Methodenartikel

Enkele liposoom metingen voor de studie van Proton-pompende membraan enzymen met behulp van de elektrochemie en Fluorescent microscopie

7.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58896

⸱

21 februari 2019

 ,  , 
1School of Biomedical Sciences & the Astbury Centre for Structural Molecular Biology, University of Leeds, 2Department of Chemistry and Nano-Science Center, University of Copenhagen

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om te bestuderen van het moleculaire mechanisme van proton translocatie in verschillende lipide membranen van één liposomen, met behulp van cytochroom bo3 als voorbeeld. Het combineren van de elektrochemie en fluorescentie microscopie, pH-veranderingen in het lumen van enkele blaasjes, bevattende één of meerdere enzym, kan worden gedetecteerd en individueel geanalyseerd.

Samenvatting

Proton-pompende enzymen van elektron overbrengen ketens paar redoxreacties op proton translocatie over het membraan, het creëren van een proton-stuwende kracht gebruikt voor de productie van ATP. De aard van de amfifiele van membraaneiwitten vereist bijzondere aandacht aan hun behandeling en reconstitutie in het natuurlijke lipide-milieu is onontbeerlijk bij de studie van transportprocessen van de membraan zoals proton translocatie. Hier, detail we een methode die is gebruikt voor het onderzoek van het proton-pompende mechanisme van membraan Redoxenzymen, cytochroom bo3 van Escherichia coli als voorbeeld nemen. Een combinatie van elektrochemie en fluorescentie microscopie is gebruikt om de redox staat van de veranderingen van de Chinon zwembad en monitor de pH in het lumen. Als gevolg van de ruimtelijke resolutie van fluorescent microscopie, kunnen honderden liposomen gelijktijdig terwijl de enzym-inhoud kan worden verkleind tot een één enzym of vervoerder per liposoom worden gemeten. De analyse van de respectieve één enzym kan onthullen patronen in de enzym functionele dynamiek die anders zou kunnen worden verborgen met het gedrag van de gehele bevolking. Wij omvatten een beschrijving van een script voor automatische beeldanalyse.

Inleiding

Informatie over Enzymmechanismen en kinetiek, wordt meestal opgehaald op het niveau van het ensemble of situering met enzym bevolking in duizenden tot miljoenen van moleculen, waarbij de metingen een statistisch gemiddelde vertegenwoordigen. Het is echter bekend dat complexe macromoleculen zoals enzymen heterogeniteit in hun gedrag aantonen kunnen en moleculaire mechanismen waargenomen op het ensemble-niveau niet noodzakelijkerwijs geldig voor elke molecuul zijn. Dergelijke afwijkingen op de schaal van de individuele molecuul werden uitgebreid bevestigd door studies van enkele enzymen met een verscheidenheid van methoden die zijn ontstaan tijdens de laatste twee decennia1. Met name, is fluorescentie detectie van individuele enzymactiviteit gebruikt voor het onderzoeken van heterogeniteit van2,3 van de activiteit van de enzymen of ontdek het zogenaamde geheugeneffect (periodes van hoge enzymen activiteit opgevolgd door periodes van lage activiteit en vice versa)4,5.

Veel één enzym studies vereisen dat de enzymen worden geïmmobiliseerd op de oppervlakte of ruimtelijk vast op een andere manier te blijven lang genoeg in het gezichtsveld voor de continue waarneming. Enzym inkapseling in liposomen is aangetoond dat het enzym immobilisatie terwijl het voorkomen van eventuele negatieve gevolgen vanwege de oppervlak-enzym of eiwit-eiwit interacties6,7inschakelen. Daarnaast, bieden liposomen een unieke mogelijkheid om te studeren één membraaneiwitten in hun natuurlijke lipide dubbelgelaagde milieu8,9,10.

Een klasse van membraaneiwitten, vervoerders, oefent een directionele translocatie van stoffen tussen de celmembranen, een probleem dat alleen kan worden bestudeerd wanneer eiwitten worden aangemaakt in de lipide bilayers (b.v., liposomen)11, 12,,13. Bijvoorbeeld, speelt proton translocatie, tentoongesteld door verschillende enzymen van prokaryote en eukaryote electron vervoersketens, een belangrijke rol in de cellulaire ademhaling door het creëren van een proton-stuwende kracht gebruikt voor ATP-synthese. In dit geval is het proton pompen van de activiteit gekoppeld aan de overdracht van het elektron, hoewel de gedetailleerde mechanisme van dit proces vaak ongrijpbaar blijft.

Onlangs, we de mogelijkheid om paar TL detectie met elektrochemie te bestuderen van proton pompen activiteit van enkele enzymen van de terminal ubiquinol oxidase van Escherichia coli (cytochroom bo3) aangetoond gereconstitueerd in de liposomen14. Dit werd bereikt door de inkapseling van een pH-gevoelige membraan-ondoordringbare fluorescente kleurstof in het lumen van de liposomen bereid uit E. coli polar lipiden (figuur 1A). Het bedrag van de eiwitten is geoptimaliseerd zodat de meeste liposomen ofwel geen of slechts één gereconstitueerde enzym molecuul (volgens de Poisson-verdeling bevatte). De twee substraten voor cytochroom bo3 werden verstrekt door ubiquinone toe te voegen aan de mix van lipide dat de liposomen en (omgevingstemperatuur) zuurstof gevormd in oplossing. De liposomen zijn dan dun geadsorbeerde op een semi-transparante ultrasoepel gouden elektrode, bedekt met een zelf samengestelde enkelgelaagde van 6-mercaptohexanol. Tot slot, de elektrode is gemonteerd op de onderkant van de cel van een eenvoudige spectroelectrochemical (figuur 1B). Elektrochemische controle van de Chinon zwembad redox staat maakt het mogelijk een flexibel starten of stoppen van de enzymatische reactie op elk moment, terwijl de pH-gevoelige kleurstof gebruikt voor het bewaken van pH veranderingen binnen het lumen van de liposomen als gevolg van proton translocatie door de enzymen. Met behulp van die de intensiteit van de fluorescentie van een tweede, lipide-gebonden fluorescente kleurstof, de grootte en het volume van de afzonderlijke liposomen kan worden bepaald en dus de kwantificering van enzym proton pompen activiteit. Met behulp van deze techniek, vonden met name wij dat cytochroom bo3 moleculen om te gaan met een spontane lek staat die snel de proton motive force verdwijnt. Het doel van dit artikel is voor het omschakelen techniek van één liposoom metingen in detail.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. bereiding van de Mix van een lipide/UQ-10/FDLL

Opmerking: E. coli lipiden gebruikt voor de voorbereiding van de liposomen moeten worden aliquoted en grondig gemengd met ubiquinone-10 (enzym substraat) en lange golflengte fluorescerende kleurstof-geëtiketteerden lipiden (voor de bepaling van de maat van de liposomen) voorafgaand aan de reconstitutie.

  1. Met een glazen injectiespuit, overdracht 200 µL van chloroform voorraad van lipide polar uittreksel van Escherichia coli (25 mg/mL) in glazen flesjes te maken van 5 mg aliquots.
  2. Voeg 50 µL van 1 mg/mL ubiquinone-10 (UQ-10; in chloroform) naar de lipiden te maken van de definitieve verhouding van UQ-10: lipiden-1:100 (1% m/m).
  3. Voeg 20 µL van 1 mg/mL (0,4% w/w) van een lange golflengte fluorescerende kleurstof-geëtiketteerden lipide (FDLL) aan de lipiden/UQ-10 mix.
  4. Meng de chloroformoplossing door korte vortexing en verdampen allermeest naar de chloroform onder een zachte stikstof of argon stroom. De sporen van chloroform geheel verwijderen door verdere verdamping onder drukvermindering voor ten minste 1 uur.
    Opmerking: Lipide aliquots kunnen worden opgeslagen onder een inerte atmosfeer bij-20 ° C voor enkele maanden.

2. reconstructie van cytochroom bo3

Opmerking: Voor de zuivering van cytochroom bo3 van E. coli, volg het protocol van Rumbley et al. 15 opdat hoge zuiverheid van native-gevouwen enzym monsters, grootte-uitsluiting chromatografie toevoegen na de affiniteit zuivering stap beschreven door Rumbley et al. 15

  1. Voeg 312.5 µL van 40 mM MOPS-KOH/60 mM K2dus4, pH 7.4, op een hoeveelheid lipiden/UQ-10/FDLL droge mix (5 mg, stap 1.4) en meng met vortex tot de lipide-film is volledig geresuspendeerde, gevolgd door 2 min van de behandeling in een ultrasoonbad.
  2. Voeg 125 µL van 25 mM 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic zuur (HPTS), een pH-gevoelige fluorescente kleurstof die moet worden ingekapseld binnen de liposomen.
  3. Voeg 137.5 µL van 250 mM n-octyl β-D-glucopyranoside (OGP) oppervlakteactieve stof, meng met behulp van vortex en bewerk ultrasone trillingen ten in een ultrasone waterbad voor 10 min. zodat alle lipiden zijn ontbindend in oppervlakteactieve stof micellen. Breng de spreiding in een plastic buis van 1,5 mL.
    Opmerking: Bewolkt opschorting van lipiden transparant moet worden na de solubilisatie met oppervlakteactieve stof.
  4. Voeg de vereiste hoeveelheid cytochroom bo3 (Zie de onderstaande opmerking) en ultrapure water om een totaal volume van 50 µL (cytochroom bo3 oplossing plus water) toe te voegen. Incubeer bij 4 ° C gedurende 10 minuten op een roller mixer.
    Opmerking: Typisch bedrag voor één enzym voorwaarden is 0,1 – 0,2% (w/w eiwit-naar-lipide, dwz. 5-10 µg eiwit), hoewel het kan worden verhoogd tot 1-2% (50-100 µg voor eiwit) als het doel is om het observeren van alleen de elektrochemische activiteit (zie hieronder). Als een negatieve controle, kunnen liposomen zonder cytochroom bo3 worden voorbereid.
  5. Weeg 2 x 50 mg en 2 x 100 mg van polystyreen microbeads in vier 1,5 mL-buis caps en sluit met paraffine film om te voorkomen dat het drogen.
    Opmerking: Voordat gebruiken, polystyreen microbeads moet worden gewassen met water, methanol en opgeslagen in water volgens de handleiding van de fabrikant.
    Opmerking: Als een mengsel van water/microbead wordt gebruikt, polystyreen microbeads kan gemakkelijk worden overgedragen aan het GLB met een micropipet met een brede tip. Water kan vervolgens worden verwijderd uit de microbeads met behulp van een micropipet met een dun puntje.
  6. Voeg de 1st50 mg van polystyreen microbeads in de reconstitutie mengsel (stap 2.4) door de invoering van het GLB met polystyreen microbeads op de 1,5 mL-kunststof buis met dispersie en het uitvoeren van een korte draai voor een paar seconden. Incubeer bij 4 ° C op een roller mixer voor polystyreen microbeads aan de oppervlakteactieve stof gedurende 30 minutenadsorberen.
    1. Herhaal de toevoegingen van polystyreen microbeads en incubations als volgt: Voeg toe 50 mg microbeads voor 60 min van incubatie; toevoegen van 100 mg microbeads voor 60 min van incubatie; en voeg 100 mg microbeads voor 120 min van incubatie.
      Opmerking: De oplossing boven de vaste microbeads zal schakelen doorschijnend tijdens stap 2.6 als proteoliposomes worden gevormd.
  7. De oplossing van de proteoliposome te scheiden van de polystyreen microbeads met behulp van een micropipet met een dun puntje. Verdun de dispersie in 90 mL van 20 mM MOPS-KOH/30 mM K2dus4, pH 7.4 (MOPS buffer) en overdracht in een Ti45 ultracentrifuge buis.
  8. Ultracentrifuge de dispersie Type 45 Ti met rotor bij 125.000 x g (bij rmax) voor 1 h van de proteoliposomes pellet.
    Opmerking: Kleinere centrifuge buizen bruikbaar hoewel de verdunning in grote buffervolume draagt bij aan vermindering van de concentratie van de HPTS niet-ingekapseld in de definitieve opschorting.
  9. Verwijder het supernatant, spoel de korrels met 20 mM MOPS-KOH/30 mM K2dus4, pH 7.4 buffer (zonder de pellet te resuspending). Na de spoeldouche buffer teruggooi, resuspendeer de proteoliposomes in 500 µL van MOPS buffer door het heen en weer pipetteren met dunne tip micropipet. Vervolgens overbrengen naar een 1,5 mL plastic buis.
  10. Centrifugeren van de suspensie voor 5 min op 12.000 x g te verwijderen van het puin. Breng het supernatant (synthetisch proteoliposomes) in een nieuwe flacon.
  11. De gereconstitueerde proteoliposomes verspreiding bij 4 ° C's nachts opslaan en gebruiken binnen 2 dagen.

3. fabricage van semi-transparante gouden elektroden

Opmerking: De gouden glad oppervlak wordt verkregen door een sjabloon strippen methode van een 30 nm-dikke laag van 99,99% goud uit een succesvol glad silicium wafer. De kleine dikte van het goud laag is belangrijk aangezien het moet zijn semi-transparante toe te staan van de fluorescentie observatie. Details voor gouden verdamping (fysieke vapor deposition, PVD) worden vindt elders16 en hier enige sjabloon-strippen is bedekt. U kunt ook kunnen ultrasoepel gouden chips worden gekocht elders (Zie Tabel van materialen).

  1. Maximaal 9 glazen cover slips (0,17 mm dik) op de verdampte gouden oppervlak met behulp van bi-component laag-fluorescentie epoxy lijm. Genezen van de lijm bij 80 ° C gedurende 4 uur.
  2. Los net voor wijziging met een zelf samengestelde enkelgelaagde (stap 4), de glazen cover glijdt van de silicium-wafels met een mes. Vanwege de dunheid van de cover slips, wees voorzichtig bij het loskoppelen van de cover glijdt om geen barsten of breken van het glas dia's.

4. wijziging van het gouden oppervlak met zelf geassembleerde enkelgelaagde (SAM)

  1. 5 mL water-oplossing van 1 mM 6-mercaptohexanol (6MH) voor te bereiden.
  2. Dompel vers vrijstaande goud beklede cover slips (stap 3.1) in 6MH-oplossing en laat 's nachts bij 20-25 ° C (> 16 h) om te vormen van de SAM.
    Opmerking: Thiol oplossingen hebben een onaangename geur, dus een gesloten schip moet worden gebruikt wanneer u de cover goud beklede slip aan het broeden.
  3. De volgende dag, verwijder de cover goud beklede slip uit de 6MH oplossing, kort wassen met water of methanol en vervolgens met isopropanol. Droog onder een zachte gasstroom.

5. de elektrochemische testen van Proteoliposomes activiteit

Opmerking: De elektrochemische activiteit van het enzym wordt eerst gecontroleerd op een nauw verpakte liposomen laag (stap 5) en lagere vesikel dekkingen worden gebruikt in enkele blaasjes experiment voor het meten van pH-veranderingen in het lumen van de liposomen (stap 6).

  1. Monteren van de cover goud beklede slip in een spectro-elektrochemische cel (Zie Figuur 1). Maak contact met het goud met een platte draad buiten een gebied dat wordt begrensd door een rubberen O-ring.
  2. Voeg toe 2 mL van de bufferoplossing elektrolyt en plaats van de referentie- en ondersteunende elektroden in de cel.
    Opmerking: Zoals nader besproken in de sectie discussie, zijn verwijzingen elektroden zonder chloride voorkeur te voorkomen van vorming van Au (I) Cl tijdens elektrochemie. Hier, een Hg/Hg2SO4 (zat. K2SO4) referentie-elektrode wordt gebruikt en mogelijkheden krijgen versus standaard waterstof elektrode (zij) met behulp van 0.658 V vs ze voor de Hg/Hg2SO4 (zat. K2zo4).
  3. Elektrochemische impedantie spectroscopie (0,1 Hz-100 kHz) op open cel potentiële (OCP) potentieel te beoordelen van de kwaliteit van SAM uitvoeren. Impedantie waarden omzetten in toelating en delen door 2πω kunnen worden uitgezet op een perceel van Cole-Cole, waar ω de frequentie is (Zie de volgende referenties16,17,18 voor meer informatie over het converteren en interpreteren van impedantie Spectra).
    Opmerking: Compact en dichte SAMs van 6MH moeten geven een sluiten aan semi-cirkel Cole-Cole perceel en geven precisiecapaciteit waarden in het bereik 2.5-3.0 µF/cm2 (figuur 2A). Als aanzienlijke afwijking van semi-cirkel vorm of out-of-range precisiecapaciteit waarden worden verkregen, wijzigen de elektrode.
  4. Lege cyclische voltammograms (CVs) uitgevoerd met scan tarieven 100 en 10 mV/s in de potentiële regio -0,3-0,8 V. Een typische CV wordt getoond op (figuur 2B, stippellijn).
    Opmerking: Dit moet blijk geven bijna pure capacitieve gedrag en een gebrek aan significante faradaic stroom, zelfs onder de ambient zuurstof voorwaarden zoals hier gebruikt.
  5. Toevoegen van proteoliposomes (0,5 mg/mL definitieve lipiden concentratie, 1-2% (w/w) verhouding van cytochroom bo3 van lipide) naar de elektrochemische cel en meng lichtjes met een pipet. Wacht tot de adsorptie van proteoliposomes op het oppervlak van de elektrode is afgewerkt (30-60 min bij kamertemperatuur).
    Opmerking: Cyclische voltammograms (CVs) 10 mV/s kan worden uitgevoerd tijdens de adsorptie van de proteoliposomes om het proces te volgen. De adsorptie is voltooid wanneer opeenvolgende CVs stopt wijzigen. Informatie over de technieken van de CV kan worden gevonden in de volgende handboeken. 19 , 20
  6. Wassen van de cel door het veranderen van de bufferoplossing ten minste 10 keer maar te voorkomen dat het oppervlak van de elektrode helemaal droog.
  7. Voert de elektrochemische impedantie spectroscopie achter OCP (figuur 2A, blauwe lijn) om te bevestigen dat de SAM op de gouden elektrode blijft ongewijzigd en CVs met scannen tarieven 10 en 100 mV/s te observeren van ubiquinol katalytische oxidatie (en vermindering van zuurstof) door cytochroom Bo 3 bij begin potentieel van elektrochemische chinonen vermindering over 0 V vs ze) (figuur 2B).

6. opsporen van enzymatische Proton pompen door fluorescentie microscopie

  1. Wijzig de gouden elektrode zoals in stap 5 maar met behulp van 100 x minder proteoliposomes in vergelijking met stap 5.5 (dat wil zeggen, 5 µg/mL). Voor één enzym studies, verminderen de cytochroom bo3 aan lipide verhouding tot 0,1-0,2% (m/m).
    Opmerking: Liposomen zal dunbevolkte adsorberen op het oppervlak van de elektrode één vesikel controle door fluorescentie microscopie inschakelen. Onder de voorwaarden van deze single-enzym is de hoeveelheid enzym geïmmobiliseerd op het oppervlak van de elektrode onvoldoende voor de waarneming van een katalytische stroom.
  2. Plaats de elektrochemische cel op de doelstelling van de olie (60 X) van een omgekeerde fluorescentie Microscoop met een druppel olie van de onderdompeling. Met behulp van geschikte filters voor FDLL fluorescentie, focus op het oppervlak van de elektrode. Enkele liposomen moeten worden weergegeven als heldere vlekken op de grens van de diffractie van de Microscoop/doelstelling. Neem een foto van FDLL fluorescentie.
  3. Overschakelen naar de een van HPTS fluorescentie filter sets op de Microscoop om te verifiëren dat HPTS fluorescentie duidelijk zichtbaar en te onderscheiden van de achtergrond is (bij de gekozen belichtingstijd, zie stap 6.4). De lichtintensiteit verhogen als het is niet het geval.
  4. Program van de Microscoop software voor het uitvoeren van een getimede Beeldacquisitie door afwisselend twee HPTS filter sets (menu toepassingen | Define/Run ND overname). Stel de vertraging tussen afbeelding acquisities minimaal. In dit experiment, door een 1 s blootstelling en 0.3 s vertraging (ten gevolge van de beweging van het torentje) te gebruiken.
    Opmerking: De verhouding tussen de intensiteit van de fluorescentie op deze twee kanalen zal later worden geconverteerd naar pH binnen de liposomen op elk tijdstip. De duur van de overname kan variëren naar gelang de snelheid van de verwachte pH wijzigen; 5 min wordt gebruikt in dit artikel.
  5. Pas de instellingen van de potentiostaat om het potentieel tijdens de Beeldacquisitie. Bijvoorbeeld in dit experiment, gebruikt u de volgende reeks: 0-60 s: geen potentieel toegepast (dat wil zeggen OCP); 60-180 s: -0,2 V (VS. ze); 180-300 s: 0.4 V (VS. ze). In dit geval, alleen het toegepaste potentieel in de tweede fase (-0,2 V vs ze) is voldoende om efficiënt het Chinon zwembad.
  6. Gelijktijdig de getimede beelden acquisitie (Microscoop) en de mogelijke volgorde (potentiostaat) door beide metingen handmatig te starten op hetzelfde moment.
    Opmerking: Het experiment kan worden herhaald op de dezelfde elektrode verschillende tijd door het stadium van de Microscoop te verplaatsen naar een ander gebied op het oppervlak. De vertraging tussen de overnames moet minstens 5-10 min te verzekeren van volledige pH evenwichtsinstelling van liposomen op het oppervlak. Verschillende looptijden en potentiële patronen kunnen worden toegepast, afhankelijk van de behoefte, hoewel imaging tijd beperkt door photobleaching van HPTS tijdens de overname is.

7. analyse van beelden van de fluorescentie

Opmerking: Een typisch experiment produceert een reeks van beelden met de stap van een tijd (bijvoorbeeld 2.6 s) voor elk van de twee kanalen, dat wil zeggen, (duur * 2 / 2.6) beelden. Een voorbeeld van zo'n afbeelding instellen opgenomen tijdens een experiment één enzym kan zijn toegankelijk via het onderzoek gegevens Leeds repository21. De behandeling van een afbeelding bestaat uit verschillende stappen met behulp van Fiji (ImageJ) en op hoog niveau wiskundige analyse programmering taal software (voortaan bedoeld als scripting software, Zie Tabel van materialen voor details).

  1. Gebruik Fiji te scheiden van tijd vervallen bestand, afbeeldingen uitlijnen en opslaan als afzonderlijke kanalen en termijnen.
    1. Open tijd vervallen bestand met behulp van de importeur van de Bioformats verstrekt binnen Fiji (opdracht macro: ("Bio-formaten importeur") uitvoeren).
    2. Gebruikt de plugin StackReg voor het uitlijnen van elk frame op de eerste rekening mogelijk stadium bewegingen of thermische drift heeft plaatsgevonden tijdens de overname (macro-commando: run ("StackReg", "transformatie = vertaling")).
    3. Afzonderlijke niet-gecomprimeerde image bestanden voor elk kanaal en elke keer stap in TIFF-indeling opslaan in één map.
    4. Pak de exacte tijdstempels voor elk frame van de tijd vervallen bestand metagegevens en deze opslaan als een CSV-bestand in dezelfde map als de beelden. Uitwijkmogelijkheid, uittreksel van tijdstempels met behulp van de software van de verwerving en handmatig opslaan in een CSV-bestand met behulp van een spreadsheet-software.
      Opmerking: De map met afbeeldingen en tijdstempels is nu klaar om te worden geanalyseerd door de scripting software. Stappen 7.1.1. – 7.1.4. kan worden automatized met behulp van een Fiji-script (een script dat is geschreven in Python voor batch-verwerking van tijd vervallen bestanden wordt verstrekt, gebruik "Ctrl-Shift-N" (in Windows), dan bestand | Open voor het laden van het script).
  2. Gebruik scripting software voor geautomatiseerde verwerking van de beelden. Laden van de verstrekte code naar de software en klik op uitvoeren tot einde. Wanneer gevraagd, selecteert u de map met de afbeeldingen uit stap 7.1.
    Opmerking: Een script voor analyse worden verstrekt als de levende script mlx-formaat, met uitgebreid commentaar, te identificeren van één liposomen, ze passen naar 2D-Gaussiaans functie, hen te filteren en kwantificeren van de pH-waarden op elk punt van tijd. De volgende substappen worden automatisch uitgevoerd door het script.
    1. Alle afbeeldingen van de termijnen voor een enkele experiment in het geheugen laden.
    2. Gemiddelde van alle afbeeldingen voor een enkel kanaal (Selecteer het kanaal met de hoogste intensiteit van de fluorescentie) en het gemiddelde beeld om te identificeren alle maxima die met de enkele liposomen overeen mogelijk.
    3. Fit de vastgestelde maxima op de gemiddelde afbeelding om de 2D-Gaussiaans functioneren en sla de resulteerde passen parameters voor elke liposoom (Zie figuur 4A ingerichte liposoom bijvoorbeeld).
    4. Filter de maxima volgens de criteria van de verwachte interne liposomen, zoals tekengrootte, cirkelvormigheid en intensiteit. Verwerpen liposomen die slecht als gevolg van lage signaal uitgerust zijn voor lawaai, nauw naburige liposomen of ook dicht bij de rand van de afbeelding.
    5. Tijdstempels van het externe bestand laden en elke gefilterde liposoom aan de 2D-Gaussiaans functie op elk moment frame beeld afzonderlijk passen.
      Opmerking: Het gebruik van parallel programmeren en multicore CPU kan aanzienlijk vergroten de snelheid van de berekening in dit stadium.
    6. Filter de liposomen weer volgens de gelijkaardige criteria zoals in stap 7.2.4 maar toegepast op elk moment frame.
    7. Op elke stap van de tijd, de intensiteit fluorescentie verhouding tussen een liposoom te definiëren als de verhouding van de volumes omsloten door ingerichte 2D-Gaussiaans functie op twee kanalen. Bereken de pH-waarden van de verhouding tussen de intensiteiten bepaald op basis van de twee kanalen van de HPTS en met behulp van een ijkcurve (stap 8). Uitzetten van de resulterende pH-tijd-curven voor de liposomen en observeren van hun pH wijzigen wanneer het potentieel wordt toegepast.

8. het uitvoeren van een ijkcurve van HPTS fluorescentie

Opmerking: Als u wilt HPTS fluorescentie verhouding omzetten in een intravesicular pH, een kalibratiekromme moet eerst komen zou die rekening houden met bijzondere omstandigheden voor experimenten zoals gouden doorlating, kwaliteit van de filters, enz. Deze stap heeft slechts een of twee keer worden uitgevoerd en de kalibratiegegevens kunnen worden gebruikt, zolang de setup en meting parameters hetzelfde in stap 6 blijven.

  1. Voorbereiden van een elektrode met dun geadsorbeerde liposomen (zonder cytochroom bo3 zoals beschreven in stap 5 en 6.1).
  2. 2 µL van 0,1 mg/mL gramicidin oplossing in ethanol toevoegen aan 2 mL buffer maken de concentratie 100 ng/mL.
  3. Twee fluorescentie beelden voor de twee HPTS-zenders vastleggen.
  4. De pH-waarde van de cel wijzigen door toevoeging van kleine hoeveelheden van 1 M HCl of 1 M H2dus4. Meten van de pH van de buffer met een standaard pH-meter en twee fluorescentie opnamen voor de twee HPTS-kanalen.
  5. Herhaal stappen 8.4 voor de pH bereik 6 tot en met 9.
  6. Met behulp van het algoritme van 7.2, passen, te filteren en berekenen van de gemiddelde verhouding van de fluorescentie van de HPTS van individuele liposomen bij elke pH. Neem de HPTS verhouding gemiddelde over alle liposomen.
  7. Passen de resulterende afhankelijkheid van de pH-verhouding voor de volgende vergelijking:
    figure-protocol-1, waar pKeen, Reen en Rbpassen parameters.
  8. Gebruik pKeen, Reen en Rbom te zetten van de verhouding van de HPTS van individuele liposomen in stap 7.2.7. pH-waarden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De kwaliteit van de goud-bewerkt cover slip (de elektrode) met een SAM van 6MH wordt gecontroleerd voordat elk experiment met elektrochemische impedantie spectroscopie. Figuur 2A toont representatieve Cole-Cole percelen gemeten met behulp van elektrochemische impedantie spectroscopie voordat en nadat de liposomen zijn geadsorbeerd. Als de kwaliteit van SAM voldoende is, kan een bijna pure capacitieve gedrag wat resulteert in een semi-cirkel Cole-Cole plot moe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De beschreven methode is geschikt om te studeren van proton pompen door respiratoire membraaneiwitten die kunnen worden toegevoegd in liposomen en kunnen uitwisselen van elektronen met de Chinon zwembad. Proton pompen activiteit kan worden gecontroleerd op het niveau van de single-enzym met pH-gevoelige (ratiometric) verfstoffen ingekapseld in het liposoom lumen (figuur 1A).

De methode is afhankelijk van het vermogen van ubiquinone (of andere quinones), opgenomen ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs erkennen het BBSRC (BB/P005454/1) voor financiële steun. NH werd gefinancierd door de VILLUM Foundation Young Investigator programma.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
6-Mercapto-1-hexanol (6MH)Sigma45108897%
8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid (HPTS)BioChemika56360
Aluminium holder (Electrochemical cell)Op maat gemaakt30x30x7 mm; binnendiameter: 26 mm; gatdiameter: 15 mm
Auxiliary electrodeplatina draad
ChloroformVWR Chemicals83627
E.coli polaire lipidenAvanti100600C25 mg/mL in chloroform
EpoxyEPO-TEK301-2FLepoxy met lage fluorescentie
Fiji (ImageJ 1.52d)Vereiste plugins: StackReg en TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)
Filter cube ("ATTO633")Chroma Technology CorporationEx: 620/60 nm; DM: 660 nm; Em: 700/75 nm
Filter cube ("HPTS1")Chroma Technology CorporationEx: 470/20 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm
Filter cube ("HPTS2")Chroma Technology CorporationEx: 410/300 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm
Filter cube ("Texas Red")Chroma Technology CorporationEx: 560/55 nm; DM: 595 nm; Em: 645/75 nm
Fluorescent dye-labelled lipiden (FDLL)ThermoFisher ScientificT1395MPTexasRed-DHPC werd in dit werk gebruikt (λexc 595 nm; λem 615 nm)
Fluorescent dye-labelled lipiden (FDLL) (alternatief)ATTO-TECAD 633-161ATTO633-DOPE kan als alternatief worden gebruikt (λexc 630 nm; λem 651 nm)
Gel filtratie kolomGE Healthcare28-9893-33HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, voor aanvullende eiwitzuivering
Glazen dekglasjesVWR International631-0172No 1.5
Glazen spuitHamilton1725 RNR250 µL
Glazen vialsScientific Glass Laboratories LtdT101/V11.75 mL capaciteit
GoudGoodFellow99,99%
GramacidineSigmaG5002
Kwiksulfaat referentie-elektrodeRadiometer (Hash)E21M012
MicrocentrifugeEppendorfMinispin NL040
MicroscoopNikonEclipse Ti
MicroscoopcameraAndorZyla 5.5 sCMOS
MicroscooplampNikonIntensilight C-HGFI
NIS-Elements AR 5.0.2NikonMicroscoop acquisitie software
n-Octyl β-D-glucopyranosideMelford LaboratoriesB2007
Nova 1.10MetrohmPotentiostat control software
ObjectiefNikonPlan Apo λ 60x/1.4 olie
OriginPro 2017OriginLabPlot software
O-ring (Electrochemical cell)OrinokoBinnendiameter: 16 mm; doorsnede: 1,5 mm
Kunststof buisjesEppendorf3810X1,5 mL
Polystyreen microbeadsBio-RAD152-3920Biobeads, 20-50 mesh
PotentiostatMetrohm AutolabPGSTAT 128N
PotentiostatCH InstrumentsCHI604C
Scripting softwareMatlabR2017aVereiste toolboxes: 'Image Processing Toolbox', 'Parallel Computing Toolbox', 'Curve Fitting Toolbox', 'System Identification Toolbox', 'Optimization Toolbox'
Silicion wafersIDB Technologies LTDSi-C2 (N<100>P)Ø 25 mm, 525 um dik
Teflon cell (Electrochemical cell)Op maat gemaaktBuitendiamter: 26 mm; binnendiameter: 13,5 mm
Temple-Stripped Ultra-Flat Gold SurfacesPlatypus TechnologiesAU.1000.SWTSGAlternatieve kant-en-klare ultra-platte gouden oppervlakken (dikte onder de 100 nm op aanvraag)
Dunne micropipet tipsSarstedt70.1190.100of soortgelijke gelloader tips 200 µL
Ubiquinone-10SigmaC-9538
UltracentrifugeBeckman-CoulterL-80XPmet Ti 45 rotor
UltrasoonbadFisher ScientificFB15063

Referenties

  1. Claessen, V. I., et al. Single-Biomolecule Kinetics: The Art of Studying a Single Enzyme. Annual Review of Analytical Chemistry. 3 (1), 319-340 (2010).
  2. Rojek, M. J., Walt, D. R. Observing Single Enzyme Molecules Interconvert between Activity States upon Heating. PLoS ONE. 9 (1), e86224(2014).
  3. Velonia, K., et al. Single-Enzyme Kinetics of CALB-Catalyzed Hydrolysis. Angewandte Chemie International Edition. 44 (4), 560-564 (2005).
  4. Lu, H. P., Xun, L., Xie, X. S. Single-molecule enzymatic dynamics. 282 (5395), Science. New York, N.Y. 1877-1882 (1998).
  5. Engelkamp, H., Hatzakis, N. S., Hofkens, J., De Schryver, F. C., Nolte, R. J. M., Rowan, A. E. Do enzymes sleep and work? Chemical Communications. 9 (9), 935-940 (2006).
  6. Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 105 (48), 12165-12170 (2001).
  7. Hsin, T. -M., Yeung, E. S. Single-Molecule Reactions in Liposomes. Angewandte Chemie International Edition. 46 (42), 8032-8035 (2007).
  8. García-Sáez, A. J., Schwille, P. Single molecule techniques for the study of membrane proteins. Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (2), 257-266 (2007).
  9. Onoue, Y., et al. A giant liposome for single-molecule observation of conformational changes in membrane proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (6), 1332-1340 (2009).
  10. Jefferson, R. E., Min, D., Corin, K., Wang, J. Y., Bowie, J. U. Applications of Single-Molecule Methods to Membrane Protein Folding Studies. Journal of Molecular Biology. 430 (4), 424-437 (2018).
  11. Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. BBA - Bioenergetics. 1231 (3), 223-246 (1995).
  12. Jesorka, A., Orwar, O. Liposomes: Technologies and Analytical Applications. Annual Review of Analytical Chemistry. 1 (1), 801-832 (2008).
  13. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  14. Li, M., et al. Single Enzyme Experiments Reveal a Long-Lifetime Proton Leak State in a Heme-Copper Oxidase. Journal of the American Chemical Society. 137 (51), 16055-16063 (2015).
  15. Rumbley, J. N., Furlong Nickels, E., Gennis, R. B. One-step purification of histidine-tagged cytochrome bo3 from Escherichia coli and demonstration that associated quinone is not required for the structural integrity of the oxidase. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology. 1340 (1), 131-142 (1997).
  16. Jeuken, L. J. C., et al. Phase separation in mixed self-assembled monolayers and its effect on biomimetic membranes. Sensors and Actuators, B: Chemical. 124 (2), 501-509 (2007).
  17. Barsoukov, E., Macdonald, J. R. Impedance Spectroscopy Theory, Experiment, and Applications. , John Wiley & Sons. Chapters 1-2 (2005).
  18. Jeuken, L. J. C., Connell, S. D., Henderson, P. J. F., Gennis, R. B., Evans, S. D., Bushby, R. J. Redox Enzymes in Tethered Membranes. Journal of the American Chemical Society. 128 (5), 1711-1716 (2006).
  19. Compton, R. G., Banks, C. E. Chapter 4. Understanding voltammetry. , World Scientific Publishing Europe Ltd. Singapore. (2018).
  20. Girault, H. H. Chapter 10. Analytical and Physical Electrochemistry. , EPFL Press. Lausanne. (2004).
  21. Mazurenko, I., Jeuken, L. J. C. Timelapse (movie) of single vesicles fluorescence change upon potential application. , (2018).
  22. Li, M., Khan, S., Rong, H., Tuma, R., Hatzakis, N. S., Jeuken, L. J. C. Effects of membrane curvature and pH on proton pumping activity of single cytochrome bo3enzymes. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1858 (9), 763-770 (2017).
  23. Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. MATLAB code for the analysis of proton transport activity in single liposomes. , (2017).
  24. Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. Time-resolved fluorescence microscopic data (traces) of individual lipid vesicles with proton transport activity. , (2017).
  25. Paula, S., Volkov, A. G., Van Hoek, A. N., Haines, T. H., Deamer, D. W. Permeation of protons, potassium ions, and small polar molecules through phospholipid bilayers as a function of membrane thickness. Biophysical Journal. 70 (1), 339-348 (1996).
  26. Brookes, P. S., Hulbert, A. J., Brand, M. D. The proton permeability of liposomes made from mitochondria) inner membrane phospholipids: No effect of fatty acid composition. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1330 (2), 157-164 (1997).
  27. Eriksson, E. K., Agmo Hernández, V., Edwards, K. Effect of ubiquinone-10 on the stability of biomimetic membranes of relevance for the inner mitochondrial membrane. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1860 (5), 1205-1215 (2018).
  28. Seneviratne, R., et al. A reconstitution method for integral membrane proteins in hybrid lipid-polymer vesicles for enhanced functional durability. Methods. , 1-8 (2018).
  29. Veshaguri, S., et al. Direct observation of proton pumping by a eukaryote P-type ATPase. Science. 351 (6280), 1-6 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

ProtonpompendzymenElektrochemische fluorescentiemicroscopieCytochroom bo3Proteoliposomale reconstitutiepH gevoelige kleurstof HPTSFluorescentiemicroscopische analyseElektrochemische impedantiespectroscopieStudies naar enkelvoudige enzymenLipidendubbellaagomgeving

Gerelateerde artikelen