Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie van primaire lymfkliertest skeletspieren microvasculaire endotheliale cellen

10.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58901

⸱

6 maart 2019

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Translational Neurology and Neurology Clinic, University of Muenster

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Microvasculaire endotheliale cellen van skeletspieren (MMEC) vorm van de binnenwand van de spier haarvaten en reguleren beide, uitwisseling van vloeistoffen/moleculen en migratie van (afweercellen) tussen spierweefsel en bloed. Isolatie van primaire lymfkliertest MMEC, kunt zoals hier beschreven, u uitgebreide in vitro onderzoeken van de "myovascular-eenheid".

Samenvatting

De endotheliale cellen van skeletspieren haarvaten (microvasculaire endothelial spiercellen, MMEC) opbouwen van de barrière tussen de bloedstroom en debeenderspieren regulering van de uitwisseling van vloeistoffen en voedingsstoffen, evenals de immuunrespons tegen besmettelijke agenten door immuun cel migratie te beheren. Voor deze functies, MMEC vormen een functionele "myovascular eenheid" (MVU), met verdere celtypen, zoals pericytes, fibroblasten en cellen van de skeletspieren. Bijgevolg een dysfunctie van MMEC en dus de MVU draagt bij aan een grote verscheidenheid van myopathieën. Echter regulerende mechanismen van MMEC bij gezondheid en ziekte blijven onvoldoende begrepen en hun opheldering voorafgaat aan meer specifieke behandelingen voor myopathieën. De isolatie en diepgaand onderzoek van de primaire functies van de MMEC in het kader van de MVU zou kunnen vergemakkelijken een beter inzicht in deze processen.

Dit artikel bevat een protocol om te isoleren van primaire lymfkliertest MMEC van de skeletspieren door mechanische en enzymatische dissociatie, met inbegrip van de zuivering en cultuur onderhoud stappen.

Inleiding

Via de bloedbaan, cellen en organen zijn voorzien van zuurstof, substraten en andere noodzakelijke moleculen. Deze uitwisseling vindt plaats in de haarvaten, de kleinste vaartuigen. Haarvaten worden gevormd door een cellaag van de innerlijke endothelial (EG) waarvan de integriteit een voorwaarde voor succesvolle regulering van de homeostase van de spier tussen de intravasculaire en interstitiële ruimte blijft. Om te zorgen voor een selectieve overgang van oplosbare factoren en cellen, EG vormen een enkelgelaagde onderling verbonden door strak en adherens kruispunten 1. Naast haar rol als barrière voor voedingsstoffen of stofwisselingsproducten, EG regelen de aanwerving van leukocyten in inflammatoire processen. Ontsteking of weefsel schade leidt tot een up-regulatie van celadhesie-moleculen op het oppervlak van de EG en de productie van chemokines leukocyte bijlage en transmigratie in de target weefsel 2te vergemakkelijken. Bijgevolg zijn de EG kritisch betrokken bij de regulatie van inflammatoire processen zoals de verdediging tegen ziekteverwekkers of weefselherstel.

Een dysfunctie van de EG is direct gekoppeld aan vasculaire ziekten, chronisch nierfalen, veneuze trombose ernstige pathogen infecties. Bovendien EG zijn bijna altijd betrokken bij orgaan-specifieke autoimmuniteit zoals diabetes mellitus of multiple sclerose 3. De functie als barrière tussen bloed en organen wordt daarom beheerd door een gezamenlijke samenspel van verschillende celtypes. In de skeletspieren microvasculaire endotheliale cellen (MMEC) samen met de spiercellen, fibroblasten en pericytes vormen een functionele eenheid, de "eenheid van de myovascular" (MVU). Daarom kan een dysfunctie van de MVU een cruciale rol spelen in de pathofysiologie van myopathieën. Echter een dieper begrip van deze regulerende mechanismen ontbreekt nog steeds en momenteel verzet zich tegen de identificatie van nieuwe, therapeutische en dringend noodzakelijke doelen in myopathieën.

Om te onderzoeken het complex fysiologische en pathofysiologische mechanismen, worden dierlijke modellen vaak gebruikt. Echter, in vitro modellen bieden het voordeel te concentreren op het onderwerp van belang door een scala aan storende factoren uit te sluiten. Om te onderzoeken processen in vitro er moet zuiver en levensvatbare primaire cellen isoleren. In tegenstelling tot de cellijnen toelaten primaire cellen geïsoleerd van transgene dieren om de gevolgen van genetische modificaties in vitro onderzoeken.

Een methode om te isoleren van de primaire lymfkliertest MMEC wordt hier beschreven met behulp van mechanische en enzymatische dissociatie gevolgd door magnetische geactiveerde cel Sorteren technieken (MCS) voor de zuivering. Voor dit doel, worden magnetische kralen tegen specifieke oppervlakte markers gebruikt. Bloedplaatjes endothelial cel adhesie molecuul-1 (PECAM1, CD31) wordt vooral uitgedrukt op EG en kan worden gebruikt voor het verrijken van dit celtype. Om te rechtvaardigen hoge cel zuiverheid, zijn cellen van hematopoietische oorsprong uitgesloten door een negatieve selectie voor proteïne tyrosine fosfatase receptor type C (PTPRC, CD45). Verder, kwaliteitscontroles, teelt van primaire lymfkliertest MMEC, toepassingsmogelijkheden en beperkingen, alsmede speciale overwegingen worden gepresenteerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierproeven werden goedgekeurd door de lokale autoriteiten en uitgevoerd volgens de Duitse dierenwelzijn wet (84-02.05.20.13.097).

1. algemene opmerkingen over dierproeven

  1. Uitvoeren van alle muis experimenten overeenkomstig de richtsnoeren van de respectieve institutionele dierenverzorgers en gebruik van de Commissie.
  2. Houden van muizen onder gestandaardiseerde condities en volgens internationale richtlijnen zoals de Federatie voor Laboratory Animal Science verenigingen (FELASA).
    Opmerking: In het algemeen kan deze isolatie-techniek worden gebruikt voor muizen onafhankelijk van leeftijd, geslacht of genetische achtergrond. Voor het verkrijgen van een voldoende aantal cellen, hebben 4-10 week oude mannetjes de voorkeur, omdat biologische eigenschappen met leeftijd en geslacht variëren kunnen.

2. bereiding van de oplossingen, Media en Coating

  1. Spijsvertering oplossing (DS) voorbereiden door het mengen van 2.2 mL van Dulbecco´s bewerkt Eagle Medium (DMEM) met 200 μl Collagenase-Dispase en 45 μL Desoxyribonuclease (DNase).
  2. 500 mL Endothelial cel voedingsbodem (ECM) voor te bereiden door het mengen van 450 mL DMEM met 50 mL FCS (ongeveer 10%), 0,25 mL basis fibroblast groeifactor bFGF (20 μg/mL; ongeveer 0,05%) en 5 mL penicilline-streptomycine (ongeveer 1%). Steriele filtratie uitvoeren in een glazen buis (diameter van de poriën van het filter: 0.2 μm). Daarna slaan de oplossing bij 4 ° C.
  3. Jas cel cultuur platen zoals hieronder beschreven.
    1. Voor de teelt van vers geïsoleerde primaire lymfkliertest MEC dekking het hele oppervlak met 1 mL per putje van een 6 cell goed cultuur plaat met een gelatine gebaseerd oplossing voor de coating van de snelheid (Zie Tabel van materialen) volgens de instructies van de fabrikant gedurende 3-5 minuten op kamer temperatuur (RT).
    2. Gecombineerd en gooi coating oplossing. Spoel elk putje met 2 mL steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7.1-7.5 in twee opeenvolgende wassen stappen.
    3. Gecombineerd en zich ontdoen van PBS. Opvullen van putjes met 1 mL volume van ECM.

3. isolatie van primaire lymfkliertest microvasculaire Endothelial spiercellen (MMEC)

  1. Euthanaseren van één volwassene 4-12 weken oude mannelijke muis door cervicale dislocatie zonder enige verdoving. Het doel is te snel scheiden het ruggenmerg van de hersenen zodat het dier met een snelle en pijnloze dood.
  2. Het verbreken van de extremiteiten.
    1. Gebruik een chirurgische sharp/bot (cutting edge 42 mm, rechte) en scherp/sharp (cutting edge 23 mm, rechte) schaar, een rechte (getande, 2 mm x 1,25 mm x 12 cm) en een gebogen (gekarteld, 1.3 mm x 1 mm x 13 cm) pincet.
    2. Desinfecteer alle chirurgische instrumenten met 70% ethanol.
    3. Plaats het dier op zijn rug, de benen met 70% ethanol bevochtigen. Het hele been verbreken door te snijden op het heupgewricht met de sharp/bot chirurgische schaar. Plaats de ledematen in een gesloten cel cultuur schotel (35 x 10 mm).
      Opmerking: Van nu af aan elke stap onder de motorkap van een steriele laminaire flow uitvoeren en werken met gesteriliseerde instrumenten.
  3. Isoleren van spierweefsel (bij voorkeur gebruik de musculus quadriceps femoris of musculus triceps surae van beide benen).
    1. Opengesneden de huid vanaf de heup tot aan de teen-vingertop met behulp van een scherp/scherpe schaar en pincet gebogen. Houd de teen of de struikrover met de rechte pincet. Schil uit de huid met de gebogen verlostang vanaf de teen naar de heup.
    2. Isoleren van de musculus quadriceps femoris door het snijden van de pees van de knie en scheiden van de spier langs het dijbeen naar de heup. De musculus triceps surae isoleren door doorsnijden omvat de achillespees. Hierna snijd langs het scheenbeen aan de popliteale fossa en verwijderen van de spier.
      Opmerking: Als grote schepen (A. femoralis A. tibialis anterior, A. tibialis posterior, A. fibularis) zichtbaar in de geïsoleerde spieren zijn, verwijder vaartuigen om besmetting te voorkomen door macrovascular endotheel.
    3. Als u wilt verwijderen van grote schepen, houd het deel van de spier niet met grote schepen met een gebogen pincet en afgesneden naast het schip. Voor dit protocol, wordt 1 g of minder gelijk is aan zowel de Musculus quadriceps femoris en de triceps surae spierweefsel aanbevolen.
    4. Voeg 2,445 µL DS (uit stap 2.1) aan een cel cultuur dish (35 x 10 mm) en het gewicht bepalen.
    5. Alle stukken van de spier overbrengen in deze cel cultuur schotel met de 2445 µL DS en bepalen van het gewicht. Het verschil tussen beide meetwaarden biedt het drooggewicht van spierweefsel die mag niet meer bedragen dan 1 g.
    6. Snijd de hele spierweefsel in kleine stukjes (≤2 mm kubussen, ongeveer 100 stuks) met behulp van de sharp/scherpe schaar.
  4. Het spierweefsel te distantiëren.
    Opmerking:     deze stap duurt ongeveer 120 min.
    1. Winkel spier/DS schorsing bij 37 ° C (incubator met 5% CO2) voor 1,5 h. Meng de schorsing zorgvuldig elke 20 min. voor ongeveer 5 minuten met behulp van een spuit van 1 mL insuline.
    2. Breng een 70 μm nylon cel zeef in een tube van 50 mL gebracht en de stroom door te verzamelen. Wassen van de cel zeef met 8 mL van DMEM en de stroom door te verzamelen.
    3. Negeren van de zeef en centrifuge celsuspensie gedurende 10 minuten bij 300 x g bij 20 ° C. Verwijder voorzichtig de bovendrijvende substantie.
      Let op: pellet is gemakkelijk te verliezen.
    4. Resuspendeer cel pellet in 1 mL van een Ammonium-Chloride-kalium (ACK) lysing buffer (Zie ingesloten Tabel of Materials) voor de lysis van rode bloedcellen en incubeer 30 s bij RT. toevoegen 9 mL DMEM + 10% FCS om te stoppen met de celsuspensie reactie en overdracht aan een 15 mL-t Ube.
  5. Uitputten CD45+ cellen van de CD45 microbeads fabrikant instructies te volgen. Voor alle volgende stappen van de CD45+ uitputting MCS buffer gebruiken (zie tabel van materialen ingesloten).
    Opmerking:     deze stap duurt ongeveer 60 minuten.
    1. Bepalen van cel nummers met behulp van een Neubauer-cel tellen kamer (verwachten ongeveer 5 x 106 cellen per g spierweefsel).
    2. Centrifuge schorsing bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Supernatant volledig uittrekken en resuspendeer de pellet cel in 90 µL MCS buffer (per 107 cellen of minder). Voeg toe 10 μL van CD45 microbeads (per 107 cellen of minder).
    3. Meng celsuspensie en incubeer gedurende 15 min in de koelkast bij 4-8 ° C.
    4. Voeg 1mL MCS buffer (per 107 cellen of minder). Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Volledig verwijderen van het supernatant en resuspendeer de cellen in 500 μL MCS buffer.
    5. Gebruik een grote magnetische kolom (LMC) met een reservoir volume van 8 mL en een capaciteit van maximaal 2 x 109 totaal aantal cellen voor magnetische cel scheiding. Plaats de LMC in het magnetisch veld van het scheidingsteken.
    6. Spoel met 3 mL MCS buffer in het reservoir van de LMC. Na het spoelen, plaatst u een conische tube van 15 mL onder de kolom voor het verzamelen van stroom door. Toepassing van de hele celsuspensie (500 µL) op de kolom en laat het volledig stroom door.
    7. Was de kolom drie keer door toevoeging van 3 mL voor MCS buffer in het reservoir en wacht tot het column´s reservoir leeg is voordat u de volgende wassen stap uitvoert.
    8. Verzamel de labelloze cellen doorgeven de kolom gebruiken voor verdere scheiding stappen (die vertegenwoordigen de CD45- breuk). Label cellen (die de CD45+ breuk) geaccumuleerde in de kolom kan worden weggegooid.
  6. Accumuleren CD31+ cellen volgende CD31 microbeads aanwijzingen van de fabrikant. Voor alle volgende stappen van de CD31+ accumulatie MCS buffer gebruiken.
    Opmerking:     deze stap duurt ongeveer 60 minuten.
    1. Bepalen van aantal cellen met een Neubauer-cel tellen kamer (verwachten ongeveer 4 x 106 cellen per g spierweefsel).
    2. Centrifuge labelloze celsuspensie verkregen in stap 3.5 voor 10 min bij 300 x g bij 4 ° C.
    3. Verwijder het supernatant volledig. Resuspendeer de pellet in 90 μL MCS buffer en voeg toe 10 μL van CD31 microbeads (per 107 totaal aantal cellen of minder). Meng de hele schorsing en incubeer gedurende 15 min in de koelkast bij 4-8 ° C.
    4. Voeg 1mL MCS buffer en centrifuge bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Opstijgen het supernatant en resuspendeer de cellen in 500 µL van MCS buffer.
    5. Voor de scheiding van de magnetische cel een middellange magnetische kolom (MMC) met een reservoir volume van 3,5 mL en een capaciteit van maximaal 2 x 108 totaal aantal cellen te gebruiken.
    6. Plaats de MMC in het magnetisch veld van het scheidingsteken. Spoel de MMC met 500 µL van MCS buffer. Na het spoelen, plaatst u een conische tube van 15 mL onder de kolom voor het verzamelen van stroom door.
    7. Toepassing van de hele celsuspensie (500 µL) op de kolom en laat het volledig stroom door.
    8. Was de kolom drie keer door het toevoegen van 500 µL van MCS buffer en wachten totdat de kolom reservoir leeg is voordat u de volgende wassen stap uitvoert. Labelloze cellen doorgeven de kolom vertegenwoordigen de CD45- CD31- -Fractie. Bewaar ze voor verdere kwaliteitscontroles.
    9. Kolom verwijderen uit het scheidingsteken en plaatst u deze op een geschikte collectie buis (tube van 15 mL). Pipetteer 2 mL MCS buffer op de kolom. Onmiddellijk spoelen de magnetisch gelabelde cellen door stevig de zuiger te duwen in de kolom. Deze CD45- CD31+ fractie vertegenwoordigt de verrijkte primaire lymfkliertest EG.
    10. Centrifuge celsuspensie gedurende 5 minuten bij 350 x g bij 20 ° C. Volledig verwijderen van supernatant en resuspendeer de cellen (verwachten ongeveer 0,6 x 106 cellen per g spierweefsel) in 1 mL ECM (zie stap 2.2.). Cellen (0,5 – 0.7 x 106 cellen) overdragen aan een enkel putje van de plaat van een gecoate 6-well cultuur (uit stap 2.3) met 1 mL voor ECM.
  7. Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO2 in een steriele incubator voor teelt. Vernieuw de ECM elke twee tot drie dagen.

4. primaire lymfkliertest MMEC zuivering

  1. Uitvoeren van een tweede cyclus van de CD31+ accumulatie, volgens de instructies van de fabrikant (CD31 microbeads muis protocol; Zie stap 3.6.).
    1. Cellen met trypsine/EDTA oplossing loskoppelen wanneer ze op de samenvloeiing van de 80-90% (meestal na 7 dagen). Spoel elk putje met 2 mL steriele PBS, in twee opeenvolgende wassen stappen hiervoor. Gebruik van 800 μL trypsine/EDTA-oplossing per 6-well en Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 in een steriele incubator voor 3-5 min. Stop enzymatische activiteit met behulp van 1200 μL DMEM met een minimum van 10% FCS.
    2. Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 350 x g bij 20 ° C.
    3. De tweede stap van de CD31-MCS te verhogen de zuiverheid (volgens de CD31 microbeads manufacturer´s instructies; zie 3.6.) uitvoeren.
    4. Houd rekening met cel samenvloeiing via heldere veld of standaard fase contrast met behulp van microscopie een
      20 x vergroting en 0.35 numerieke diafragma. Zie Figuur 1.
      Opmerking: Cellen kunnen worden gebruikt voor de respectieve experimenten of in cultuur gehouden door passaging. Cellen worden gebruikt voor experimenten zo spoedig mogelijk in lagere passages. Het is niet aanbevolen om het gebruik van cellen na passage
      8-10.

5. kwaliteitscontrole

  1. Stroom cytometry van primaire lymfkliertest MMEC na de tweede CD31-MCS-stap uitvoeren
    1. Bereiden van een FACS buis door toevoeging van 1 mL stroom cytometry (FC) buffer (Zie ingesloten Tabel van materialen).
    2. Cellen met trypsine/EDTA oplossing loskoppelen wanneer ze op de samenvloeiing van de 100% (meestal na 14 dagen). Spoel elk putje met 2 mL steriele PBS, in twee opeenvolgende wassen stappen hiervoor. Gebruik van 800 μL trypsine/EDTA-oplossing per 6-well en Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 in een steriele incubator voor 3-5 min. Stop enzymatische activiteit met behulp van 1200 μL DMEM met 10% FCS.
    3. Bepaal hoeveel van de cel met behulp van een Neubauer cel tellen kamer en een minimum van 1 x 105 cellen toe te voegen aan de bereid FACS buis.
    4. Centrifuge celsuspensie gedurende 10 minuten bij 300 x g bij 4 ° C. Twee wassen stappen door het verwijderen van de bovendrijvende substantie, resuspending cellen in 1 mL FC buffer en centrifugeren voor 10 min bij 300 x g bij 4 ° C.
    5. Bereiden een kleuring mix door toevoeging van anti-muis CD31-FITC antilichaam (1:100) en anti-muis CD45-PE (1:100) met FC buffer.
    6. Resuspendeer de cellen in 100 μl van de mix in de buizen FACS kleuring. Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Voeg 1 mL FC buffer. Centrifuge celsuspensie gedurende 5 minuten bij 300 x g bij 4 ° C. Zorgvuldig verwijderen van supernatant en resuspendeer de cellen in 200 μL van FC buffer.
    7. Maatstafcellen in een cytometer van de stroom na de gating strategie is weergegeven in figuur. 2A.
  2. U kunt ook uitvoeren immunofluorescentie kleuring van primaire lymfkliertest MMEC na de tweede CD31-MCS-stap.
    1. Jas de coverslips.
      1. Pipetteer een steriele 13 mm diameter ronde glas dekglaasje aan in een putje van een 24 goed plaat. Jas dekglaasje aan door het toevoegen van 300 µL van snelheid coating oplossing per putje. Incubeer gedurende 3-5 minuten bij kamertemperatuur (RT).
      2. Gecombineerd en gooi coating oplossing. Spoel elk putje met 2 mL steriele PBS in twee opeenvolgende wassen stappen. Gecombineerd en zich ontdoen van PBS.
      3. Zaad 1 x 105 cellen in 1 mL ECM op het gecoate dekglaasje aan en Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 in een steriele incubator totdat cellen zijn 99% heuvels.
    2. Het uitvoeren van fixatie en kleuring van immunofluorescentie.
      1. Verwijder het medium van de ECM van gekweekte cellen uit 5.2.1.3.
      2. Herstellen van gekweekte cellen door 300 µL 4% paraformaldehyde (PFA) toe te voegen met de pH van 7,4 per putje, gedurende 10 minuten bij 4° C.
        Let op: PFA is giftig en moet met zorg worden behandeld.
      3. 3 wassen stappen door toevoeging van 1 mL PBS per putje en bovendrijvende vloeistof verwijderen na 5 min op RT.
      4. Bereiden een blokkerende oplossing met 5% BSA, 0,2% Triton-X en 1% geit serum in PBS.
      5. Voeg 300 µL van blokkerende oplossing aan elk putje en incubeer gedurende 1 h op RT.
      6. Verwijder het supernatant en voeg 200 µL per putje van een anti-PECAM-1 (CD31) antilichaam (1:200) in 5% BSA, 1% geit serum in PBS en na een nacht bebroeden bij 4 ° C.
      7. 3 stappen door toevoeging van 1 mL PBS per putje en verwijderen supernatant wassen na 5 min op RT in elke stap uitvoeren
      8. Bereid een secundair antilichaam-oplossing met Cy3-geconjugeerde anti-rat IgG antilichamen (1:500) in 1% BSA en PBS. Voeg 300 µL per putje van de oplossing van secundair antilichaam en incubeer gedurende 1 uur bij RT in het donker.
      9. 3 stappen door toevoeging van 1 mL PBS per putje en verwijderen supernatant wassen na 5 min op RT in elke stap uitvoeren
    3. Neem de ronde glazen coverslips zorgvuldig met een tang en breng dit in een dia van microscopie. Voeg een geschikte hoeveelheid van een medium met DAPI montage op de cellaag en zorgvuldig op te zetten een glas cover (zie bijgevoegde Tabel van materialen).
    4. Observeren van cellen met een passende fluorescentie Microscoop uitgerust met fluorescentie lichtbron (120 W) en twee sets filter: een filter excitatie/emissie ingesteld met 550/25 nm en 605/70 nm golflengten te detecteren Cy3 540/562 nm.
    5. Gebruik een tweede filter instellen met een golflengte van excitatie/emissie van 365/50 nm en 445/50 nm tot het detecteren van de DAPI 350/440 nm. Gebruik een vergroting van 40 x en 80% intensiteit van 14,5 mW/cm2 voor DAPI met een duur van de acquisitie van 30 ms. voor detectie van Cy3 gebruik 80% van 67.5 mW/cm2 met een duur van de acquisitie van 60 ms.
  3. Het uitvoeren van kwantitatieve PCR.
    1. Isolatie van mRNA.
      1. Volg standaardprocedures met behulp van een reagens zure guanidinium kaliumthiocyanaat-fenol (AGTP) te isoleren van mRNA. Gebruik een minimum van 0,5 x 106 cellen uit CD45- CD31- (zie stap 3.6.8), CD45- CD31+ (zie stap 3.6.9.) breuken en gecultiveerde primaire lymfkliertest MMEC (4.1.3)
      2. Centrifuge celsuspensie gedurende 10 minuten bij 300 x g bij 20 ° C. Het supernatant volledig opstijgen. Resuspendeer de pellet cel in 500 µL celsuspensie van AGTP reagens en overdracht in een reactiebuis van 2 mL. Incubeer gedurende 5 min op RT.
      3. Voeg 100 µL van chloroform en schud krachtig voor 15 s. Incubate gedurende 3 minuten op RT.
      4. Centrifuge schorsing gedurende 15 minuten staan bij 12.000 x g bij 4 ° C.
      5. Uittrekken van de bovenste waterfase (met RNA) zorgvuldig en breng kwantitatief over in een 1,5 mL reactiebuis. Voeg 250 µL van isopropanol en incubeer gedurende 10 min op RT.
      6. Uitvoeren van een stap centrifugeren op 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
      7. Opstijgen het supernatant en voeg 1 mL ethanol 75% zorgvuldig. Centrifugeer bij 7.500 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
        Opmerking: Pellet is gemakkelijk te verliezen.
      8. Verwijder het supernatant volledig. Laat de pellet op lucht gedurende 5-10 min. drogen.
        Opmerking: ethanol moet worden verwijderd maar niet te veel te droog.
      9. Los van de pellet in 30 µL diethylpyrocarbonate behandeld water bevat en warmte gedurende 10 minuten bij 55 ° C.
        Opmerking: RNA concentratie en zuiverheid kunnen worden gemeten door een spectrale-fotometer.
    2. CDNA synthese (reverse-transcriptase PCR) uitvoeren.
      1. Bereiden een mastermix met: 10 µL van het PCR buffer (5 x), 2,5 µL desoxyribonucleosid-trifosfaat (dNTP (10 mM)), 0,5 µL willekeurige mengsel van single-stranded primer (0,2 µg / µL), 1 µL van RNase remmer (40 U / µL, 0.4 reverse transcriptase (200 U/µL) en 5,6 µL van diethylpyrocarbonat behandeld water (zie bijgevoegd tabel van materialen).
      2. Verdun 500 ng RNA in 30 µL diethylpyrocarbonate behandeld water in 0,2 mL PCR buizen en de hele 20 µL mastermix toe te voegen.
      3. Gebruik van een PCR-cycler uitvoeren van stappen te volgen: 10 min 25 ° C, 30 min 50 ° C, 5 min 85 ° C en houd bij 4 ° C.
  4. Het uitvoeren van kwantitatieve PCR (qPCR).
    Opmerking: QPCR van monsters in dubbele of triplicates uitvoeren.
  5. Primer gebruiken met twee verschillende fluorescentie kleurstoffen. Primer met een opname van 495 nm en een uitstoot van 517 nm voor het gen van belang.
  6. Voor de detectie van de satelliet cel marker genexpressie, inleidingen voor gekoppelde vak eiwit 7 (Pax7) en M-cadherine (Cdh15) te gebruiken (Zie Tabel van materialeningesloten).
  7. Voor de detectie van de genexpressie van endothelial cel marker, inleidingen voor claudin-5 (Cld5), occludin (Ocln) en de zonula occludens-1 (Tjp1 of ZO1) te gebruiken (zie bijgevoegd tabel van materialen).
  8. Als referentie gen voor 18s rRNA, gebruik een primer met absorptie van 538 nm en een uitstoot van 554 nm golflengte.
  9. Een qPCR mastermix voorbereiden op elk gen van belang met de respectieve primer. Mastermix bevat: 10µl qPCR buffer (2 x), 1 µL van Primer voor gen van belang (10 µM), 1 µL van Primer voor 18s rRNA en 4 µL van nuclease gratis water.
  10. Voeg 16 µL van de mastermix bij een enkele bron van een reactie van de 96-wells-plaat. Voeg 4 µL van cDNA (verkregen uit stap 5.3.2.) per putje met de mastermix.
  11. Gebruik van een real-time PCR-cycler uitvoeren van stappen te volgen: houden van de fase met 50 ° C gedurende 2 minuten en 95 ° C gedurende 10 minuten fietsen fase met 40 cycli van 95 ° C 15 s en 60 ° C voor 1 min.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een dag na isolatie, primaire lymfkliertest MMEC en resterende andere cellen vormen van conglomeraten en zich houden aan de onderkant van cultuur gerechten (figuur 1A dag 1). Vanaf dag 7, kunnen plat en langgerekte cellen worden waargenomen. Besmetting van andere, meestal sferoïde cellen, is echter nog steeds zichtbaar (figuur 1A dag 7). Dus, een andere cyclus van CD31 positieve selectie via MCS is vereist. Hierna, prima...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Microvasculaire endotheliale cellen bieden barrière functies in alle weefsels en hun resultaten van de disfunctie bij ziekte van de bijbehorende organen 3. Bovendien, orgel-specifieke studies van microvasculaire EG kunnen de weg vrijmaken voor nieuwe therapeutische strategieën. Daarom is een dieper begrip van microvasculaire EG functie onder fysiologische en pathofysiologische omstandigheden van wetenschappelijke belangstelling. Modulatie van leukocyten/endotheel interactie is met succes gebruikt ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door de "anders Kröner-Fresenius-Stiftung" (2018_A03 aan TR), "Innovatieve Medizinische Forschung (IMF) Münster" (I-RU211811 aan TR) en Duitse Research Foundation (DFG INST 2105/27-1, ME 3283/5-1 en ME 3283/6-1 tot SGM). Geïllustreerde knopvlakken door Heike Blum.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.25% Trypsin-EDTAThermo Fisher25200-056klaar voor gebruik
ACK buffer150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water bij een pH van 7,3
Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3)Biolegend102506Isotype controle: FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl
Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11)Biolegend103106Isotype controle: PE Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl
bFGFPeprotech100-18BBasic fibroblast growth factor
BSASigma AldrichA4503
CD31 MicroBeads muisMiltenyi Biotec130-097-418
CD45 MicroBeads muisMiltenyi Biotec130-052-301
Collagenase-DispaseRoche10269638001Collagenase van V. alginolyticus, Dispase van B. polymyxa
Corning Costar TC-behandelde meervoudige 6-well platenCorning3516
Cy3-geconjugeerd anti-rat IgG-antilichaamdianova712-166-153
DAPI (ProLong Gold antifade reagens met DAPI)Thermo FisherP36935
DesoxyribonucleaseSigma AldrichD4513Deoxyribonuclease I uit bovien pancreas
Diethylpyrocarbonaat behandeld waterThermo FisherAM9916
DMEM, met Glutamine Supplement en pyruvaatThermo Fisher31966-021opwarmen tot 37 °C voor gebruik
dNTP Mix (10 mM)Thermo FisherR01921 mL
EDTASigma AldrichE5134
FACS buizenSarstedt551,579
Falcon 70 μm Cell StrainerCorning352350
FC buffer0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA
Fetaal kalfs serumSigma AldrichF6178Fetaal kalfs serum
Fixable Viability Dye eFluor780Thermo Fisher65-0865-14
Forceps (gekarteld, recht, 12 cm)Fine Science Tools11002-12
Forceps (gekarteld, recht, 12 cm)Fine Science Tools11009-13
Insulin spuit 100 Solo 1 mL (Omnifix)Braun9161708V
grote magnetische kolommen (LS kolommen)Miltenyi Biotec130-042-401voor CD45-MACS-stap
MCS buffer0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS bij een pH van 7,2
Medium magnetische kolom (MS kolom)Miltenyi Biotec130-042-201voor CD31-MACS-stap
Nuclease vrij waterThermo FisherR0581
PBSSigma AldrichFosfaat gebufferde zoutoplossing, klaar voor gebruik
PCR buffer (5x)Thermo FisherEP0742in een kit met de reverse transcriptase
Pecam1 rat α-muisSantaCruzSc-52713100 µg/mL
Penicilline-StreptomycineSigma AldrichP4333
primaire murine spiercellencelprogen66066-01
Primer Cdh15 (M-Cadherin)Thermo FisherMm00483191_m1FAM gelabeld
Primer Cldn5 (claudin-5)Thermo FisherMm00727012_s1FAM gelabeld
Primer Ocln (occludin)Thermo FisherMm00500912_m1FAM gelabeld
Primer Pax-7Thermo FisherMm01354484_m1FAM gelabeld
Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1)Thermo FisherMm00493699_m1FAM gelabeld
Primer 18s rRNA (Eukaryotisch endogene controle)Thermo Fisher4310893EVIC gelabeld
qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X)Thermo FisherK02312 x 1,25 mL; voor ieder 200 reacties
Willekeurige mix van enkelstrengse primerThermo FisherSO142Random Hexamer Primer
Reverse Transcriptase (200 U/μL) + PCR buffer (5x)Thermo FisherEP0742
Rnase Inhibitor (40 U/μL)Thermo FisherEO0381
Schaar (snijdende rand 23 mm, scherp/scherp)Fine Science Tools14088-10
Schaar (snijdende rand 42 mm, scherp/blunt)Fine Science Tools14001-13
Speed Coating oplossingPeloBiotechPB-LU-000-0002-00

Referenties

  1. Rodrigues, S. F., Granger, D. N. Blood cells and endothelial barrier function. Tissue Barriers. 3 (1-2), e978720(2015).
  2. Michiels, C. Endothelial cell functions. Journal of Cellular Physiology. 196 (3), 430-443 (2003).
  3. Pierce, R. W., Giuliano, J. S. Jr, Pober, J. S. Endothelial cell function and dysfunction in critically ill children. Pediatrics. 140 (1), Epub 2017 Jun 1 (2017).
  4. Nasdala, I., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H., et al. A transmembrane tight junction protein selectively expressed on endothelial cells and platelets. Journal of Biological Chemistry. 277 (18), 16294-16303 (2002).
  5. Sano, H., Sano, Y., Ishiguchi, E., et al. Establishment of a new conditionally immortalized human skeletal muscle microvascular endothelial cell line. Journal of Cellular Physiology. 232 (12), 3286-3295 (2017).
  6. Kappos, L., Bates, D., Edan, G., et al. Natalizumab treatment for multiple sclerosis: Updated recommendations for patient selection and monitoring. Lancet Neurology. 10 (8), 745-758 (2011).
  7. Birbrair, A., Zhang, T., Wang, Z. M., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).
  8. Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (93), e52204(2014).
  9. Hwang, I., An, B. S., Yang, H., Kang, H. S., Jung, E. M., Jeung, E. B. Tissue-specific expression of occludin, zona occludens-1, and junction adhesion molecule A in the duodenum, ileum, colon, kidney, liver, lung, brain, and skeletal muscle of C57BL mice. Journal of Physiology and Pharmacology. 64 (1), 11-18 (2013).
  10. Frye, C. A., Patrick, C. W. Jr Isolation and culture of rat microvascular endothelial cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 38 (4), 208-212 (2002).
  11. Le, G. Y., Essackjee, H. C., Ballard, H. J. Intracellular adenosine formation and release by freshly-isolated vascular endothelial cells from rat skeletal muscle: Effects of hypoxia and/or acidosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 450 (1), 93-98 (2014).
  12. Cheung, K. C., Marelli-Berg, F. M. Isolation of microvascular endothelial cells. Bio-protocol. 8 (12), (2018).
  13. Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential. PLoS One. 3 (3), e0001753(2008).
  14. Pham, M. T., Pollock, K. M., Rose, M. D., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Primaire muizen MMECskeletspier endotheelcellenmechanische enzymatische dissociatiemagnetische cel sorteringCD31 positieve selectieCD45 negatieve depletieendotheelcelkweekflowcytometrie analysemarkers voor spierstamblo cellen
Isolatie van primaire lymfkliertest skeletspieren microvasculaire endotheliale cellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.