Methodenartikel

Nieuwe reeks ontdekking door subtractieve Genomics

DOI:

10.3791/58877

⸱

25 januari 2019

 ,  , 
1Biology Department, American University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van dit protocol is met een combinatie van rekenkundige en onderzoek van de Bank te vinden van nieuwe sequenties die niet gemakkelijk kunnen worden gescheiden van een mede zuiverende sequentie, die slechts gedeeltelijk bekend kan zijn.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Subtractieve genomics kan worden gebruikt in elk onderzoek waar het doel is om het identificeren van de sequentie van een gen, eiwit of algemene regio die is ingesloten in een bredere context van de genomic. Subtractieve genomics laat een onderzoeker een opeenvolging van de doelgroep van belang (T) isoleren door uitgebreide sequentie en af te trekken uit de bekende genetische elementen (referentie, R). De methode kan worden gebruikt voor het identificeren van nieuwe reeksen zoals mitochondriën, chloroplasten, virussen, of germline chromosomen beperkt, en is vooral handig als T niet kan worden eenvoudig geïsoleerd van R. beginnen met de uitgebreide genomic gegevens (R + T), de methode maakt gebruik van elementaire lokale Alignment Search Tool (BLAST) tegen een referentie-reeks, of sequenties, verwijderen van de overeenkomende bekende opeenvolgingen (R), weggaand achter het doel (T). Voor aftrekken te werken het beste, moet R een relatief volledige ontwerp dat T. ontbreekt Sinds sequenties overblijft nadat aftrekken worden getest door middel van kwantitatieve Polymerase Chain Reaction (qPCR), hoeft R niet te worden voltooid voor de methode om te werken. Hier koppelen we computationele stappen met experimentele stappen in een cyclus die herhaald kan worden, zo nodig, opeenvolgend verwijderen van meerdere referentie sequenties en verfijnen van het zoeken naar T. Het voordeel van subtractieve genomics is dat een volledig nieuwe target-reeks zelfs in gevallen waarin fysieke zuivering moeilijk, niet onmogelijk, of duur is kan worden geïdentificeerd. Een nadeel van de methode is het vinden van een geschikte referentiemiddelen voor aftrekken en het verkrijgen van T-positieve en negatieve monsters voor het testen van qPCR. Wij beschrijven onze implementatie van de methode in de identificatie van het eerste gen van het chromosoom germline-beperkte van Zebravink. In dat geval drie verwijzingen (R), opeenvolgend verwijderd gedurende drie cycli computationele filteren betrokken: een onvolledige genomic vergadering, ruwe genomische data en transcriptomic gegevens.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van deze methode is om te identificeren een nieuwe doelstelling (T) genomic opeenvolging, hetzij DNA hetzij RNA, uit een genomic context of een verwijzing (R) (Figuur 1). De methode is vooral handig als het doel niet fysiek worden gescheiden, of het zou duur om dit te doen. Alleen een paar organismen hebben genomen voor aftrekken, perfect afgewerkt dus een belangrijke innovatie van onze methode is de combinatie van computationele en methoden van de Bank in een cyclus waardoor onderzoekers te isoleren doel sequenties wanneer de verwijzing onvolmaakt is, of een ontwerp genoom van een organisme niet-model. Aan het einde van een cycl....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. DOVO monteren beginnen volgorde

Opmerking: Alle gegevens van Next-Generation reeks (NGS) kan worden gebruikt, zolang een vergadering kan worden geproduceerd uit die gegevens. Geschikte invoergegevens omvat Illumina, PacBio, of Oxford Nanopore geassembleerd in een fasta bestand leest. Voor concreet, hier beschreven een vergadering Illumina gebaseerde transcriptomic specifiek voor de Zebravink studie uitgevoerd we7; maar let erop dat de specifieke kenmerken per project variëren. Voor ons voorbeeld project, onbewerkte gegevens zijn afgeleid uit een MiSeq en ongeveer 10 miljoen gepaarde leest zijn verkregen van....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na het uitvoeren van BLAST, zal de output bestand hebben een lijst van sequenties van de query die overeenkomen met de database. Na Python aftrekken, zal een aantal nonmatching sequenties worden verkregen en getest door qPCR. De resultaten van dit en de volgende stappen worden hieronder besproken.

Negatieve resultaat. Er zijn twee mogelijke negatieve resultaten die kunnen worden gezien na de explosie in de reeks.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Subtractieve genomics is krachtig, maar het is niet een cookie-cutter aanpak, waarbij aanpassingen op verschillende belangrijke stappen, en zorgvuldige selectie van referentie sequenties en proefmonsters. Als de query-vergadering van slechte kwaliteit is, misschien filteren stappen alleen isoleren vergadering artefacten. Daarom is het belangrijk om grondig valideren de DOVO vergadering met behulp van een geschikte validatie-protocol aan het specifieke project. Voor RNA-seq, worden richtsnoeren verstrekt op de we.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs erkennen Michelle Biederman, Alyssa Pedersen en Colin J. Saldanha voor hun hulp bij de Zebravink genomics project in verschillende stadia. We erkennen ook Evgeny Bisk voor het berekenen van cluster Systeembeheer en NIH grant 1K22CA184297 (voor J.R.B.) en NIH NS 042767 (voor C.J.S).

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Accustart II Taq DNA PolymeraseQuanta Bio95141
Blasic Local Alignment Search Tool (BLAST)https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki/Transcriptome-Assembly-Quality-Assessment
Bowtie 2https://www.python.org/download/releases/2.7/
BWA-MEM v. 0.7.12https://github.com/BenLangmead/bowtie2
Geneioushttps://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
PEAR v. 0.9.6http://www.mybiosoftware.com/reptile-1-1-short-read-error-correction.html
Personal ComputerBiomattershttp://www.geneious.com/
PowerSYBR qPCR mixThermoFisher4367659
Python v. 2.7https://sco.h-its.org/exelixis/web/software/pear/
Reptile v.1.1https://alurulab.cc.gatech.edu/reptile
Stratagene Mx3005PAgilent Technologies401456
TransDecoder v. 3.0.1https://sourceforge.net/projects/bio-bwa/files/
Trinity v. 2.4.0https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/wiki

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barh, D., et al. A Novel Comparative Genomics Analysis for Common Drug and Vaccine Targets in Corynebacterium pseudotuberculosis and other CMN Group of Human Pathogens. Chemical Biology & Drug Design. 78 (1), 73-84 (2011).
  2. Sarangi, A. N., Aggarwal, R., Rahman, Q., Trivedi, N.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Kiemlijnbeperkt chromosoomBLAST analyseqPCR validatieTrinity assemblageprimerontwerpzebravinksomatische genidentificatiecomputationele filteringreferentiesubtractie

Gerelateerde artikelen