Isolatie, zuivering en differentiatie van osteoclast precursoren van het Rat beenmerg

Samenvatting

Osteoclasten zijn weefsel-specifieke macrofagen polykaryons afgeleid van de monocyten-macrofagen afstamming van hematopoietische stamcellen. In dit protocol wordt beschreven hoe u beenmergcellen isoleren zodat grote hoeveelheden osteoclasten worden verkregen terwijl het risico op ongevallen in traditionele methoden wordt verminderd.

Samenvatting

Osteoclasten zijn grote, multinucleaire, en resorbing cellen van de monocyten-macrofagen lijn die gevormd worden door de fusie van monocyten of macrofagen precursoren. Overmatige been resorptie is een van de meest significante cellulaire mechanismen die leiden tot osteolytic ziekten, waaronder osteoporose, parodontitis, en periprosthetic osteolyse. De belangrijkste fysiologische functie van osteoclasten is het absorberen van zowel de hydroxyapatiet minerale component en de organische matrix van het bot, het genereren van de karakteristieke resorptie verschijning op het oppervlak van de botten. Er zijn betrekkelijk weinig osteoclasten in vergelijking met andere cellen in het lichaam, vooral in volwassen botten. Recente studies hebben zich gericht op hoe meer volwassen osteoclasten te verkrijgen in minder tijd, die altijd al een probleem. Verschillende verbeteringen in de isolatie en cultuurtechnieken hebben ontwikkeld in laboratoria om meer volwassen osteoclasten te verkrijgen. Hier introduceren we een methode die het beenmerg isoleert in minder tijd en met minder inspanning in vergelijking met de traditionele procedure, met behulp van een speciaal en eenvoudig apparaat. Met het gebruik van dichtheidsgradiënt centrifugeren, krijgen we grote hoeveelheden van volledig gedifferentieerde osteoclasten van Rat beenmerg, die worden geïdentificeerd door klassieke methoden.

Inleiding

De homeostase van het been is een complex fysiologisch proces dat door been-resorbing osteoclasten en been-vormt osteoblasten¹wordt geregeld. Een evenwicht tussen osteoblastic en osteoclastic activiteit bemiddeld door osteoblasten en osteoclasten, respectievelijk, is zeer essentieel voor het behoud van gezondheid van de botten en homeostase, omdat verstoringen in het bot homeostase zou kunnen leiden tot bot ziekten, zoals Als abnormale beengroei of verlies van botdichtheid. Als unieke Bone-resorptie cellen, osteoclasten zijn belangrijk in ziekten in verband met abnormale bot vernietiging, met inbegrip van osteoporose, parodontitis, en periprosthetic osteolyse^2,3.

De ontwikkeling van een osteoclast cultuur is hoofdzakelijk verdeeld in twee stadia. De methoden opgericht door Boyde et al.⁴ en Chambers et al.⁵ componeerde de eerste fase in de jaren 1980. Zij verkregen vrij overvloedige osteoclasten van de beenderen van pasgeboren dieren, die de snelle het remodelleren periode is. Osteoclasten worden vrijgegeven door het versplinteren en roeren de botten in een speciaal medium. Echter, de cellen verkregen door deze methode zijn laag in hoeveelheid en zuiverheid. De tweede fase was de ontwikkeling van lange-afstands culturen van osteoclast vorming, met behulp van hematopoietische Lineage cellen afgeleid van beenmerg⁶. Cytokines, zoals 1α, 25-dihydroxyvitamine D3, prostaglandine E2 (PGE-2), en bijschildklier hormoon (pth), die worden toegevoegd in de cultuurmedium, handelen via het systeem van osteoblasten/stromale cellen te stimuleren osteoclast vorming^7,8 . Echter, de zuiverheid en kwantiteit van osteoclasten verkregen door deze methode niet kan voldoen aan de behoeften van de moderne moleculaire biologie onderzoek. Dan is de ontdekking van de macrofagen Colony-stimulerende factor (M-CSF) en receptor Activator voor nucleaire factor-κB ligand (Rank) maken osteoclastogenesis makkelijker^9,10,11, en de methode van het gebruik van M-CSF en RANKe om direct te stimuleren osteoclast vorming wordt veel gebruikt over de hele wereld. Er zijn echter nog enkele details in de methodologie die moeten worden verbeterd.

Momenteel is de meest gebruikte osteoclast cultuurmethode, zoals beschreven door Marino et al.¹² en Pei et al.¹³, vereist vaak de verwijdering van het omliggende weefsel rond het bot en maakt gebruik van een gesteriliseerde naald om de mergholte spoelen met voltooide media. Er zijn een aantal nadelen aan dit proces, met inbegrip van het feit dat (1) de verwijdering van het omliggende weefsel rond het bot vergt veel tijd en grote chirurgische techniek, (2) de botten zijn kwetsbaar en kan leiden tot beenmerg uitstroom, (3) het beenmerg Holte zou kunnen worden te klein om te spoelen, en (4) is er een risico van naald stok letsel. Om deze problemen te voorkomen, centrifugeren we de buizen met de botten voor het beenmerg in plaats van naald-blozen het beenmerg. Hier introduceren we een stabiele en veilige methode die het beenmerg isoleert in minder tijd en met minder inspanning in vergelijking met de traditionele procedure. Samen met het gebruik van dichtheidsgradiënt centrifugeren, krijgen we grote hoeveelheden van volledig gedifferentieerde osteoclasten in vitro.

Protocol

Alle methoden met betrekking tot de dieren hier beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Dierenzorg en het gebruik Comite (DEC) van de Nanjing universiteit van de Chinese geneeskunde.

1. Setup

1. Maak een aantal in de lengte gesneden 1 mL pipet tips (1 cm) en enkele 1,5 mL microcentrifuge tubes. Zet de pipet tips en de microcentrifuge tubes bij 103 kPa en 121 °C gedurende 20 min en zorg ervoor dat ze steriel zijn.
2. Bereid een doos ijs en een aantal steriele gerechten om de geïsoleerde weefsels te behouden tijdens de isolatie procedure.

2. voorbereiding van cultuur medium

1. Bereid het complete kweekmedium voor. Gebruik minimale essentiële medium Alfa (α-MEM) dat een definitieve oplossing van 1% van penicilline/streptomycine en 10% foetale boviene serum (FBS) bevat.
2. Filter de media vanaf stap 2,1 met een filter van 0,22 μm.
3. Bereid het beenmerg inductie medium. Voeg voor 50 mL van de oplossing 125 µ L van M-CSF toe aan een concentratie van 10.000 ng/mL (tabel met materialen) tot 49,875 ml volledig kweekmedium (vanaf stap 2,2) om een definitieve oplossing te maken van 25 ng/ml M-CSF.
4. Bereid het osteoclast inductie medium voor. Voor 50 mL van de oplossing, voeg 500 µ L van RANK bij een concentratie van 10.000 ng/mL (tabel van materialen) tot 49,5 ml van het beenmerg inductie medium (vanaf stap 2,3) tot een definitieve oplossing van 25 ng/ml M-CSF en 100 ng/ml ranke te maken.

3. isolatie van Bone mMarrow-afgeleide cellen

1. Euthanasie
   1. Euthanaseren vier Sprague Delombaerde ratten door CO₂ inhalatie gevolgd door cervicale dislocatie, en dompel ze in 75% ethanol voor 1 min.
      Opmerking: Ervoor te zorgen dat dieren van hetzelfde geslacht zijn en van een vergelijkbare leeftijd. Dieren die 2 tot 3 weken oud zijn, worden aanbevolen. Twee ratten zijn voorbereid op de centrifugale methode, terwijl de andere twee zijn voor de traditionele methode.
2. Traditionele methode
   1. Plaats de dieren op een ontsmettings plaat in een liggende positie. Maak een kleine incisie (ongeveer 1 cm) op de proximale femur om de huid te schillen, met behulp van steriele schaar.
   2. Ontleden uit de femur en Tibia. Snijd de bilaterale verbindingsstukken rond de heup, knie en enkelgewrichten te isoleren van de tibia en femur voorzichtig en voorzichtig. Snijd een deel van de weefsels rond het bot; Wees grondig. Niet breken de tibia en het dijbeen tijdens het hele proces.
   3. Plaats de gereinigde botten in een schaal met 5 mL van het volledige kweekmedium. Snijd de lange Bone met steriele schaar en gebruik een 1 mL injectienaald om de mergholte zorgvuldig te spoelen met 10 mL volledige media totdat de mergholte wit wordt.
   4. Breng de schorsing van de cel over van stap 3.2.3 naar een 50 mL-buis en filtreer vervolgens met een zeef van 70 μm om het resterende weefsel te verwijderen.
   5. Voeg 5 mL rode bloedcel lysis buffer (tabel van materialen) aan de cel schorsing. Incubeer de cellen voor 8 min op ijs. Dan, centrifugeer de cellen bij 250 x g 5 min om de cel korrel op te leveren.
   6. Aspireren uit het medium en de cellen opnieuw op te schorten in 10 mL van de volledige media. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en bereken de tijd die wordt besteed aan de stappen uit deze sectie (sectie 3,2).
3. Verbeterde methode
   1. Plaats de dieren op een ontsmettings plaat in een liggende positie. Maak een kleine incisie (ongeveer 1 cm) op de proximale femur met steriele schaar om de huid schil.
   2. Ontleden uit de femur en Tibia. Goed afgesneden het deel van de weefsels rond het bot (niet nodig om volledig te verwijderen). Niet breken de tibia en het dijbeen tijdens het hele proces.
   3. Spoel de tibia en het dijbeen met 12 mL fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en snijd ze in tweeën. Plaats de geknipt Tibia en dijbeen in een 1 mL pipet tip (vanaf stap 1,1), die vervolgens in een micro centrifugebuis wordt gezet en 3x bij 1.000 x g voor 45 s bij 4 °c wordt gecentrifugeeerd.
   4. Na centrifugeren, verwijder het pipet uiteinde dat het been bevat, en verlaat het beenmerg in de buis. Voeg 200 l van complete media toe in de micro centrifugebuis en herhaal pipetten om het merg grondig te desintegreren.
   5. Breng de schorsing van de cel over van stap 3.3.4 naar een 50 mL-buis en filtreer vervolgens met een zeef van 70 μm om het resterende weefsel te verwijderen.
   6. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer, en bereken de tijd besteed aan de stappen uit deze sectie (sectie 3,3).

4. reiniging door dichtheidsgradiënt Centrifugeer

1. Stel de schorsing van de cel van stap 3.2.6 of stap 3.3.5 tot 2 mL met α-MEM.
2. Bereid een steriele silicified centrifugaal buis en voeg 8 mL van de cel scheiding oplossing (tabel van materialen) aan de buis.
3. Voeg de cel schorsing van stap 4,1 om de cel scheiding oplossing. Hecht de pipet aan de binnenkant van de buis en houd een 45 ° aan het binnenste oppervlak. Na het toevoegen van de opschorting, zal een duidelijke grens tussen de laag van de cellen en de scheidings oplossing verschijnen.
   Opmerking: De operatie vergt veel zorg en moet langzaam worden uitgevoerd.
4. Centrifugeer de gelaagde oplossing in een horizontale centrifuge bij 500 x g voor 30 min. Na centrifugeren, aspireren uit de bewolkte tweede laag, die de doelcellen bevat, van boven naar beneden.
   Opmerking: De acceleratie en vertraging van de centrifuge voor centrifugeren annuleren. Er zijn zes lagen na centrifugeren; de eerste laag is het verdunningsmiddel laag, de tweede laag is de monocyten laag, de derde laag is de laag van mononucleaire cellen, de vierde laag is de transparante scheiding vloeistof een laag, de vijfde is de granulaire cel laag, en de zesde laag is de rode cel Laag.
5. Breng de doelcellen over naar een nieuwe Tube. Voeg 5 mL PBS toe om de cellen 3x te wassen. Na elke wasbeurt, centrifugeer de doelcellen op 250 x g voor 5 min om de cel pellet opleveren.
6. Hersuspendeer de cel pellet met beenmerg inductie medium en Tel de cellen met behulp van een hemocytometer. Voeg 5 – 8 mL beenmerg inductie medium van stap 2,3 om een definitieve cel oplossing van 300.000 cellen/mL te verkrijgen. Voeg 1 mL toe aan elk goed van een 24-Well plaat.

5. cultuur en differentiatie

1. Na het uitbroeden van de cellen bij 37 °C voor 24 uur, voorzichtig aspireren uit het medium en voeg 1 mL van de osteoclast inductie medium aan elk goed. Schud de plaat voorzichtig en zet hem in een broedstoof bij 37 °C.
2. Verander de osteoclast inductie medium elke 48 h. Terwijl dit te doen, verandering 0,8 mL van het medium in de put en schud de plaat voorzichtig.
   Opmerking: Grote, beweeglijke, en multinucleaire osteoclasten moet worden waargenomen in de put onder een omgekeerde Microscoop, meestal rond de dagen 4 tot 6.

6. Tartrate-resistente zure fosfatase kleuring

Opmerking: Multinucleate osteoclasten zal na 4 – 6 dagen aanwezig zijn indien de inductie (sectie 5) succesvol is.

1. Bereid de fixatie oplossing voor door 4 mL 37% formaldehyde, 32,5 mL aceton en 12,5 mL van een citraat-oplossing te combineren. Bewaar de fixatie oplossing bij 4 °C.
2. Bereid de tartraat-resistente acid fosfatase (val) vlek oplossing (tabel van materialen) door toevoeging van 50 µ l van natriumnitriet, 50 µ l van snelle granaat GBC basisoplossing, 50 µ l van naftol as-bi fosfaat oplossing, 200 µ l van een acetaat oplossing, en 100 µ l van een tartraatoplossing in 4,55 mL van het geioniseerde water dat is voorverwarmd tot 37 °C. Dan, meng zachtjes door inversie voor 1 min, en laat het staan voor 2 min.
3. Na de succesvolle inductie van osteoclasten, aspireren uit het medium, en zachtjes wassen de putten 3x met PBS.
4. Breng de fixeer oplossing naar kamertemperatuur (RT). Voeg 2 mL bevestigingsoplossing toe aan de putten voor 30 s, en laat de cellen niet drogen.
5. Aspireren de fixatieve oplossing, zachtjes wassen 3x met deioniseerde water dat is voorverwarmd tot 37 ° c, en dan, aspireren het water.
6. Voeg 2 mL TRAP vlek oplossing voor 1 h bij 37 °C toe en houd het monster in het donker.
7. Na 1 h, aspireren de vlek, en zachtjes wassen het monster met deioniseerde water dat is voorverwarmd tot 37 ° c, en dan, aspireren het water.
8. Eosine de cellen 1 min in een hematoxyline oplossing. Na het kleuren, aspireren de hematoxyline oplossing en zachtjes wassen de cellen 3x met deioniseerde water.
9. Beeld osteoclasten met behulp van helderveld microscopie, en val⁺ cellen met drie of meer kernen zal verschijnen paars.

7. Bone resorptie assay met behulp van toluïdine blauwe kleuring

1. Voor behandeling van de bone slices
   1. Snijd de verse boviene femur been schors in 2 cm dikke plakjes langs de longitudinale as door microelektrisch zaag. Dan, knippen en slijpen de plakjes met harde tissue slijpmachines in 80 µm.
   2. Was de plakjes in een bekerglas met deioniseerde water en 100 Hz echografie voor 1 uur, en herhaal 3x.
   3. Dompel de plakjes in 75% alcohol voor 2 uur. Dan, aspireren uit de alcohol en bloot elke kant van de plakjes aan Ultravioletlicht voor 1 uur op een schoon platform.
   4. Voor het planten van de cellen, dompel de plakjes in de cultuurmedium voor ten minste 2 uur.
2. Toluïdine blauwe kleuring
   1. Plaats de voorbehandelde Bone slices in de 24-Well plaat. Plant de cellen zoals vermeld in stap 4,6 en induceren de cellen zoals vermeld in punt 5.
   2. Na de verschijning van osteoclasten (na 4 – 6 dagen), was de schijfjes met 1 mL van 0,25 M ammoniumhydroxide, en bewerk ze 3x voor 5 min elk om de levende cellen te verwijderen om de analyse van de resorptie kuilen op de bone slices mogelijk te maken. Verwijder vervolgens het ammoniumhydroxide en vlek de plakjes met 1 mL 1% (WT/vol) toluïdine Blue Solution per slice voor 2 min.
   3. Was de plakjes met PBS. Kies willekeurig vijf views en voer een semiquantitative analyse van het resorptie gebied uit met behulp van een beeldanalyse software.

8. Scanning elektronenmicroscopie

1. Prefix de bone slices van stap 7.2.1 met 1 mL van 2,5% glutaraldehyde per slice voor 2 h bij RT, en vervolgens, bewerk de plakjes 3x voor 3 min elk met 1 M ammoniumhydroxide om de cellen te verwijderen en het ammoniumhydroxide te verwijderen.
2. Was de bone slices 3x voor 12 min elk met PBS.
3. Bevestig de bone slices met 1% osmic zuur voor 2 h op RT.
4. Voer ethanol gradiënt uitdroging, met 50%, 70%, 80%, 90%, en 95% ethanol, voor 15 min voor elke gradiënt, en vervolgens, vervang de ethanol met isoamylacetaat voor 15 min.
5. Bedek de plakjes met goud palladium, en analyseer vervolgens door het scannen van elektronenmicroscopie.

9. immunofluorescentie kleuring van Calcitonin receptor

Opmerking: Multinucleate osteoclasten zal na 4 – 6 dagen aanwezig zijn indien de inductie succesvol is (artikel 5).

1. Aspireren uit het medium en zachtjes wassen de goed 3x met PBS.
2. Bevestig de cellen voor 10 min met 4% Paraformaldehyde, die is voorgekoeld tot 4 ° c.
3. Voeg 1 mL PBS met 0,3% niet-ionische oppervlakteactieve stof per put toe voor 30 min op ijs. Vervolgens, aspireren vandoor naar de PBS van 0,3% niet-ionische oppervlakteactieve stof en toevoegen 1 mL van PBS van 5% FBS per welput voor 30 min voort ijsje.
4. Aspireren uit de PBS en Incubeer de membranen met anti-calcitonin receptor (anti-CTR) op een 1:100 verdunning in PBS bij 4 °C 's nachts.
5. Aspireren uit de oplossing, en Incubeer de membranen met Alexa-488-geconjugeerd anti-Rabbit IgG antistoffen bij een 1:1000 verdunning in PBS voor 1 uur bij RT.
6. Aspireren uit de oplossing en zachtjes wassen de cellen 3x met PBS. Eosine de kernen met Hoechst 33342 vlek voor 3 min bij RT.
7. Aspireren uit de oplossing, en zachtjes wassen de cellen 3x met PBS. Observeer de intensiteit van de CTR door fluorescentie microscopie.

Resultaten

Het doel van het protocol was om grote aantallen osteoclast precursoren gemakkelijk te isoleren en te zuiveren en osteoclasten met succes te induceren. Door aan te vullen met M-CSF en RANK, werden Giant osteoclasten gezien op dagen 5 – 6. De vorming van osteoclasten werd met succes geïdentificeerd door TRAP kleuring (Figuur 1a). De grote en purpere cellen werden beschouwd als val-positieve cellen met veelvoudige kernen (typisch ≥ drie kernen). Door deze metho...

Discussie

De bekwaamheid om osteoclasten in vitro te verkrijgen en te bestuderen is een kritieke en fundamentele vaardigheid voor om het even welke onderzoeker die beenmetabolisme wil bestuderen, die kan helpen de mechanismen van been-absorberende ziekten begrijpen en nieuwe therapeutische agenten ontwikkelen. De huidige studie beschreef een protocol met een aantal wijzigingen op basis van eerdere methoden.

Door het gebruik van pipet tips en microcentrifuge buizen om het beenmerg te verkrijgen, verminde...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit	Sigma-Aldrich	387A
Automatische harde weefselsnijder	Lecia	RM2265
Bovine femorale bot			Aangeschaft door onszelf
Celincubator	Heraus	BB16/BB5060
Fetaal bovien serum	Sarana	s-fbs-au-015
Geit Anti-Konijn IgG H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150077
Harde weefselsslijpers	Lecia	SP-2600
Histopaque Kit	TianJing Haoyang	TBD2013DR	Verstevigde centrifugeerbuis en celscheidingsoplossing
Hochest33342	Sigma-Aldrich	B2261
Omgekeerd fasecontrastmicroscoop	Olympus	CKX31
Omgekeerd fluorescentiemicroscoop	Lecia	DMI-3000
MEM, geen Glutamine	Gibco	11090-081
Penicilline-Streptomycine, Vloeibaar	Gibco	15140122
Konijn Anti-Calcitonine receptor	Bioss	bs-0124R
Recombinant Rat M-CSF	PeproTech	400-28
Recombinant Rat sRANK Ligand	PeproTech	400-30
Rode bloedcel lysis buffer	Absin	abs47014932
Scanning Electron Microscopy	FEI	Quanta 200
Toluidine Blue	Sigma-Aldrich	89649