Neurospheres gegroeid als 3D culturen vormen een krachtig hulpmiddel om te studeren glioma biologie. Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van immunohistochemistry met behoud van de 3D structuur van glioma neurospheres via paraffine insluiten. Deze methode kan de karakterisatie van glioma neurosphere eigenschappen zoals stemness en Neurale differentiatie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Evaluatie van Biomarkers in Glioma door Immunohistochemistry op 3D Glioma paraffine-ingebedde Neurosphere culturen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Analyse van de eiwituitdrukking in glioma is relevant voor de verschillende aspecten in de studie van de pathologie. Talrijke proteïnen zijn beschreven als biomarkers met toepassingen in de diagnose, prognose, classificatie, staat van progressie van de tumor en cel differentiatie staat. Deze analyses van biomarkers zijn ook handig voor het karakteriseren van de tumor neurospheres (NS) gegenereerd op basis van glioma patiënten en glioma modellen. Tumor NS bieden een waardevolle in vitro model voor de beoordeling van de verschillende kenmerken van de tumor waaruit ze zijn afgeleid en kan nauwkeuriger spiegel glioma biologie. Hier beschrijven we een gedetailleerde methode om biomarkers in tumor NS te analyseren met behulp van immunohistochemistry (IHC) op paraffine-ingebedde tumor NS.
Inleiding
Gliomas zijn primaire solide tumoren van het centrale zenuwstelsel door hun fenotypische en genotypische kenmerken volgens de World Health Organization1ingedeeld. Deze indeling bevat de aanwezigheid of afwezigheid van bestuurder mutaties, die een aantrekkelijke bron van biomarkers2 vormen. Biomarkers zijn biologische kenmerken die kunnen worden gemeten en geëvalueerd om aan te geven van de normale en pathologische processen, evenals farmacologische reacties op een therapeutische interventie3. Biomarkers kunnen worden opgespoord in de tumor weefsel en cellen afgeleid van glioma, waardoor haar biolo....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Michigan.
1. generatie van Brain Tumor Neurospheres afgeleid van een muismodel
- Vóór de dissectie-procedure, bereiden media van neurale stamcellen (NSC Media: DMEM/F12 met 1 x B27 supplement, 1 x N2 supplement, 1 x normocin en 1 x antibiotica/antimycotic aangevuld met menselijke recombinante EGF en basic-FGF bij concentraties van 20 ng/mL elk). Vullen van een tube 1,5 mL met 300 µL van NSC media en reserveren voor later.
- Selecteer een muis met een grote tumor.
Opmerking: De groo....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
We geanalyseerd om te controleren van de ontwikkeling van de tumor en beoordelen of de tumor de nodig voor het genereren van NS grootte heeft bereikt, de luminescentie uitgestoten door tumoren met bioluminescentie. Hierdoor is de studie van signaaltransductie doelmatigheid in de pups en de progressie van de tumor door het signaal van de luminescentie van luciferase (Figuur 1A en 1B). Wanneer de grootte van de tumor bereikt ee.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In dit artikel, we in detail te beschrijven een veelzijdige en reproduceerbare methode voor het uitvoeren van immunohistochemistry op paraffine-ingebedde glioma NS, die houden van de karakteristieke 3D structuur van tumorcellen in de hersenen in situgroeien. Deze techniek beschikt over de volgende voordelen ten opzichte van cuvetten verguld op glas of kunststof oppervlakken: ik) behoud van de 3D structuur van NS; II) voorkomen van stress van cel dissociatie vóór de analyse van eiwit expressie; III) het blussen v.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door de nationale instituten van gezondheid/National Institute of Neurological Disorders & beroerte (NIH/NINDS) subsidies R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 naar M.G.C.; NIH/NINDS verleent R01-NS076991, R01-NS082311 en R01-NS096756 P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; 1UO1CA224160; de Afdeling Neurochirurgie; De Happy Hearts Leahs M.G.C. en P.R.L.; en RNA biogeneeskunde Grant F046166 aan M.G.C. F.M.M. wordt ondersteund door een F31 NIH/NINDS-F31NS103500. J.P. werd gesteund door een Fulbright-Argentijnse ministerie van sport en onderwijs Fellowship.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Coated microtome blade HP35 | Thermo Scientific | 3150734 | |
| Microtome RM 2135 | Leica | MR2135 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-aldrich | HT501128-4L | |
| Rabbit polyclonal anti-ATRX, | Santa Cruz Biotechnology | sc-15408 | IHC, 1:250 verdunning |
| Rabbit polyclonal anti-Ki-67 | Abcam | Ab15580 | IHC, 1:1000 verdunning |
| Rabbit polyclonal anti-OLIG2 | Millipore | AB9610 | IHC, 1:500 verdunning |
| Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated | Dako | E0432 | IHC, 1:1000 verdunning |
| Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector Laboratories Inc | PK-6100 | |
| BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT | Biocare medical | BDB2004 L/price till 12/18 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | |
| N-27 Supplement | ThermoFisher | A3582801 | |
| Accutase® Cell Detachment Solution | Biolegend | 423201 | |
| AGAROSE LE | GoldBio | A-201-1000 | |
| Genesee Sc. Corporation | Olympus 15 ml | 21-103 | |
| Genesee Sc. Corporation | TC-75 treated Flask | 25-209 | |
| Genesee Sc. Corporation | TC-25 treated Flask | 25-207 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-057 | NS media |
| HBSS | GibcoTM | 14175-103 | balanced salt solution |
| C57BL/6 | Taconic | B6-f | C57BL/6 muis |
Referenties
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropatholica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Hochberg, F. H., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
