Bepaling van de waarschijnlijkheid van Variant pathogeniteit met behulp van aminozuur-niveau Signal-to-Noise analyse van genetische variatie

Summary

Aminozuur-niveau signal-to-noise analyse bepaalt de prevalentie van genetische variatie op de positie van een bepaald aminozuur genormaliseerd naar de genetische variatie van de achtergrond van een bepaalde populatie. Dit zorgt voor de identificatie van de variant "hotspots" binnen een eiwit-reeks (signaal) die stijgt tot boven de frequentie van de zeldzame varianten gevonden in een populatie (lawaai).

Abstract

Vooruitgang in de kosten en de snelheid van de volgende generatie genetische sequentie hebben gegenereerd een explosie van klinische hele exome en het hele genoom testen. Terwijl dit heeft geleid tot meer identificatie van waarschijnlijk pathogene mutaties genetische syndromen is gekoppeld, is het ook sterk toegenomen het aantal overigens gevonden genetische varianten van onbekende betekenis (VUS). Het bepalen van de klinische betekenis van deze varianten is een grote uitdaging voor zowel wetenschappers en clinici. Signal-to-noise analyses op het niveau van de reeks eiwit is een aanpak om te helpen bij het bepalen van de waarschijnlijkheid van pathogeniteit. Dit protocol beschrijft een methode voor de analyse van aminozuur-niveau signal-to-noise die variant frequentie op de positie van elk aminozuur van het eiwit met bekende eiwit topologie hefboomwerkingen te identificeren van de gebieden van de primaire reeks met verhoogde kans op pathologische variatie (ten opzichte van de bevolking "achtergrond" variatie). Deze methode kan het identificeren van aminozuur residu locatie "hotspots" van hoge pathologische signaal, dat kan worden gebruikt voor het verfijnen van de diagnostische gewicht van VUSs zoals die welke door de volgende generatie genetische tests.

Introduction

De snelle verbetering van de genetische sequentie platformen heeft hervormd de toegankelijkheid en de rol van genetica in de geneeskunde. Zodra beperkt tot een enkel gen of een handvol genen, de afname van de kosten en verhoging van de snelheid van de volgende generatie genetische sequentie heeft geleid routine sequentiebepaling van het geheel van het genoom sequentie (hele exome sequencing, WES) de codering en de gehele genoom ( hele genoom sequencing, WGS) in de klinische setting. WES en WGS zijn gebruikt vaak in de omgeving van ernstig zieke pasgeborenen en kinderen met bezorgdheid voor genetische syndroom waar het is een bewezen diagnostisch instrument dat van klinische behandeling^{1,2 veranderen kan}. Terwijl dit heeft geleid tot meer identificatie van waarschijnlijk pathogene mutaties genetische syndromen is gekoppeld, is het ook sterk toegenomen het aantal overigens gevonden genetische varianten, of onverwachte positieve resultaten, van onbekende diagnose betekenis (VUS). Terwijl sommige van deze varianten zijn buiten beschouwing gelaten en niet gemeld, varianten lokaliseren naar worden genen geassocieerd met potentieel dodelijk of zeer morbide aandoeningen vaak gerapporteerd. Huidige richtsnoeren aanbevelen rapportage van incidentele varianten gevonden in specifieke genen die van medisch nut aan de patiënt, met inbegrip van genen in verband met de ontwikkeling van plotselinge dood-predisponerende hartziekten zoals hartziekten kunnen zijn en channelopathies³. Hoewel deze aanbeveling was ontworpen om personen in gevaar van een ziekte SCD-predisponerende vangen, de gevoeligheid van variant detectie veel groter is dan specificiteit. Dit komt tot uiting in een groeiend aantal VUSs en overigens geïdentificeerd varianten met onduidelijk diagnostisch hulpprogramma die veel verder gaan dan de frequentie van de respectieve ziekten in een bepaalde bevolking⁴. Een dergelijke ziekte, lang QT syndroom (LQTS), is een canonieke cardiale channelopathy veroorzaakt door mutaties lokaliseren aan genen die cardiale ionenkanalen coderen, of kanaal interactie van eiwitten, resulterend in vertraagd cardiale repolarisatie⁵. Deze vertraagde repolarisatie, gezien door een verlengde QT-interval op rusten elektrocardiogram, resulteert in een elektrische aanleg voor potentieel dodelijke Ventriculaire ritmestoornissen zoals torsades de pointes kunnen teweegbrengen. Terwijl een aantal genen zijn gekoppeld aan de ontwikkeling van deze ziekte, mutaties in KCNQ1-ik_Ks kalium gecodeerd kanaal (KCNQ1, Kv7.1) is de oorzaak van LQTS type 1 en wordt gebruikt als een voorbeeld minder dan⁶. Ter illustratie van de complexiteit van variant interpretatie, is de aanwezigheid van zeldzame varianten in LQTS-geassocieerde genen, zogenaamde "achtergrond genetische variatie" eerder beschreven^7,8.

Naast grote compendium-stijl databases van bekende pathogene varianten bestaan verschillende strategieën voor het voorspellen van dat de verschillende varianten van effect zal produceren. Sommige zijn gebaseerd op algoritmen, zoals SIFT en Polyphen 2, waarin grote aantallen roman niet-synoniem varianten om te voorspellen deleteriousness^9,10kunt filteren. Ondanks breed gebruik van deze hulpprogramma's beperkt lage specificiteit hun toepasbaarheid als het gaat om "calling" klinische VUSs¹¹. 'Signal-to-noise'-analyse is een hulpprogramma waarmee u de waarschijnlijkheid van een variant die wordt geassocieerd met de ziekte op basis van de frequentie van de bekende pathologische variatie op de betrokken loci genormaliseerd tegen zeldzame genetische variatie uit een populatie. Varianten aan genetische loci lokaliseren waar sprake is van een hoge prevalentie van de ziekte-geassocieerde mutaties ten opzichte van bevolking gebaseerde variatie, een hoge signaal-ruis, hebben meer kans op ziekte-geassocieerde zichzelf zijn. Verdere, zeldzame varianten vond overigens lokaliseren naar een gen met een hoge frequentie van de zeldzame bevolking varianten vergeleken met ziekte-geassocieerde frequentie, een lage signal-to-noise, wellicht minder waarschijnlijk worden ziekte-geassocieerde. Het diagnostische hulpprogramma van signal-to-noise analyse heeft geïllustreerd in de meest recente richtsnoeren voor genetische tests voor hartziekten en channelopathies; echter, het is alleen werkzaam zijn op het niveau van de hele gen of domeinspecifieke niveau¹². Onlangs, gegeven toegenomen beschikbaarheid van zowel de pathologische varianten (ziekte databases, cohortstudies in de literatuur) en de bevolking gebaseerde controle varianten (Exome aggregatie Consortium, ExAC en de aggregatie genoomdatabase, GnomAD¹³), Dit is vereffend met de standpunten van de individuele aminozuur binnen de primaire volgorde van een eiwit. Analyse van de signal-to-noise aminozuur-niveau is nuttig bij het categoriseren van overigens geïdentificeerde varianten in genen LQTS als waarschijnlijk "achtergrond" genetische variatie zijn gekoppeld in plaats van het ziekte-geassocieerde gebleken. Onder de drie belangrijke genen geassocieerd met LQTS, met inbegrip van KCNQ1, ontbrak deze overigens geïdentificeerde varianten een significante signal-to-noise ratio's, wat suggereert dat de frequentie van deze varianten op individuele aminozuur posities zeldzame weerspiegelen variatie van de bevolking in plaats van ziekte-geassocieerde mutaties. Bovendien, wanneer eiwit-specifieke domeintopologie was bedekt tegen gebieden van hoge signal-to-noise, pathologische mutatie "hotspots" gelokaliseerd op belangrijke functionele domeinen van de proteïnen¹⁴. Deze methode houdt belofte in bepalen dat 1) de kans op een variant is ziekte - of bevolking-geassocieerde en 2) het identificeren van nieuwe kritieke functionele domeinen van een eiwit ziekten bij de mens is gekoppeld.

Protocol

1. Identificeer de Gene en specifieke Splice isovorm van belang

Opmerking: Hier, wij tonen het gebruik van Ensembl¹⁵ te identificeren van de volgorde van de consensus voor het gen van belang die gekoppeld aan de pathogenese van de ziekte van belang is (d.w.z. KCNQ1 mutaties zijn geassocieerd met LQTS). Alternatieven voor Ensembl omvatten RefSeq via het nationaal centrum voor biotechnologische informatie (NCBI)¹⁶ en de University of California, Santa Cruz (UCSC) menselijke genoom Browser¹⁷ (Zie Tabel van materialen).

1. Selecteer de soorten (dat wil zeggen menselijke) in het dropdownmenu in de Ensembl homepage, en het gen van belang acroniem invoert in het veld (d.w.z. KCNQ1). Klik op "Go"
2. Selecteer de koppeling die overeenkomt met het gen van belang (d.w.z. "KCNQ1 (menselijk gen)"
3. Selecteer de koppeling die overeenkomt met het transcript van belang ID van belang van de "Transcript tabel" (dat wil zeggen TranscriptID ENST00000155840.10, NM_000218 [RNA transcript], NP_000209 [eiwit product van RNA transcriptie]).
   Opmerking: Overzicht van de relevante literatuur is nodig om ervoor te zorgen dat de juiste transcript consensus volgorde is geselecteerd.
4. Opmerking het transcript-specifieke NM en NP identificatienummers voor toekomstige verwijzing gevonden in de kolom "RefSeq" van de "Transcript tafel".
5. Selecteer de koppeling die de NP-ID-nummer een webpagina te openen nieuwe uit de NCBI eiwit-database is gekoppeld.
6. Scroll naar beneden naar de sectie "Oorsprong" te verkrijgen van de (primaire) volgorde van de eiwitten voor het transcript van de gen van belang.
7. Scroll tot de "Functies" sectie om te verkrijgen van een lijst van de functies van het eiwit (functionele domeinen, bindende domeinen, posttranslationele wijziging sites).
   Opmerking: Deze informatie kan ook worden verkregen via de NCBI eiwit-database of uit primaire bronnen in de literatuur. Dit zal verder worden besproken in stap 5.

2. Maak de experimentele genetische Variant Database (de "signaal")

Opmerking: Hier, we laten zien hoe het maken van een database van ziekte-geassocieerde varianten in het gen van belang met de frequentie van de ziekte-geassocieerde varianten onder personen met de ziekte van belang. Deze database kan vele vormen aannemen en vertegenwoordigt het "signaal" (fenotype-positieve genetische variatie) die tegen de controle variant database zal worden genormaliseerd. Dit kan omvatten 1) ziekte-geassocieerde varianten voor vergelijking tegen VUSs te identificeren van nieuwe functionele domeinen van de eiwitten en/of 2) VUSs, met inbegrip overigens geïdentificeerd VUSs, om te vergelijken tegen ziekte-geassocieerde varianten om de kans op pathogeniteit. Ziekte-geassocieerde varianten in KCNQ1 zullen worden gepresenteerd ter illustratie; de methode is echter het zelfde voor analyse van overigens geïdentificeerd VUSs of een andere set van experimentele varianten.

1. Cohort(s) van niet-verwante index gevallen/probands identificeren met de ziekte van belang waarvoor het gen van belang uitgebreid gegenotypeerde voor alle probands was (dat wil zeggen een studie identificeert 24 onafhankelijke probands hosting varianten in KCNQ1 uit 200 personen met LQTS die werden onderworpen aan genetische ondervraging van KCNQ1).
   Opmerking: Deze cohorten kunnen worden geïdentificeerd van de literatuur, van experimentele genetische analyse, of een combinatie van beide.
   1. Studies die niet cohort gebaseerde uitsluiten (dat wil zeggen een gevallenrapport beschrijven een enkele mutatie-positieve persoon), bieden niet het totale aantal personen gegenotypeerde voor het gen van belang of de gene (uitgebreid genetisch niet doen analyseren dat wil zeggen een "gerichte" genetische screening van alleen KCNQ1 exons 2-4) dit beletsel voor berekening van de frequentie van een variant.
   2. Opnemen van individuen die niet-verwante probands en verwante personen uit te sluiten als dit variant frequenties overschatten kan (dat wil zeggen een studie identificeert 4 onafhankelijke individuen met KCNQ1 mutaties in een cohort van 20 patiënten met LQTS. Een van deze probands is onderdeel van een gezin met 5 andere mutatie-positieve verwanten. Uitsluiten van alle gezinsleden en bevatten alleen de 4 onafhankelijke probands).
2. Compileren van alle experimentele genetische varianten gevonden in geïdentificeerde cohort(s)
   1. Toewijzen nomenclatuur waarin de wild-type amino acid, aminozuur positie en variant aminozuur (d.w.z. alanine op aminozuur nummer 212 veranderd naar valine, Ala212Val of A212V). Een dergelijk type van nomenclatuur wordt geïllustreerd in Figuur 1.
   2. Bevestigen dat variant nomenclatuur van alle experimentele genetische varianten is gebaseerd op de dezelfde referentie gene afschrift als aangegeven in stap 1.4. Als experimentele genetische varianten zijn niet op de dezelfde referentie gene transcript geannoteerd, vervolgens reannotate variant kunnen een afschrift van de verwijzing transcript alignering gebruiken (zie stap 1.2)
3. Uitsluiten varianten die zijn niet van toepassing zijn afhankelijk van de vraag onderzocht.
   1. Uitsluiten varianten lokaliseren naar niet-codeert gebieden van het genoom- of varianten die niets aan het eiwit veranderen sequentie zoals synoniem, intronic varianten, 5' of 3' niet-vertaalde regio [UTR] en intergenic regio varianten (dat wil zeggen een gerapporteerde pathologische variant in KCNQ1 die op de 5 lokaliseert ' UTR codering regio zou worden uitgesloten als er niet wordt voorspeld te wijzigen van de volgorde van eiwitten).
   2. Uitsluiten varianten die niet voldoen aan de opgenomen criteria voor de studie. Voor ziekte-geassocieerde varianten omvat dit varianten die niet langer worden geacht pathologische.
      1. Bevestigen dat elke variant wordt momenteel beschouwd als pathogene, waarschijnlijk pathogene, of op zijn minst niet goedaardig, door kruisverwijzingen varianten met de ClinVar database (Zie Tabel van materialen).
      2. De gen en de variant van belang invoeren in het zoekveld (d.w.z. KCNQ1-Y111C) ClinVar, selecteer "Zoeken"
      3. Identificatie van de variant van belang onder de kolom ' Variatie/locatie'.
      4. Opmerking de interpretatie van de consensus van pathogeniteit onder "Klinische betekenis" kolom (d.w.z. KCNQ1-Y111C wordt geïnterpreteerd als "pathogene").
      5. Varianten die omvatten "waarschijnlijk pathogene" of "pathogene".
      6. Varianten met oorsprongsbenamingen "conflicting interpretations of pathogeniteit," opnemen "onzekere betekenis," of wanneer geen record beschikbaar is ('niet geleverd') als gerechtvaardigd door de studie.
      7. Uitsluiten van varianten uitgeroepen tot "waarschijnlijk benigne" (d.w.z. KCNQ1-A62T).
4. Bereken de frequentie van de kleine allel (MAF) van elke experimentele variant positie.
   1. Berekenen hoe een allelen waren positief voor elke respectieve variant (dat wil zeggen als een KCNQ1-Y111C heterozygote mutatie voor bij 2 onafhankelijke personen, het aantal variant-positieve allelen komt 2).
   2. Berekenen van het totale aantal allelen sequenced binnen de cohort
      1. Let op het totale aantal individuen sequenced in elk cohortstudie (stap 2.1)
      2. Het totale aantal personen vermenigvuldigt met 2 om te bepalen van het totale aantal allelen.
         Opmerking: Veronderstelt dit diploïde genomen waarbij elke afzonderlijke hosts 2 van elk allel.
   3. Bereken het totale aantal variant-positieve individuen voor elke aminozuur positie (allelen in stap 2.4.1/alleles in stap 2.4.2). Bijvoorbeeld, als 2 onafhankelijke personen elke host heterozygoot KCNQ1-Y111C-mutaties in cohorten van 100 en 200 LQTS getroffen individuen, respectievelijk, is de frequentie van de experimentele varianten op aminozuur positie 111 2 varianten/((100+200 individuals ) * 2 allelen/individu) (d.w.z. gecombineerd MAF 0.0033).
   4. Deze waarde berekend voor elke variant als de respectieve MAF van elke experimentele variant. Zie voor meer informatie stap 4.2.

3. Maak de genetische Variant Database controle (het "lawaai")

Opmerking: Hier, we laten zien hoe een database te maken voor controle varianten in het gen van belangstelling voor de bevolking van een besturingselement met een bijbehorende frequentie. Deze database vertegenwoordigt het "lawaai" (fenotype-negatief, bevolking gebaseerde genetische variatie) dat is de achtergrond waartegen de experimentele variant database zal worden genormaliseerd. Dit wordt aangeduid als "control" variatie.

1. Identificeren van een cohort(s) van gezonde, niet-verwante probands of gebruiken van grote bevolking gebaseerde studies ter identificatie van zeldzame varianten onder een bepaalde bevolking.
   Opmerking: Bronnen voor deze database zijn divers en omvatten: 1) gezonde individuen en/of anders fenotype-negatieve personen onderworpen aan Sanger sequencing of beursgenoteerde databases van bevolking gebaseerde personen waarvoor de betrokken ziekte is zeldzaam in frequentie zoals 2) 1000 Genome Project (N = 1,094 onderwerpen)¹⁸, 3) nationale hart-, Long- en bloed Instituut gaan Exome Sequencing Project (ESP, N = 5,379 onderwerpen)¹⁹, 4) Exome aggregatie Consortium (ExAC, N = 60,706 onderwerpen)¹³ , en/of 5) genoomdatabase aggregatie (GnomAD, N = 138,632 personen)¹³ (Zie Tabel van materialen). De GnomAD database zal worden gebruikt als een illustratief voorbeeld.
   1. Voer het gen van belang in het zoekvak op de startpagina van de GnomAD (d.w.z. KCNQ1).
   2. Zorg ervoor dat de browser de juiste gen en afschrift van belang (stap 1.4) geselecteerd.
   3. Controleer of er passende dekking van sequencing van de locus door herziening van de "gemiddelde dekking" en "dekking plot."
   4. Selecteer voor codering van genetische variatie van de reeks door het selecteren van "Missense + LoF."
   5. Selecteer "tabel exporteren naar CSV," die een teksteditor-bestand genereren zal met de naam 'Unknown'.
   6. Het bestand hernoemen en omvatten een nieuwe extensie "*.csv" (d.w.z. "KCNQ1 controle Variation.csv").
   7. Open het bestand met behulp van een geschikte softwareprogramma voor analyse van *.csv bestanden (Zie Tabel van materialen).
2. Identificeren van het eiwit veranderen van de genetische variatie in de kolom met de naam "Eiwit gevolg."
3. Gelden dezelfde uitsluitingscriteria de genetische varianten van deze controle als de experimentele genetische varianten (stap 2.3.1).
4. Identificeren van het MAF van elke controle-variant.
   1. Zoek de kolom "-allel Count", die duidt op het aantal allelen gevonden aan de haven van de variant.
   2. Zoek de kolom "-allel nummer", waarmee het totale aantal allelen sequenced op dit amino zuur positie krijgen.
      Opmerking: Het totale aantal allelen sequenced zal variëren afhankelijk van de dekking op die locatie. Gebieden van hoge dekking zal aanpak 2 * totaal aantal individuen binnen GnomAD (dat wil zeggen voor 138,632 personen, volledige dekking omvat 277,264 totale allelen gegenotypeerde).  Omgekeerd, gebieden van de lagere dekking zal hebben enkele verminderde totale allel
   3. Zoek de variant MAF die vooraf wordt berekend in de kolom "-allel frequentie" en vertegenwoordigt "-allel Count" gedeeld door "Allel nummer."
      Opmerking: Menselijk genoom hebben twee van elk allel (d.w.z. 1 onderwerp gevonden te hebben van een heterozygoot variant in 10 mensen heeft een MAF van 1/20)
   4. Opmerking het MAF voor elke variant als de respectieve MAF van elke controle-variant.
      Opmerking: De specifieke MAF Variant voor elke raciaal/etnisch-groep bestaande uit GnomAD kan worden gezien in de kolommen rechts van "Allel frequentie."
5. Toepassing van de drempel van een MAF voor zeldzame varianten waarboven controle varianten zijn uitgesloten als "gemeenschappelijk."
   1. De MAF-drempel ingesteld op de maximale waarde waartegen alle echt ziekte-geassocieerde varianten (zie stap 2) ook waargenomen in de controle-database onder de drempel zijn opgenomen (dat wil zeggen, onder alle ziekte-geassocieerde KCNQ1 varianten ook gevonden in GnomAD de hoogste gemeenschappelijke variant MAF is 0.009, dan alle varianten van de GnomAD boven een drempel van 0,01 dienen te worden uitgesloten).
6. Zorgen dat de experimentele variant nomenclatuur identiek aan controle is (zie stap 2.2).
7. Sla het bestand. In sommige gevallen hiervoor kunnen wijzigen van de type/bestandsextensie.

4. aminozuur niveau Signal-to-noise berekening en toewijzing

1. Een MAF voor elke positie aminozuur met een variant van het besturingselement te berekenen (Zie Figuur 1 met voorbeeld KCNQ1 GnomAD varianten).
   1. In een werkblad graphing-staat een kolom van de standpunten van alle experimentele varianten te maken.
   2. Variant tekst te laten alleen de variant positie verwijderen.
      Opmerking: Verschillende functies/formules kunnen worden gebruikt om automatisch verwijderen van deze tekstelementen binnen cellen (Figuur 1, kolom C; Zie Tabel van materialen).
   3. Sorteren van de varianten in oplopende waarde te identificeren die posities meer dan 1 variant gekoppeld (Figuur 1, kolom E hebben; dat wil zeggen aminozuur positie 10 is tweemaal vermeld in kolom E waarmee de 2 unieke varianten op de positie).
   4. Combineer het MAF voor elke variant die is gekoppeld aan een bepaalde positie door middel van de som van alle MAFs voor een bepaalde positie (Figuur 1, kolom G en H).
2. Berekenen van een MAF voor elke positie aminozuur met een experimentele variant (Zie Figuur 2 met mock KCNQ1 pathologische varianten).
   1. Op een gelijkaardige manier aan 4.1.1, een kolom voor aminozuur posities hebben experimentele varianten (Figuur 2, kolom B) te maken.
   2. Voor elke variant positie, berekenen het MAF voor alle varianten die zijn gekoppeld aan dit standpunt uit stap 2.4 (Figuur 2, kolom C-G).
3. Maak een rolling gemiddelde van MAF voor beide experimentele- en controle varianten.
   1. Vouw de kolommen gemaakt in 4.1 en 4.2 cellen voor aminozuur posities hebben geen variant als een MAF = 0. (Figuur 3).
      1. Maak een kolom met alle aminozuur posities in het gen van belang (d.w.z. 1 naar 676 voor KCNQ1, Figuur 3, kolom C en ik).
      2. Een MAF voor 0 voor alle posities die geen varianten voor zowel controle en experimentele gegevenssets toevoegen.
         Opmerking: Dit kan worden gedaan automatisch met behulp van de functie "Vert.zoeken" in een algemeen gebruikte softwareprogramma (Figuur 3, kolom D en J, Zie Tabel van materialen).
   2. Maak een rolling gemiddelde voor elk experimenteel en controle prevalentie kolom.
      Opmerking: Dit zorgt voor afleiding van aangrenzende positie pathogeniteit en kan worden gewijzigd of zelfs uitgesloten, om te voldoen aan de eisen van de studie.
      1. Maak een kolom vertegenwoordigt een voortschrijdend gemiddelde van het MAF voor zowel de voor zowel het besturingselement als experimentele data sets (Figuur 3, kolom E en K).
      2. In het voortschrijdend gemiddelde kolom, plaatst u het gemiddelde van de respectieve MAF voor de 5 variant posities N-terminal en 5 variant posities C-terminal naar de opgegeven positie.
         Opmerking: Dit maakt rolling gemiddelde van +/-5. Voor posities met minder dan 5 aminozuurresidu's van voorgaande of volgende, een voortschrijdend gemiddelde locatie (dat wil zeggen de N - of C-terminus), het voortschrijdend gemiddelde zal alleen rekening houden met de residuen die aanwezig zijn (dat wil zeggen het rollen gemiddelde op aminozuur positie 3 zal zijn een gemiddelde van het MAF op aminozuur posities 1 maar 8, berekend als de som van deze MAFs gedeeld door 8).
4. De minimale controle-frequentie berekenen door de laagste rollende MAF delen door 2.
   1. Een cel met een besturingselement MAF van 0 naar de minimale frequentie om te voorkomen dat delen door 0 bij het berekenen van een signal-to-noise verhouding wijzigen
5. Bereken het aminozuur niveau signal-to-noise verhouding (Figuur 4).
   1. Verdeel elke experimentele rollen gemiddelde door de respectieve controle rollen gemiddelde aminozuur-positie.
   2. Grafiek van deze verhouding (y-as) vs. aminozuur positie (x-as).

5. eiwitten domein topologie Overlay

1. Het identificeren van de consensus aminozuur locaties van functionele domeinen/kenmerken, of gebieden van posttranslationele modificatie, van de proteïne van belang (stap 1.7).
   Opmerking: Een aantal van de middelen kan worden gebruikt om het identificeren van deze domeinen. Deze middelen, alsmede de middelen voor de identificatie van de vermeende domeinen in nieuwe eiwitten, zijn goed onderzocht in de literatuur²⁰. Dit protocol beschrijft de eiwit-database beschikbaar via NCBI, die algemeen wordt gebruikt en robuust (Zie Tabel van materialen).
2. Identificeren aminozuur standpunten met betrekking tot eiwit domeinen/functies.
   1. Open de NCBI-webpagina.
   2. Voer de NP van de proteïne van belang in het zoekveld.
   3. Identificeren van bekende eiwit domeinen en functies zijn catalogi onder 'Functies'.
   4. Identificeren en Let op de posities van het domein naam/type en aminozuur.
   5. Selecteer de koppeling die overeenkomt met de functie voor het visualiseren van de regio op de proteïne van belang primaire volgorde.
3. Maak een kolom met de grenzen van de domeinen/functies.
   1. Een kolom naast de kolom signaal: lawaai maken, zodat de kolom aminozuur positie kan worden verwezen (Figuur 5A, kolom C).
   2. Identificeren van de cellen die overeenkomt op het N-terminaal of C-terminal aspect van elke domein/functie en plaats een 1 in elke cel (dat wil zeggen als het domein van de N-terminal van de S1 transmembraan domein van KCNQ1-aminozuur 122 staat, en het domein C-terminal staat 142, dan een 1 is geplaatst in de rij voor aminozuur positie 122 en 142).
   3. Voor de overlappende domeinen/functies, meerdere domeinen weergeven door het veranderen van de 1 op andere waarden (d.w.z. 1,5, 2, 2.5); Dit kan helpen bij het onderscheiden van domeinen.
4. Een grafiek maken met deze grenzen als een y-as en aminozuur positie op de x-as (Figuur 5B).
5. Bedekken deze grafiek met de grafiek van de signal-to-noise gemaakt in stap 4.4.
6. Identificeren van correlaties tussen bekende eiwit domeinen/functies en de signal-to-noise-analyse.

6. variant Position Overlay

1. Kaart van individuele variant posities voor overlay van grafieken geproduceerd in stap 4.4 en 5.4.
   1. Maak een kolom naast de kolom domein/functie zodanig dat rijen in de kolom met de aminozuur-posities (Figuur 5A, kolom D overeen komt).
   2. Plaats een 1 in elke cel van de toegevoegde rij die correspondeert met een positie met een respectieve variant.
   3. Een grafiek maken met deze kolom als een y-as en aminozuur positie op de x-as (Figuur 5C).
2. Deze grafiek overlay met de signal-to-noise grafiek gemaakt in stap 4.4 en domein grafiek gemaakt in stap 5.4.

Results

Een representatief resultaat voor aminozuur-niveau signaal ruisanalyse voor KCNQ1 is afgebeeld in Figuur 6. In dit voorbeeld, zeldzame varianten geïdentificeerd in de GnomAD cohort (controle cohort), overigens geïdentificeerd WES varianten (experimentele cohort #1), en LQTS geval-geassocieerde varianten geacht waarschijnlijk ziekte-geassocieerde (experimentele cohort #2) worden afgebeeld. Verder, de analyse van de signal-to-noise vergelijken de WES en LQTS co...

Discussion

High-throughput genetische tests beschikt over geavanceerde dramatisch in de toepassing en de beschikbaarheid in het afgelopen decennium. Echter in veel ziekten met gevestigde genetische onderbouwing, zoals hartziekten, uitgebreide testen in geslaagd om diagnostische opbrengst²¹. Verder is er grote onzekerheid over het diagnostische hulpprogramma van vele geïdentificeerde varianten. Dit is gedeeltelijk te wijten aan een groeiend aantal overigens geïdentificeerde zeldzame varianten op WES en WGS, d...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 Genome Project	N/A	www.internationalgenome.org
ClinVar	N/A	www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar
Ensembl Genome Browser	N/A	uswest.ensembl.org/index.html
Excel	Microsoft	office.microsoft.com/excel/	Wordt gebruikt voor alle voorbeeldformules en -functies
Exome Aggregation Consortium	N/A	www.exac.broadinstitute.org
Genome Aggregation Database	N/A	www.gnomad.broadinstitute.org
National Center for Biotechnology Information Domain and Structure Database	N/A	www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/domains-structures/
National Center for Biotechnology Information Gene Database	N/A	www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/
National Center for Biotechnology Information Protein Database	N/A	www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/
National Heart, Lung, and Blood Institute GO Exome Sequencing Project	N/A	www.evs.gs.washington.edu/EVS/
SnapGene	GSL Biotech LCC	www.snapgene.com
University of California, Santa Cruz Human Genome Browser	N/A	www.genome.ucsc.edu