µL van PWB. Centrifugeer de buizen bij 433 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
11. Resuspendeer de pellet cel in 300 µL van FACS buffer.
12. Het analyseren van de cellen in een flow-cytometer.
13. Poort van de enkele cellen op basis van kant Scatter-gebied, hoogte en breedte, en vooruit Scatter-gebied, hoogte en breedte. Voert een miljoen gebeurtenissen voor analyse.
14. Exporteer de FCS-bestanden van experimenten en analyseren met behulp van een stroom cytometry analyzer software.

Resultaten

Om te onderzoeken de uitdrukking van Nrp1 en Helios op tTreg en pTreg cellen, wij bereid enkele cellen uit de serie klieren, PDLNs en de milt van normoglycemic knik muizen en gekleurd hen met de Treg cel markeringen CD4, CD25, Foxp3, Helios en Nrp1 voor stroom cytometrische analyse. De resultaten werden geanalyseerd zoals aangegeven in de vertegenwoordiger gating strategieën (Figuur 1). We vonden dat het aandeel van Helios⁺ cellen onder CD4⁺

Discussie

In deze studie, we geïsoleerd van enkele cellen uit de serie klieren, de PDLNs en de milt van knik muizen, en onderzocht de expressie van Helios en Nrp1 in CD4⁺CD8^-CD25⁺Foxp3⁺ Treg cellen met behulp van stroom cytometry. In de huidige studie, werden knik muizen gebruikt, die is een lymfkliertest model van type 1 diabetes. In een eerdere studie, hebben we de wild type muis stammen CD-1 en C57BL/6 muizen gebruikt om te onderzoeken of Helios of Nrp1 een betere marker is voor tTreg...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
NOD muizen			In-house fokken
HBSS	Statens veterinärmedicinska anstalt	991750
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R0883-500ML
NH4Cl	EMD Millipore	1011450500
eBioscience Foxp3 / Transcriptiefactor Staining Buffer Set	ThermoFisher	00-5523-00	Bevat Fixatie/Permeabilisatie Concentraat, Fixatie/Permeabilisatie Verdunning en Permeabilisatie Buffer (10x)
eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer	ThermoFisher	00-4222-26
CD4 Monoklonaal Antilichaam (RM4-5), FITC, eBioscience	ThermoFisher	11-0042-85
CD25 Monoklonaal Antilichaam (PC61.5), PE, eBioscience	ThermoFisher	12-0251-83
BD Pharmingen APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a	BD Biosciences	560182
Muis Neuropilin-1 APC-geconjugeerd Antilichaam	R&D Systems	FAB5994A
FOXP3 Monoklonaal Antilichaam (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience	ThermoFisher	25-5773-82
Pacific Blue anti-muis/mens Helios Antilichaam	BioLegend	137220
Falcon 5 mL Ronde Bodem Polystyreen Testbuis, met Celfilter Snap Cap	CORNING	352235	Een 35 µm nylon gaas is opgenomen in de dubbel-positie snap cap
Buis 15 mL, 120 mm x17 mm, PP	Sarstedt	62.554.002
Micro buis 1,5 mL	Sarstedt	72.690.001
Weggeef scintillatie flacons	WHEATON
Flow cytometry	BD
Flow cytometry analyse software	Inivai Technologies	Flowlogic