Discriminatie van zeven immuun cel deelverzamelingen door twee-fluorescerende Stroom Cytometry

Samenvatting

Hier presenteren we een stroom cytometrische protocol ter identificatie van CD4⁺ en CD8⁺ T cellen en γδ T cellen, B-cellen, NK-cellen, monocyten in perifere bloed met behulp van slechts twee fluorochromes in plaats van zeven. Met deze aanpak, kunnen vijf extra markeringen op de meeste flow cytometers worden opgeslagen.

Samenvatting

Immuun cel karakterisering is sterk afhankelijk van multicolor stroom cytometry te identificeren subpopulaties gebaseerd op differentiële expressie van oppervlakte markers. Setup voor een klassieke multicolor panel vereist high-end instrumenten, aangepaste gelabelde antilichamen en zorgvuldige studie ontwerp om te minimaliseren van spectrale overlap. Ontwikkelden we een multiparametric analyse om te identificeren grote menselijke immuun populaties (CD4⁺ en CD8⁺ T cellen en γδ T cellen, B-cellen, NK-cellen, monocyten) in perifeer bloed door het combineren van zeven lineage markeringen met behulp van slechts twee fluorochromes. Onze strategie is gebaseerd op de observatie dat lineage markeringen voortdurend worden uitgedrukt in een unieke combinatie van elke celpopulatie. Het combineren van deze informatie met een zorgvuldige titratie van de antistoffen kan onderzoekers graag vijf extra markeringen, uitbreiding van de optische limiet van meeste flow cytometers. Head-to-Head comparison is aangetoond dat de overgrote meerderheid van immuun cel populaties in perifeer bloed kan worden gekarakteriseerd met vergelijkbare nauwkeurigheid tussen onze methode en de klassieke "een fluorescerende-een marker benadering", hoewel de laatste nog steeds is nauwkeuriger voor het identificeren van populaties zoals NKT cellen en γδ T cellen. Het combineren van zeven markeringen met behulp van twee fluorochromes zorgt voor de analyse van complexe immuun cel populaties en klinische monsters op betaalbare 6-10 fluorescerende flow cytometers, en zelfs op 2-3 fluorescerende veld instrumenten in gebieden met beperkte middelen. High-end instrumenten kunnen ook profiteren van deze aanpak met behulp van extra fluorochromes om diepere stroom cytometry analyse. Deze aanpak is ook zeer goed geschikt voor het screenen van verschillende cel populaties in het geval van klinische monsters met een beperkt aantal cellen.

Inleiding

Stroom cytometry is een techniek die is ontwikkeld om te analyseren van meerdere parameters op enkele deeltjes met een snelheid van enkele duizenden evenementen per tweede¹. Voorbeelden van monsters geanalyseerd door stroom cytometry omvatten, maar zijn niet beperkt tot, cellen, kralen, bacteriën, blaasjes en chromosomen. Een fluidic systeem regisseert deeltjes op het punt van de ondervraging waar elk deeltje zijn pad kruist met een of meer lasers, en meerdere parameters worden opgenomen voor verdere analyse. Voorwaartse en zijdelingse verstrooit, gegenereerd door de verstrooiing van het zuivere laserlicht, worden gebruikt voor het identificeren van de doelpopulatie en ophalen van informatie over de relatieve omvang en interne complexiteit/granulariteit van deeltjes, respectievelijk. Alle andere parameters, die goed zijn voor het merendeel van de gegevens in een flow cytometrische analyse, worden afgeleid door fluorescerende-geëtiketteerden sondes die worden herkend en binden aan specifieke doelstellingen op de deeltjes van belang.

Stroom cytometry is een primaire hulpmiddel voor immunologische studies te identificeren en te karakteriseren cel populaties. Om te ontleden de complexiteit van het immuunsysteem, multicolor panelen zijn voortdurend in ontwikkeling om uit te breiden het aantal markeringen gelijktijdig opgenomen voor diepe immunophenotyping voor cel populaties¹. Dit leidt tot de ontwikkeling van krachtigere instrumenten en fluorochromes, met recente high-end flow cytometers meer dan 20 TL parameters. Dit resulteert in complexe studie ontwerp als gevolg van fluorescerende spectrale overlap en in hogere kosten in verband met aangepaste antilichaam etikettering en bekwame operatoren. In meerdere gevallen, worden complexiteit en kosten verlaagd door gebruik te maken van afzonderlijke panelen van markers voor andere cel populaties. Deze aanpak, echter is foutgevoelig, vermindert de informatie in elk paneel, en moeilijk toe te passen op monsters met een beperkt aantal cellen kan zijn. Bovendien, verhoging van het aantal markeringen verzet zich tegen diepe immunophenotyping op instrumenten met minder fluorescerende parameters. Eerder ontwikkelden we een kleuring protocol ter identificatie van de grote menselijke immuun populaties (CD4⁺ en CD8⁺ T cellen en γδ T cellen, B-cellen, NK-cellen, monocyten) in perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) door het combineren van zeven lineage markeringen gebruiken slechts twee fluorochromes in plaats van de zeven nodig met behulp van de traditionele "een fluorescerende-een marker" aanpak (www.hcdm.org)^2,3. Ons eerste verslag onderzocht en gevalideerd de notie van het combineren van zeven markers in twee fluorochromes voor diepe immunophenotyping. In dit verslag presenteren wij een stap door stap protocol om te isoleren en vlek perifere bloedcellen, zich te concentreren op het praktische aspect en de stappen om een succesvolle kleuring voor probleemoplossing.

Dit protocol is gebaseerd op de observatie dat geslacht markeringen een constante expressie op het celoppervlak hebben en dat de bevolking van elke cel een exclusieve combinatie van lineage markers heeft. In PBMCs, CD3 expressie immuuncellen onderverdeelt in twee hoofdcategorieën: CD3-positieve T-lymfocyten en CD3-negatieve cellen. Binnen de CD3 positieve deelgroep, CD4⁺, CD8⁺ en γδ T cellen kunnen worden gescheiden met behulp van antilichamen die uitsluitend gericht zijn op CD4, CD8 en de γδ receptor. Op een vergelijkbare manier, binnen de CD3 negatieve deelgroep, kunnen B-cellen, NK-cellen en monocyten uniek worden aangeduid met behulp van antilichamen tegen CD19, CD56 en CD14, respectievelijk. In een standaard aanpak voor een fluorescerende-een marker, anti-CD3,-CD4,-CD8, -CD14,-CD19 - CD56 en -TCR γδ antilichamen worden gedetecteerd met zeven verschillende fluorochromes. Onze aanpak combineert anti-CD3 - CD56 en -TCR γδ antilichamen in een fluorescerende (gelabeld voor gemak fluorescerende A) en anti-CD4,-CD8, -CD14 en - CD19 antilichamen in een verschillende fluorescerende (fluorescerende B). Dit is mogelijk door een combinatie van titratie van antilichamen en differentiële antigeen expressie. Beide CD4⁺ en CD8⁺ T cellen zijn positief voor het anti-CD3 antilichaam in fluorescerende A, maar zij kunnen worden gescheiden in fluorescerende B maximaliseren van de expressie van de CD8-signaal terwijl het plaatsen, met een ad hoc-titratie, de CD4-signaal tussen de CD8 en de cellen van de positieve-CD4/CD8 dubbel negatief CD3. Γδ T-cellen spreekt hoger niveau van CD3 dan CD4 en CD8 en daarom kunnen zij worden geïdentificeerd als CD3 hoge⁴. Dit signaal wordt verder versterkt door het labelen van γδ T-cellen in fluorescerende A met een anti-TCR γδ antilichamen, dus verbetering van de scheiding tussen CD3 lage T-cellen en CD3 hoge γδ T cellen. B cellen kunnen worden geïdentificeerd als CD3^- in fluorescerende A en CD19⁺ in fluorescerende B. Als u wilt scheiden CD3 negatieve NK cellen van B-cellen, werd een anti-CD56 antistof gebruikt in fluorescerende A als de anti-CD3. Dit is mogelijk omdat CD56 op NK-cel op een veel lager niveau dan CD3 op T cellen^{5 uitgedrukt}. Ten slotte, monocyten kunnen worden geïdentificeerd via een combinatie van vooruit-kant scatter eigenschappen en expressie van CD14 in fluorescerende B.

Het idee van het combineren van maximaal vier markeringen met behulp van twee fluorochromes heeft al met succes geprobeerd voordat^6,7,8, en is gebruikt in een protocol voor klinische te identificeren van kwaadaardige lymfatische populaties⁹ . Een vorig rapport ook gecombineerd zeven markeringen (met verschillende specificiteit van de markers dan wij in ons protocol gebruikt) met behulp van twee fluorochromes, maar deze aanpak gebaseerd op een complexe etikettering van elke antilichaam met variërende hoeveelheid fluorescerende¹⁰. Dit is in tegenstelling tot onze methode die gebruik maakt van verkrijgbare antilichamen en kan worden aangepast aan de configuratie van het instrument en kunt profiteren van de nieuwe generatie van polymeer fluorochromes.

Het algemene doel van deze methodiek is om uit te breiden van de optische grenzen van meeste flow cytometers waardoor de opname van vijf extra markers te ondervragen van complexe cel populaties. Dientengevolge, geavanceerde immunologische analyse kan worden uitgevoerd op betaalbare 6-10 fluorescerende flow cytometers, en 2-3 fluorescerende veld instrumenten kunnen bereiken opmerkelijke resultaten op gebieden met beperkte middelen. High-end instrumenten kunnen ook profiteren van deze aanpak met behulp van extra fluorochromes om diepere stroom cytometry analyse en maken de modulaire stroom cytometrische panelen gericht op verschillende geslachten bij de dezelfde tijd¹¹. Dit kan potentieel het aantal panelen die worden gebruikt in de modulaire immunophenotyping stroom cytometry verminderen en verminderen kosten, fouten en verwerkingstijd. Deze aanpak is ook zeer goed geschikt in het geval van klinische monsters met een beperkt aantal cellen.

Protocol

Alle studies van menselijke materialen werden goedgekeurd door de Johns Hopkins institutionele Review Board onder de Health Insurance Portability and Accountability Act. Patiënt en controle monsters waren-geïdentificeerde. PBMCs en bloed van gezonde controles werden verkregen door de geïnformeerde toestemming.

Opmerking: Dit protocol is getest op vers of bevroren geïsoleerde perifere bloedcellen en bloed.

1. cel voorbereiding

1. Isolatie van perifere bloedcellen (PBMC) van volbloed
   1. Tekenen bloed in een tube van 10 mL groen-top met Natrium heparine. Nadat de buis is gevuld met bloed, onmiddellijk omkeren de buis meerdere malen om te voorkomen dat coagulatie.
      Opmerking: Buizen met andere antistollingsmiddel zoals ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) of Natriumcitraat kunnen worden gebruikt met vergelijkbare resultaten. Als een andere hoeveelheid bloed wordt verzameld, moeten de volgende stappen in het protocol dienovereenkomstig worden aangepast.
   2. Breng zorgvuldig getrokken bloed in een conische tube van 50 mL. Verdun het bloed met een gelijke hoeveelheid fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) zonder calcium en magnesium.
   3. Voeg toe 15 mL van de kleurovergang medium dichtheid (bijvoorbeeld densiteitgradiënt) naar de onderkant van een nieuwe conische tube van 50 mL en zorgvuldig het verdunde bloed op de top van dichtheid kleurovergang medium, het vermijden van enige mengen overlay tussen de dichtheid kleurovergang medium en het verdunde bloed.
      Opmerking: Dit is een cruciale stap voor een goede scheiding van PBMCs van rode bloedcellen.
   4. Centrifugeer bij 400 x g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT), met geen rem te voorkomen van verstoring van de interface.
   5. Na het centrifugeren, zorgvuldig de bovenste laag met behulp van een precisiepipet gecombineerd en verwerpen, aandacht te besteden aan cellen op het raakvlak tussen het plasma en dichtheid kleurovergang medium, thats waar PBMCs stratifies niet verwijderen. Verzamelen net zoveel cellen mogelijk vanuit de interface zonder aanraken van de rode cel pellet aan de onderkant van de conische tube van 50 mL en overdracht aan een nieuwe conische tube van 50 mL.
   6. Toevoegen van PBS om het eindvolume tot 25 mL en omkeren van meerdere keren te mengen. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten op RT met de rem op kleurovergang middellange verontreiniging dichtheid van de celsuspensie verwijderen.
   7. Zorgvuldig gecombineerd bovendrijvende vloeistof zonder storende cel pellet. Toevoegen van PBS om het eindvolume tot 25 mL en omkeren van meerdere keren te mengen. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 10 minuten op RT met de rem op verwijderen bloedplaatjes.
   8. Zorgvuldig gecombineerd de bovendrijvende vloeistof zonder verstoring van de cel-pellet. Resuspendeer PBMCs in 1 mL PBS/0.1% natriumazide. Natriumazide vermindert aftopping, vergieten, internalisering van de antilichamen, en verhoging van de cel herstellen, maar de toxiciteit kan afbreuk doen aan de levensvatbaarheid van de cellen. Om deze reden, moet natriumazide worden vermeden in alle stappen, als de cellen zal worden gekweekt voor latere experimenten. Cel isolatie en kleuring zonder natriumazide gaf vergelijkbare resultaten aan kleuring uitgevoerd in aanwezigheid van natriumazide.
      Let op: Natriumazide kan leiden tot dood door het beïnvloeden van het centrale zenuwstelsel. Contact kan veroorzaken brandwonden aan de ogen en de huid.
   9. Verdun de cellen voor het tellen van door de overdracht van 30 µL van PBMCs in een tube van 1,5 mL microcentrifuge. Voeg vervolgens 120 µL van PBS en 150 µL van Trypan blauw celaantal en levensvatbaarheid te bepalen (1:10 cel verdunning). Resuspendeer zorgvuldig.
   10. 10 µL overbrengen in een hemocytometer, graaf de cellen dienovereenkomstig aan de gebruikte telling kamer en het aantal levensvatbare cellen te bepalen. Levensvatbare cellen = aantal Trypan blauwe negatieve cellen total x 10 (de verdunningsfactor gebruikt in dit protocol) x 10⁴.
       Opmerking: Gemiddeld, 7-15 x 10⁶ van PBMCs moeten worden verzameld van 10 mL bloed.
   11. Resuspendeer de cellen op 10 x 10,⁶ per mL PBS/0.1% natriumazide
       Opmerking: PBMC kunnen worden bevroren en opgeslagen in vloeibare stikstof voor een langere periode van tijd. Expressie van markeringen zoals chemokine receptoren kan echter worden gewijzigd door deze procedure.
2. Voorbereiding van cellen uit ingevroren PBMC
   Opmerking: verschillende bevriezing procedures van invloed kunnen zijn op het herstel en de levensvatbaarheid van de cel¹². PBMCs voor deze experimenten werden bevroren speciaal samengestelde bevriezing van media of foetale runderserum (FBS)/10% dimethylsulfoxide (DMSO) met vergelijkbare resultaten.
   Let op: DMSO kan worden nauwelijks gevaarlijk in geval van inademing (Long irriterend), huidcontact (irriterende, permeator), van contact met de ogen (irriterend), van inname.
   1. Bevroren PBMC Verwijder uit vloeibare stikstof en plaats op het ijs. Breng de cryovial van het ijs direct in het waterbad 37 ° C. Houden van de cryovial op het wateroppervlak en de flesjes zachtjes te schudden tot een kleine ijs pellet blijven. Overdracht van de cryovial terug op het ijs.
   2. Verwijder eventuele water met een 70% ethanol gespoten doekje. Langzaam voeg 1 mL PBS/0.1% natriumazide bij 4 ° C en de cel zorgvuldig overbrengen in een conische tube van 15 mL. Voeg langzaam koud PBS/0.1% natriumazide bij 4 ° C tot een eindvolume van 15 mL.
   3. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 min. Verwijder voorzichtig het supernatant, resuspendeer de cellen in 1 mL PBS/0.1% natriumazide.
      Opmerking: De cellen kunnen ook worden resuspended in de RPMI 10% FBS met vergelijkbare resultaten.
   4. Verdun de cel voor tellen door de overdracht van 30 µL van PBMCs in een tube van 1,5 mL microcentrifuge. Voeg vervolgens 120 µL van PBS en 150 µL van Trypan blauw celaantal en levensvatbaarheid te bepalen (1:10 cel verdunning). Resuspendeer zorgvuldig.
   5. 10 µL overbrengen in een hemocytometer, graaf de cellen dienovereenkomstig aan de gebruikte telling kamer en het aantal levensvatbare cellen te bepalen. Levensvatbare cellen = aantal Trypan blauwe negatieve cellen total x 10 (de verdunningsfactor gebruikt in dit protocol) x 10⁴.
   6. Resuspendeer de cellen op 10 x 10,⁶ per mL in PBS/0.1% natriumazide.
3. Voorbereiding van cellen uit volbloed
   1. Tekenen bloed in een tube van 10 mL groen-top met Natrium heparine. Nadat de buis is gevuld met bloed, onmiddellijk omkeren de buis meerdere malen om te voorkomen dat coagulatie.
      Opmerking: Buizen met andere antistollingsmiddel zoals EDTA of Natriumcitraat kan worden gebruikt met vergelijkbare resultaten. Als een andere hoeveelheid bloed wordt verzameld, moeten de volgende stappen in het protocol dienovereenkomstig worden aangepast.
   2. 200 µL van volbloed overbrengen in een buis 12 x 75 mm afgetopt, voeg 2 µL van natriumazide en vortex zachtjes gedurende 2 s.

2. cel kleuring

Opmerking: Het kiezen van paren van fluorochromes met vrijwel geen spectrale overlap is belangrijk om de spreiding van gegevens als gevolg van hoge spill-over van een fluorescerende in de andere fluorescerende detector. Om een optimale identificatie van al de cel subsets, moeten fluorochromes met een hoge quantumrendement worden gebruikt zoals antilichaam pairs PE-BV421- en PE-APC.

1. Kleuring van verse en diepgevroren PBMC
   1. Breng 100 µL van PBMC (1 x 10⁶ cellen) naar een 96-Wells-V-bodemplaat.
      Opmerking: Een willekeurig aantal cellen lager dan 1 x 10⁶ kan worden gebruikt met soortgelijke resultaten².
   2. Centrifugeer bij 350 x g gedurende 3 minuten op RT en zorgvuldig gecombineerd de bovendrijvende vloeistof zonder verstoring van de cel-pellet. Voeg toe aan elke goed 100 µL van PBS met een leven/dood corrigeerbare kleurstof die met gratis amine op eiwitten voor 10 min reageert op het etiket van de dode cellen.
   3. Voorbereiden van elk monster 30 µL van een mix met alle de antilichamen (anti-CD3.-CD56, TCRγδ in fluorchrome-A en anti-CD4, CD8, CD19, CD14 in fluorchrome B). Concentratie van antilichamen zijn aangegeven in tabel 1 en tabel2. In dit stadium milliliters gestelde antilichamen tegen verschillende doelgroepen moleculen en in verschillende fluorochromes kunnen ook worden toegevoegd (bijvoorbeeld, tabel 3).
      Opmerking: Concentratie van de antistoffen kan variëren afhankelijk van de fabrikant en het lotnummer. Daarom moeten voorafgaande proeven worden gedaan om het bereiken van het optimale signaal. PBS, PBS/0.5% BSA, natriumazide PBS/0.2% of PBS/0.5% BSA/0.1% natriumazide gewend waren met vergelijkbare resultaten antilichamen²verdunnen. Cel kan ook worden gekleurd in volumes verschillen van 30 µL gemakkelijk integreren deze methodologie aan reeds bestaande kleuring van protocollen.
   4. Centrifugeer bij 350 x g gedurende 3 minuten op RT en zorgvuldig gecombineerd de bovendrijvende vloeistof zonder verstoring van de cel-pellet. De antilichaam-cocktail toevoegen aan elk putje en resuspendeer zorgvuldig zonder bubbels. Incubeer gedurende 30 min op RT in het donker.
      Opmerking: Het is mogelijk om de vlekken van de monsters bij 4 ° C met vergelijkbare resultaten.
   5. Voeg 150 µL van kleuring buffer en centrifuge bij 350 x g gedurende 3 min op RT en zorgvuldig gecombineerd de bovendrijvende vloeistof zonder verstoring van de cel-pellet. Resuspendeer de cellen in 200 µL van PBS en het verwerven van gegevens op een stroom cytometer. Als kleuring volumes worden gewijzigd, moet u controleren ten minste een 20-fold verdunning van de originele antilichaam mix gebruikt voor het wassen van de overmaat van antilichamen.
      Opmerking: Gekleurde cellen kunnen worden vastgesteld met in PBS/2% paraformaldehyde, 's nachts in een koelkast bij 4 ° C bewaard en vervolgens verworven op een stroom cytometer de volgende dag.
      Let op: Paraformaldehyde is schadelijk bij opname door de mond en leiden irritatie van de huid tot kan
2. -Verkleuring van de volbloed
   1. Toevoegen aan elke buis 12 x 75 mm afgetopt, de cocktail van antilichamen (anti-CD3.-CD56, TCRγδ in fluorescerende A en anti-CD4, CD8, CD19, CD14 in fluorescerende B) en Incubeer bij RT gedurende 30 min op RT in het donker. Concentratie van antilichamen zijn aangegeven in tabel 4. In dit stadium, getitreerd antilichamen tegen verschillende doelgroepen moleculen en in verschillende fluorochromes kunnen ook worden toegevoegd. Antilichaam concentratie kan variëren afhankelijk van de fabrikant en het lotnummer. Daarom moeten voorafgaande proeven worden gedaan om het bereiken van het optimale signaal.
      Opmerking: Het is mogelijk om vlek monsters bij 4 ° C met vergelijkbare resultaten.
   2. Centrifugeer bij 350 x g gedurende 3 minuten op RT en zorgvuldig gecombineerd de bovendrijvende vloeistof zonder verstoring van de cel-pellet. Maak een oplossing van 1 x van de rode bloedcel lysis buffer volgens de instructies van de fabrikant.
      Opmerking: De lysis van de oplossing moet op RT vóór gebruik.
   3. 2,0 mL 1 x rode bloedcellen lysis-buffermengsel toevoegen aan elke buis, cap goed en omkeren van meerdere keren te mengen. Dek af met folie en laat gedurende 15 minuten zitten.
   4. Spin down bij 300 x g voor 5 min. gecombineerd zorgvuldig de bovendrijvende vloeistof zonder verstoring van de cel-pellet.
   5. Voeg 2 mL PBS en centrifuge bij 300 x g gedurende 5 min.
      Opmerking: op dit punt, moet de cel pellet een bleke witte verkleuring die aangeeft een lysis van de succesvolle rode bloedcellen hebben. Zorgvuldig het supernatant om niet storen de cel pellet gecombineerd en zachtjes resuspendeer de cellen in 200 µL van PBS.
   6. Stam de cellen tot en met 12 x 75 mm buizen met 40 µm filter doppen verwijderen cel aggregaten en het verwerven van gegevens op een stroom cytometer.

3. titratie van antilichamen

Opmerking: Titratie van antilichamen is de meest kritische stap voor het verkrijgen van kwalitatief hoogwaardige, reproduceerbare gegevens. Titratie van anti-CD3,-CD8,-CD14 - CD19 en -TCR γδ volgt de standaardprocedure waarbij de concentratie van antilichaam aan optimaal scheiden van positieve en negatieve pieken is afgeleid door maximaal kleuring index^13,14. Verdunningen op de piek of dichter bij de piek aan de stijgende kant van de vlek index curve moeten worden geselecteerd (Figuur 1A-C). Het anti-CD4-antilichaam wordt getitreerd om te plaatsen het hoogtepunt van de CD4-positieve bevolking tussen CD3 enkele positieve populaties en CD3 +/ CD8 + T cellen, dichter aan het CD3 enkele positieve signaal te discrimineren beter de CD8dim bevolking (CD8 + γδ T cellen en NK T-cellen). Langs dezelfde lijn, CD56 titratie wil positie NK CD56⁺ cellen tussen de CD3⁺ en de CD3^- bevolking.

1. Maximale vlek index curve
   Opmerking: titratie van anti-CD3,-CD8,-CD14 - CD19 en -TCR γδ volgt de standaardprocedure waarbij de concentratie van antilichaam aan optimaal scheiden van positieve en negatieve pieken is afgeleid door maximaal kleuring index kromme¹⁵. Als er antistoffen tegen andere markeringen worden toegevoegd aan het deelvenster, moeten ze ook worden getitreerd met een maximale kleuring index curve.
   1. Maak een 2-fold antilichaam verdunning door het invullen van 10 wells van een 96-wells-plaat met 40 µL van kleuring van de buffer. In het eerste putje, verhogen het eindvolume te 80 µL van kleuring buffer en voeg het antilichaam van belang bij een concentratie van 4 maal de concentratie voorgesteld door de fabrikant.
   2. Meng goed en breng 40 µL naar de tweede goed. Meng goed en herhaal deze stap voor de alle de andere putjes.
   3. Vlekken van 10 monsters van PBMC of volbloed met 30 µL van de 10 verschillende 2-fold verdunningen van antilichamen na het protocol voordien beschreef.
   4. Verwerven van gegevens met een stroom cytometer en uitzetten van het signaal van elke verdunning (figuur 1A).
   5. Poort op de negatieve en positieve populaties voor elke concentratie antilichaam. Toenemende concentratie van antilichamen kan leiden tot een hogere achtergrond. Dus, de grootte van de negatieve poort dienovereenkomstig.
   6. Haal voor elke concentratie van antilichaam, informatie over de mediaan en de standaarddeviatie voor de fluorescerende intensiteit van de negatieve bevolking, en de mediaan voor de fluorescerende intensiteit van de positieve bevolking. Berekening voor elke concentratie van het antilichaam van de index van de vlek met deze formule: (mediane fluorescerende intensiteit van de positieve bevolking — mediaan fluorescerende intensiteit van de negatieve bevolking) ÷ (2 x standaardafwijking van de fluorescerende intensiteit van de negatieve bevolking) (figuur 1B).
   7. Uitzetten van de vlek index vs. de antilichaam-concentratie uitgedrukt in breuk van de antilichaam-verdunning (bijvoorbeeld 1:10 verdunning = 0.1), en het identificeren van de concentratie van antilichaam met de indexwaarde van de maximale vlek (Figuur 1 c).
2. Titratie van antilichamen voor anti-CD4 en -CD56
   Opmerking: Anti-CD4 en -CD56 titratie van antilichamen afhankelijk van eerdere titratie de andere markers in het twee-fluorescerende deelvenster. Voor de anti-CD4-antilichamen tegen de titratie is gericht op het plaatsen van de anti-CD4 signaal tussen de dubbele CD8⁺/CD3⁺ signaal en de CD3 enkele positieve bevolking (Figuur 1 d).
   1. Titreer de anti-CD4 en CD56 antilichamen met een 2-fold verdunning strategie zoals eerder is beschreven voor het toevoegen van extra concentraties tussen om fijn het bereik van concentratie vast te stellen die het mogelijk maken om te scheiden van CD4⁺ T cellen en NK-cellen uit de andere cel populaties.
   2. Titreer de anti-CD4-antilichaam door het plaatsen van het anti-CD4-signaal tussen de dubbele CD8⁺/CD3⁺ signaal en de CD3 enkele positieve bevolking (Figuur 1 d).
      Opmerking: Speciale zorg moet worden gedaan om de duidelijk aparte CD4⁺ T cellen van CD8⁺ dim populaties.
   3. Titreer het antilichaam van de anti-CD56 na een vergelijkbaar met de anti-CD4 titratie van antilichamen, strategie door het plaatsen van NK-cellen tussen de CD3-negatieve en de positieve CD3 bevolking.

4. gating strategie

1. Lymfatische en monocytic cel populaties te identificeren en verwijderen van dode cellen en de meeste van de resterende rode bloedcellen uit de analyse.
   1. Selecteer de hele bevolking met lymfocyten en monocyten gebaseerd op voorwaarts vs kant scatter gebied (FSC-A vs SSC-A). Cel aggregaten uit de analyse via voorwaartse scatter hoogte vs voorwaartse scatter breedte (FSC-H vs FSC-W) en kant scatter hoogte vs kant scatter breedte (WS-H vs SSC-W) verwijderen.
   2. Gebruik een leven/dood discriminatie marker helder positieve dode cellen en de resterende rode bloedcellen van de analyse te sluiten. Poort op lymfocyten en monocyten op basis van de verschillende FSC-A en WS-A-profiel.
2. Twee-fluorescerende zeven-marker gating strategie van het lymfatische populaties.
   Opmerking: binnen de CD3 positieve deelgroep, CD4⁺, CD8⁺ en γδ T cellen kunnen worden gescheiden met behulp van antilichamen die uitsluitend gericht zijn op CD4, CD8 en de γδ receptor. Op een vergelijkbare manier, binnen de CD3 negatieve deelgroep, kunnen B-cellen, NK-cellen en monocyten uniek worden aangeduid met behulp van antilichamen tegen CD19, CD56 en CD14, respectievelijk.
   1. Selecteer de lymfocyt-poort en maak van een complot van de stip met op elke as een van de twee fluorochromes gebruikt in dit protocol (figuur 2B).
   2. Gate op CD8⁺ T cellen geïdentificeerd als CD3⁺/CD8⁺ dubbele positieve cellen bij de hoogste juiste hoek van de stip-plot (figuur 2B). Uitsluiten van de dim CD8-bevolking die NKT cellen kan bevatten. Gate op CD4⁺ T cellen geïdentificeerd als bevolking tussen CD8⁺ T cellen en de CD3 enkele positieve populaties. Poort op γδ T-cellen geïdentificeerd als hoge CD3 cellen. Γδ T-cellen in CD8 positieve en negatieve CD8 onderverdelen.
   3. Poort op NK-cellen geïdentificeerd als de bevolking tussen CD3-positieve en negatieve-CD3 cellen. NK cellen in CD8 positieve en negatieve CD8 onderverdelen. Gate op de B-cellen geïdentificeerd als CD3-negatieve CD19⁺ bevolking op de juiste lagere hoek van de stip plot.
   4. Selecteer de monocyt-poorten en maak een stip perceel met op elke as een van de twee fluorochromes gebruikt in dit protocol (figuur 2C). Poort op de CD3^-/CD14⁺ bevolking.

Resultaten

Setup en analyse van een experiment stroom cytometry van menselijke perifere bloedcellen gekleurd met zeven lineage markeringen (anti-CD3,-CD4,-CD8, -CD14,-CD19 - CD56 en -TCR γδ antilichamen) met behulp van slechts twee fluorochromes worden gepresenteerd.

Representatieve resultaten worden voor het anti-CD8 en -CD56 titratie van antilichamen beschreven. Voor elke antilichaam (in dit voorbeeld anti-CD8), gegevens van tien 2-fold ...

Discussie

Het protocol hier gepresenteerd is aangetoond dat het heel flexibel en ongevoelig voor veranderingen in de kleuring van de buffer, de temperatuur en de perifere bloedcellen voorbereiding als gevolg van de hoge uitdrukking van geslacht markeringen op het celoppervlak. De meest kritische stap voor het verkrijgen van kwalitatief hoogwaardige, reproduceerbare gegevens is titratie van antilichamen. Van de nota, aangezien de titratie van antilichamen moet altijd worden uitgevoerd tijdens de installatie van een stroom cytometri...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
CD3	BD Biosciences	562426	Antilichaam voor kleuring RRID: AB_11152082
CD56	BD Biosciences	562751	Antilichaam voor kleuring RRID: AB_2732054
TCRgd	BD Biosciences	331217	Antilichaam voor kleuring RRID: AB_2562316
CD4	BD Biosciences	555347	Antilichaam voor kleuring RRID: AB_395752
CD8	BD Biosciences	555367	Antilichaam voor kleuring RRID: AB_395770
CD14	BD Biosciences	555398	Antilichaam voor kleuring RRID: AB_395799
CD19	BD Biosciences	555413	Antilichaam voor kleuring RRID: AB_395813
CD3	BD Biosciences	555335	Antilichaam voor kleuring RRID: AB_398591
CD56	BD Biosciences	555518	Antilichaam voor kleuring RRID: AB_398601
TCRgd	BD Biosciences	331211	Antilichaam voor kleuring RRID: AB_1089215
CCR7	Biolegend	353217	Antilichaam voor kleuring RRID: AB_10913812
CD45RA	BD Biosciences	560674	Antilichaam voor kleuring RRID: AB_1727497
CCR4	BD Biosciences	561034	Antilichaam voor kleuring RRID: AB_10563066
CCR6	BD Biosciences	353419	Antilichaam voor kleuring RRID: AB_11124539
CXCR3	BD Biosciences	561730	Antilichaam voor kleuring RRID: AB_10894207
CD57	BD Biosciences	562488	Antilichaam voor kleuring RRID: AB_2737625
HLA-DR	BD Biosciences	563083	Antilichaam voor kleuring RRID: AB_2737994
CD16	BD Biosciences	563784	Antilichaam voor kleuring RRID: AB_2744293
Dead cells	Life technologies	L-23105	Live/dead discriminatie
Falcon 5 mL ronde bodem polystyreen testbuis met celfilter kliksluiting	BD Bioscience	352235	om celsuspensie te filteren voordat het door de flow cytometer gaat
Falcon 5 mL ronde bodem polystyreen testbuis	BD Bioscience	352001	om heel bloed te kleuren
Recovery Cell Culture Freezing Medium	Thermo fisher	12648010	Cellen bevriezen
96-well V-bodem plaat	Thermo fisher	249570	plaat voor kleuring
FACSAria IIu Cell Sorter	BD Biosciences		Flow cytometer
FCS Express 6	De Novo Software		FACS analyse
Graphpad Prism	GraphPad software		Gegevensanalyse