Meting van in vitro cholesterol efflux capaciteit serum of plasma in macrofaag cel modellen is een veelbelovend instrument als een biomarker voor atherosclerose. In de huidige studie, optimaliseren wij en een fluorescerende NBD-cholesterol efflux methode standaardiseren en ontwikkelen van een hoge-doorvoer-analyse met behulp van 96-wells-platen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
High-throughput Nitrobenzoxadiazole-geëtiketteerden Cholesterol Efflux Assay
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Arteriosclerose leidt tot hart-en vaatziekten (HVZ). Het is nog onduidelijk of de concentratie cholesterol-HDL (cHDL) een oorzakelijke rol speelt in de ontwikkeling van atherosclerose. Echter, een belangrijke factor in de vroege stadia van de atheroma plaque vorming is cholesterol efflux capaciteit aan HDL (de mogelijkheid van HDL-deeltjes te accepteren van cholesterol van macrofagen) om te voorkomen dat schuim celvorming. Dit is een belangrijke stap bij het vermijden van de ophoping van cholesterol in het endotheel en een deel van reverse cholesteroltransport (RCT) om te heffen van cholesterol door de lever. Cholesterol efflux capaciteit serum of plasma in macrofaag cel modellen is een veelbelovend instrument dat kan worden gebruikt als biomerker voor atherosclerose. Traditioneel, [3H]-cholesterol is gebruikt in cholesterol efflux testen. In deze studie streven wij naar het ontwikkelen van een strategie van het veiliger en sneller met behulp van fluorescerende geëtiketteerd-cholesterol (NBD-cholesterol) in een cellulaire assay voor het traceren van het cholesterol opname efflux proces en in macrofagen THP-1-afgeleide. Tot slot, wij optimaliseren en standaardiseren van de NBD-cholesterol efflux methode en ontwikkelen van een high-throughput-analyse met behulp van 96-wells-platen.
Inleiding
Volgens de World Health Organization zijn de huidige belangrijkste doodsoorzaken wereldwijd ischemische hartziekte en beroerte (accounting voor een totaal van 15,2 miljoen doden)1. Beide zijn cardiovasculaire aandoeningen (CVD) die kunnen worden voorafgegaan door atherosclerose en de breuk van atheroma plaques in de bloedvaten2,3.
Atherosclerose is een vaartuig muur ontstekingsziekte waarin macrofagen, T-cellen, mestcellen en dendritische cellen infiltreren het endotheel en uit het bloed, uiteindelijk de vorming van atherosclerotische plaques ophopen. Atherosclerotische plaques presenteren een lipide kern en cholesterol kristallen, blijkt uit de hoge resolutie B-modus Ultrasonografie metingen van de carotis intima media dikte4,5. In macrofagen, wordt cholesterol efflux naar lipide acceptor deeltjes uitgevoerd door middel van de ATP-binding cassette (ABC) receptoren ABCA1, ATP-binding cassette onderfamilie G lid 1 (ABCG1), en de scavenger receptor SR-BI. Het gebrek aan evenwicht van cholesterol toestroom en efflux in macrofagen wordt beschouwd als een belangrijke proces in atherosclerose Inleiding6. Cholesterol efflux wordt beschouwd als een belangrijke stap in de eliminatie van cholesterol uit perifere weefsel aan het plasma en de lever in een proces genaamd reverse cholesteroltransport (RCT). Cholesterol wordt overgebracht van macrofagen voornamelijk aan apolipoproteïne A1 (ApoA1) gevonden op het oppervlak van high-density lipoproteïne (HDL) deeltjes. HDLs vervoer dan cholesterol naar de lever voor uitscheiding en hergebruikt7,8,9.
Tritium (3H) radioactief gemerkte cholesterol is traditioneel gebruikt in cholesterol efflux10. Het signaal van de emissie van radio-isotopen is zeer gevoelige10; radioactief gemerkte cholesterol kampt echter voor de hand liggende handicaps zoals lange protocollen, risico van blootstelling aan ioniserende straling en de noodzaak van speciale radioactiviteit faciliteiten en apparatuur om ervoor te zorgen veilig omgaan met radioactieve emissies. Integendeel, is fluorescentie met succes overgenomen in diagnostische technieken vanwege zijn eenvoud in fluorescerende signaal detectie, de grote verscheidenheid van fluorophores beschikbaar en zijn veiligheid11. Verschillende TL-gelabelde Sterolen zijn gebruikt voor het bestuderen van cholesterol metabolisme met inbegrip van dehydroergosterol (met intrinsieke fluorescentie), dansyl cholesterol, 4,4-difluoro-3a, 4adiaza-s-indacene (BODIPY) - cholesterol, en 22-(N-(7- Nitrobenz-2-oxa-1,3-Diazol-4-yl)amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-ol (NBD-cholesterol). NBD-cholesterol presenteert in het bijzonder een efficiënte opname in menselijke cellen12. Twee verschillende NBD geëtiketteerd-cholesterol zijn momenteel beschikbaar: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) en 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-NBD; Figuur 1). Cholesterol geëtiketteerd met 22-NBD deel kan best past bij cholesterol efflux studies, terwijl 25-NBD-cholesterol voornamelijk in cellulaire membraan dynamics onderzoek13,14 gebruikt wordt.
Cellijnen meestal gebruikt in in vitro cholesterol efflux testen zijn monocyt-achtige cellen zoals THP-1 voor menselijke leukemie-afgeleide cellen, lymfkliertest Raw 264.7 cellen15of J774.1. Al deze cellen kunnen worden onderscheiden in macrofagen in vitro met behulp van phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA), maar THP-1-afgeleide macrofagen (dmTHP-1) beste weerspiegelen en de menselijke macrofagen16na te bootsen.
In de huidige studie, we optimaliseren en standaardiseren van een fluorescerende high-throughput methode om te bepalen de cholesterol efflux capaciteit van serummonsters op dmTHP-1, met behulp van 22-NBD-cholesterol als alternatief voor [3H]-cholesterol. Daarnaast vergelijken wij de geoptimaliseerde fluorescerende techniek met de standaard radioactieve analoge.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Voor deze studie werd werden ethisch comité goedkeuring (Comitè Ètic d'Investigació Clínica; Hospital Clinic, Barcelona; goedkeuringsnummer HCB/2014/0756) en schriftelijke, geïnformeerde toestemming van alle onderwerpen verkregen.
1. NBD-cholesterol voorbereiding
- Los van de NBD-cholesterol (MW 494.63; Zie Tabel van materialen) in pure ethanol om te verkrijgen van de voorraad (2 mM). Voor een flacon van 10 mg, Los de inhoud van het hele flesje in een volume van 10,1 mL ethanol te verkrijgen van een voorraad van 2 mM.
- Verdun de NBD-cholesterol uit de voorraad in RPMI 1640 aangevuld met 10% foetale boviene serum en 5% penicilline/streptomycine (R10 medium) tot een uiteindelijke concentratie van 5 μM (b.v., 10 mL van NBD-cholesterol bij 5 μM eindconcentratie verkrijgen) door verdunning 25 μL van NBD-cholesterol voorraad (2 mM) in R10 medium. Dit volume is voldoende voor een 96-wells-plaat.
2. cel cultuur en zaaien (dag-2)
- Cultuur THP-1 cellen in R10 medium bij 37 ° C, 5% CO2. Aanpassen naar 0.3 x 106 cellen/mL elke 3 dagen.
- Zaad de cellen in een witte 96-wells-plaat met een platte, heldere bodem op 0,2 x 106 cellen per putje in R10 medium (100 μl per putje).
- Behandelen van de cellen met 100 nM phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA; uit een voorraad van 10 μM) gedurende 48-72 uur, incuberen bij 37 ° C, 5% CO2 om te differentiëren THP-1 cellen in dmTHP-1.
Opmerking: Het is aanbevolen om gebruik 5 μL van PMA voorraad (10 μM) in 500 μL van R10 medium. Voorafgaand aan deze, bereiden een 10 μM PMA voorraad door ontbinding van een flesje gelyofiliseerd 1 g in 10 mL dimethylsulfoxide (DMSO), hoeveelheid en voorraad bij-20 ° C. - U kunt ook (suggestie) combineren stappen 2.2 en 2.3 voor betere homogenisering. Bereiden van 10 mL THP-1 cellen in een tube van 15 mL, voeg 200 l PMA voorraad (10 μM), meng zachtjes en onmiddellijk zaad 100 μl per putje op het bord. Incubeer de cellen zoals beschreven in stap 2.3.
3. apolipoproteïne B uitgeput Serum (ABDS) voorbereiding (dag 2 of 3)
- Ter voorbereiding van een oplossing van polyethyleenglycol (PEG), Verdun glycine in 10% PBS (met steriele H2O) een concentratie van 200 mM met een pH van 7,4. Voeg 40 mL 200 mM glycine à 10 g van PEG 8000 verkrijgen van PEG 20% (m/v). Meng de oplossing krachtig te homogeniseren.
- Toepassing 4 delen van 20% per 10 delen van serum/plasma op elk serum/plasma monster in de buis van een 1,5 mL PEG en laat het mengsel op het ijs voor 25 min17 (bijvoorbeeld 100 μl van plasma of serum, voeg 40 μL van 20% PEG oplossing).
- Centrifugeer het PEG-apolipoproteïne B neerslag bij 13.000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C.
- Gooi de neerslag. Het supernatant overbrengen in een nieuwe buis.
Opmerking: Het is raadzaam om de voorbereiding van de ABDS op dag 3 (verse). Als het niet mogelijk is, bereiden de ABDS op dag 2 en houden het bij 4 ° C's nachts.
4. NBD-cholesterol cel laden (dag 2)
- Negeren van de voedingsbodem van de dmTHP-1 en wassen van de cellen tweemaal met 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Laden van de cellen met 5 μM NBD-cholesterol (100 μl per putje) in R10 medium en na een nacht bebroeden bij 37 ° C, 5% CO2.
5. incubatie met Cholesterol acceptanten (dag 3)
- Negeren van het medium en wassen van de cellen tweemaal met PBS.
- Incubeer de cellen met 2-5% ABDS of de gewenste concentratie van gezuiverde lipide acceptor (HDL, ApoA, ApoE, etc.) verdund in kleurloze RPMI 1640 medium (100 μl per putje) gedurende 4-6 uur bij 37 ° C.
Opmerking: Omvatten een negatieve controle (C-) bestaande uit kleurloze RPMI 1640 medium zonder Acceptanten en een positieve controle (C +) (bijvoorbeeld ABDS uit een pool van gezonde donoren) of gezuiverd HDLs. Opmerking dat de positieve controle geldt met name wanneer de patiënt monsters (ziekten) zijn geanalyseerd (aanvullende figuur 1). - Voorbereiden van een voorraad van 200 mL van de oplossing lysis van de cel 1 (50 mM Tris buffer, 150 mM NaCl, H2O). Meng de cellysis oplossing 1 op 1:1 (v: v) verhouding met pure ethanol te verkrijgen van de lysis oplossing 2.
6. fluorescent signaal vangen (dag 3)
-
Media NBD-cholesterol detectie
- Verwijder het medium van de cel aan de platen en verzamelen in een nieuwe witte 96-wells-plaat met een ondoorzichtige platte bodem.
- Voor een optimale fluorescentie signaal detectie in de media-monsters, voeg toe 100 μl van pure ethanol aan 100 μl van elk medium monster te verkrijgen van een 1:1 verhouding in de witte 96-wells-plaat.
- De plaat met de behandelde media houden voor verdere maatregel, wordt de intensiteit van de fluorescentie (FI) bij een golflengte van 463⁄536 nm (excitatie/emissie) in de luminometer.
-
Detectie van intracellulaire NBD-cholesterol
- Wassen van de cellen tweemaal met PBS.
- Voor het verkrijgen van de intracellulaire cholesterol, lyse de cellen door ze aan het broeden met 100 μl van lysis oplossing 2 per putje en schud de plaat bij kamertemperatuur (RT) gedurende 25 minuten.
- Voor een optimale fluorescentie signaal detectie in de lysate celsteekproeven, vangen de intensiteit van de fluorescentie van de cel lysates in dezelfde witte 96-wells-plaat met duidelijk plat bodemplaat (de dezelfde waarin cellen werden zaadjes in stap 2.2).
- 6.3 meet de intensiteit van de fluorescentie (FI) in de luminometer terwijl het aanpassen van de parameter van de gevoeligheid tot 50 in de software (Zie Tabel van materialen).
7. resultaten analyse
- Het cholesterol efflux tarief van een monster wordt uitgedrukt als een percentage berekend met de formule:
- De definitieve maatregel van cholesterol efflux (CE) verkrijgen door de CE van de negatieve controle (voorbeeld vol met NBD-cholesterol maar geïncubeerd met kleurloze RPMI 1640 medium, zonder cholesterol acceptanten) af te trekken van de CE van een gegeven monsters:
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het doel van de bepaling van de efflux cholesterol is om in vitro de cholesterol efflux capaciteit van een bepaalde serum, plasma of supernatant met HDL-deeltjes. De methode bestaat uit geëtiketteerd-cholesterol in een cultuur van een standaard macrofaag cellijn laden en inducerende contact met het testen monster in FBS-vrije media met de cellen worden verdund. Tot slot worden de fluorescerende niveaus van de NBD gemeten in de media en de cel lysate. Voor het optimaliseren van metingen, wordt de effluxed cholesterol uit ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
TL-gelabelde cholesterol is een veelbelovende strategie om te analyseren en onderzoeken van de eigenschappen en het metabolisme van natuurlijke cholesterol in vitro. De belangrijkste voordelen zijn dat het kan worden overgenomen door cellen, toelaat voor intracellulaire en membraan distributie studies, en kan worden toegepast op cholesterol efflux assays zoals in dit protocol (Figuur 7). Aantal TL-gelabelde sterolen toestaan cholesterol bijhouden in vitro met inbegrip van BODIPY-cholesterol,...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs willen verklaren dat ze de uitvinders van de octrooiaanvraag (EOB; 18382337.6-1118; 17 mei 2018) getiteld "Method for determining cholesterol efflux" op basis van deze methode.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het onderzoek verleent FIS (PS12/00866) van het Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spanje; Fondo Europeo para el Desarrollo regionale (EFRO); Red de Investigación en SIDA (RIS), ISCIII-RETIC (RD16/0025/0002) en CERCA programma / Generalitat de Catalunya. De auteurs bedanken de Retrovirology en virale Immunopathologie laboratorium van het Institut d'Investigacions Biomèdiques augustus Pi I Sunyer (IDIBAPS). Wij danken T. Escribà, C. Rovira en C. Hurtado voor hun hulp en S. Cufí van de kennis en de technologie Transfer Office voor haar begeleiding bij de bescherming van de uitvinding.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 96-well verzamelplaat | Corning Inc | Costar 3912 | witte 96-well plaat met ondoorzichtige heldere bodem |
| 96-well kweekplaat | Corning Inc | Costar 3610 | witte 96-well plaat met platte heldere bodem |
| Cholesterol Efflux Assay Kit (Cell-based) | Abcam | ab196985 | commerciële hoogdoorvoerige op cellen gebaseerde testkit gericht op het bepalen van de cholesterol efflux |
| kleurloze RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R7509 | RPMI 1640 zonder pehnol-rood |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Versie 2.0 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790-100G | Glycine, niet voor dierlijk gebruik |
| Luminometer | Biotek | SYNERGY HT | Multi-Detectie Microplaat Reader |
| Lysis Oplossing 1 | in-house | 50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl en H2O | |
| Lysis Oplossing 2 | in-house | Pure ethanol en Cell Lysis Oplossing 1:1 (v:v) | |
| NBD-cholesterol | Thermo-Fisher | N1148 | 22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Fosfaat-gebufferde zoutoplossing |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 202452-250G | polyethyleenglycol |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | Phorbol 12-merystaat B-acetaat. |
| R10 | in-house | RPMI 1640 aangevuld met 10% foetaal bovien serum en 5% Penicilline/Streptomycine. | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | RPMI 1640 met 2 mM L-glutamine bevattend 1,5 g/L natriumbicarbonaat en 4,5 g/L glucose |
| THP-1 cellen | Sigma-Aldrich | ATCC, #TIB-202 | monocyte-achtige lijn afgeleid van leukemie van een baby van één jaar oud |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 |
Referenties
- The top 10 causes of death. , Available from: http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death (2018).
- Hansson, G. K., Hermansson, A. The immune system in atherosclerosis. Nature Immunology. 12 (3), 204-212 (2011).
- Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature. 473 (7347), 317-325 (2011).
- Ilhan, F. Atherosclerosis and the role of immune cells. World Journal of Clinical Cases. 3 (4), 345(2015).
- Greaves, D. R., Gordon, S. Immunity, atherosclerosis and cardiovascular disease. Trends Immunol. 22, (2001).
- Yamamoto, S., Narita, I., Kotani, K. The macrophage and its related cholesterol efflux as a HDL function index in atherosclerosis. Clinica Chimica Acta. 457, 117-122 (2016).
- Escolà-Gil, J. C., Rotllan, N., Julve, J., Blanco-Vaca, F. In vivo macrophage-specific RCT and antioxidant and antiinflammatory HDL activity measurements: New tools for predicting HDL atheroprotection. Atherosclerosis. 206 (2), 321-327 (2009).
- Santos-Gallego, C. G., Ibanez, B., Badimon, J. J. HDL-cholesterol: Is it really good? Differences between apoA-I and HDL. Biochemical Pharmacology. 76 (4), 443-452 (2008).
- Rothblat, G. H., Phillips, M. C. High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport. Current Opinion in Lipidology. 21 (3), 229-238 (2010).
- Hafiane, A., Genest, J. HDL-mediated cellular cholesterol efflux assay method. Annals of Clinical and Laboratory Science. 45 (6), 659-668 (2015).
- Szalaia, R., Hadzsiev, K., Melegh, B. Cytochrome P450 Drug Metabolizing Enzymes in Roma Population Samples: Systematic Review of the Literature. Current Medicinal Chemistry. 23, 1-26 (2016).
- Mcintosh, A. L., et al. Fluorescent Sterols for the Study of Cholesterol Trafficking in Living Cells. Probes and Tags to Study Biomolecular Function: for Proteins, RNA, and Membranes. , 1-33 (2008).
- Ostašov, P., et al. FLIM studies of 22- and 25-NBD-cholesterol in living HEK293 cells: Plasma membrane change induced by cholesterol depletion. Chemistry and Physics of Lipids. 167, 62-69 (2013).
- Song, W., et al. Characterization of fluorescent NBD-cholesterol efflux in THP-1-derived macrophages. Molecular Medicine Reports. 12 (4), 5989-5996 (2015).
- Liu, N., Wu, C., Sun, L., Zheng, J., Guo, P. Sesamin enhances cholesterol efflux in RAW264.7 macrophages. Molecules. 19 (6), 7516-7527 (2014).
- Qin, Z. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature. Atherosclerosis. 221 (1), 2-11 (2012).
- Low, H., Hoang, A., Sviridov, D. Cholesterol Efflux Assay. Journal of Visualized Experiments. (61), 5-9 (2012).
- Gimpl, G., Gehrig-Burger, K. Cholesterol reporter molecules. Bioscience Reports. 27 (6), 335-358 (2007).
- Zhang, J., Cai, S., Peterson, B. R., Kris-Etherton, P. M., Heuvel, J. P. Vanden Development of a Cell-Based, High-Throughput Screening Assay for Cholesterol Efflux Using a Fluorescent Mimic of Cholesterol. ASSAY and Drug Development Technologies. 9 (2), 136-146 (2011).
- Rader, D. D. J. Molecular regulation of HDL metabolism and function: implications for novel therapies. Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3090-3100 (2006).
- Davidson, W. S., et al. The effects of apolipoprotein B depletion on HDL subspecies composition and function. Journal of Lipid Research. 57 (4), 674-686 (2016).
- Park, S. H., et al. Sage weed (Salvia plebeia) extract antagonizes foam cell formation and promotes cholesterol efflux in murine macrophages. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1105-1112 (2012).
- Litvinov, Y., Savushkin, E. V., Garaeva, E. A. D. A. Cholesterol Efflux and Reverse Cholesterol Transport: Experimental Approaches. Current Medicinal Chemistry. 371 (25), 2383-2393 (2016).
- Phillips, A., Mucksavage, M. L., Wilensky, R. L., Mohler, E. R. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364 (2), 127-135 (2011).
- Rohatgi, A., et al. HDL Cholesterol Efflux Capacity and Incident Cardiovascular Events. New England Journal of Medicine. 371 (25), 2383-2393 (2014).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
