Menselijke perifere bloed neutrofiele isolatie voor het ondervragen van de Parkinson Geassocieerde LRRK2 Kinase Pathway door de beoordeling van Rab10 fosforylatie

Samenvatting

Mutaties in het leucine rijke reinase 2 gen (LRRK2) veroorzaken erfelijke de ziekte van Parkinson. We hebben een eenvoudige en robuuste methode ontwikkeld voor het beoordelen van LRRK2-gecontroleerde fosforylatie van Rab10 bij menselijke perifere bloedneutrofielen. Dit kan helpen bij het identificeren van personen met een verhoogde LRRK2 kinase traject activiteit.

Samenvatting

De leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is het meest gemuteerde gen bij erfelijke Parkinson' ziekte (PD) en alle pathogene LRRK2 mutaties resulteren in hyperactivatie van de kinase functie. Hier beschrijven we een eenvoudige en robuuste test om LRRK2 kinase route activiteit in menselijke perifere bloed neutrofielen kwantificeren door het meten van LRRK2-gecontroleerde fosforylatie van een van de fysiologische substraten, Rab10 op threonine 73. De beschreven immunoblotting analyse vereist een volledig selectief en fosfospecifiek antilichaam dat de Rab10 Thr73 epitoop fosforylaat door LRRK2 herkent, zoals de MJFF-pRab10 konijn monoklonale antilichaam. Het maakt gebruik van menselijke perifere bloed neutrofielen, omdat perifere bloed is gemakkelijk toegankelijk en neutrofielen zijn een overvloedige en homogene bestanddeel. Belangrijk is dat neutrofielen relatief hoge niveaus van zowel LRRK2 als Rab10 uitdrukken. Een potentieel nadeel van neutrofielen is hun hoge intrinsieke serine protease activiteit, die het gebruik van zeer krachtige proteaseremmers zoals de organofosfor neurotoxine diisopropylfluorosafosfaat (DIFP) als onderdeel van de lysisbuffer vereist. Niettemin zijn neutrofielen een waardevolle bron voor onderzoek naar lrrk2 kinase-padactiviteit in vivo en moeten ze in aanmerking komen voor opname in PD-biorepository-collecties.

Inleiding

Pogingen om de ziekte van Parkinson (PD) te vertragen of te stoppen zijn tot nu toe mislukt. De ontdekking van hyperactiverende mutaties in de leucine rijke reinase 2 (LRRK2) die het risico voor PD veroorzaken en/of verhogen heeft geleid tot de ontwikkeling van LRRK2 kinase remmers^1,2,3. Deze zijn nu opgenomen in klinische proeven⁴. De exacte functie van LRRK2 is onduidelijk, maar een belangrijke vooruitgang is de identificatie van een subset van Rab GTPase eiwitten, waaronder Rab10, als de eerste bonafide fysiologische substraten van de LRRK2 kinase^5,6,7. Belangrijke uitdagingen in het tijdperk van ziekte-modificerende therapieën zijn biochemische markers van LRRK2 kinase activeringsstatus en doelbetrokkenheid van LRRK2 kinase remmers.

Tot nu toe was de belangrijkste farmacokinetische marker voor LRRK2-remmers in vivo een cluster van constitutieve fosforyllated serineresiduen van LRRK2, met name serine 935, die ontsmet raken in reactie op diverse LRRK2-remmers^8,9. Serine 935 fosforylatie correleert echter niet met intrinsieke cellulaire LRRK2 kinaseactiviteit omdat het niet direct fosforylaat is door LRRK2 en nog steeds fosforylaat is in kinase-inactieve LRRK2¹⁰. LRRK2 kinase activiteit correleert goed met autofoostie van serine 1292, maar het is in de praktijk geen geschikte uitlezing voor endogene LRRK2 kinase activiteit door immunoblot analyse van hele cel extracten als gevolg van het huidige gebrek aan betrouwbare en fosforspecifieke antilichamen voor deze site^10,11.

We hebben een robuuste en eenvoudige test ontwikkeld om lrrk2 kinase-padactiviteit te kwantificeren in menselijke perifere bloedcellen die lrrk2-gecontroleerde fosforylatie van zijn fysiologische doeleiwit Rab10 bij threonine 73¹¹meet. Perifeer bloed is gemakkelijk toegankelijk door geslachtsdeel, dat is een laag risico en snelle procedure die minimaal ongemak veroorzaakt. We richten ons op menselijke perifere bloedneutrofielen omdat ze een overvloedige (37-80% van alle witte bloedcellen) en homogene celpopulatie die relatief hoge niveaus van zowel LRRK2 en Rab10¹¹uitdrukt . Bovendien kunnen perifere bloedneutrofielen snel en efficiënt worden geïsoleerd door gebruik te maken van een immunomagnetische negatieve benadering. Om ervoor te zorgen dat de daaropvolgende waargenomen Rab10-fosforylatie wordt bemiddeld door LRRK2, wordt elke partij neutrofielen geïncubeerd met of zonder een krachtige en selectieve LRRK2 kinase-remmer (we gebruiken en aanbevelen MLi-2)^2,12. Dit wordt gevolgd door cellyse in een buffer met de proteaseremmer diisopropylfluorosafosfaat (DIFP), wat nodig is voor het onderdrukken van de intrinsieke serine protease activiteit waarvan bekend is dat hoog bij neutrofielen¹³. Voor de uiteindelijke analyse door kwantitatieve immunoblotting raden we aan om het MJFF-pRab10 konijn monoklonale antilichaam te gebruiken dat specifiek de Rab10 Thr73-phosphoepitope detecteert en niet cross-react met andere fosforylated Rab eiwitten¹⁴. Selectiviteit en specificiteit van dit antilichaam is gevalideerd in overexpressiemodellen van verschillende Rab-eiwitten en een A549 Rab10 knock-out cellijn¹⁴. Zo meten we het verschil in Rab10 fosforylatie in neutrofiele lysaten die zijn behandeld met en zonder een krachtige en selectieve LRRK2 kinase remmer². Als alternatief kunnen monsters ook worden geanalyseerd met andere methoden, zoals kwantitatieve massaspectrometrie.

Tot slot, LRRK2-gecontroleerde Rab10 fosforylatie is een superieure marker van LRRK2 kinase activiteit op LRRK2 fosforylatie op serine 935 en menselijke perifere bloed neutrofielen zijn een waardevolle bron voor PD onderzoek naar LRRK2. Ons protocol biedt een robuuste en eenvoudige test om LRRK2 trajectactiviteit te ondervragen in perifere bloedneutrofielen en maakt biochemische gelaagdheid mogelijk van personen met verhoogde LRRK2 kinase activiteit¹⁵. Belangrijk is dat dergelijke personen kunnen profiteren van toekomstige LRRK2 kinase remmer behandeling.

Protocol

Volgens de lokale Britse regelgeving worden alle manipulaties en pipettering van menselijk bloed uitgevoerd in een biologische veiligheidskast van categorie 2. Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de lokale ethische beoordelingscommissie en alle deelnemers hebben geïnformeerde toestemming gegeven.

1. Voorbereiding

1. Bereid 0,1 mL EDTA Stock Solution 1 voor met 100 mM EDTA in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
2. Bereid 60 mL EDTA Stock Solution 2 voor met 1 mM EDTA in PBS.
3. Bereid een lysisbuffer voor met 50 mM Tris-HCl (pH = 7,5), 1% (v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na₃VO₄, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerofosfaat, 5 mM natriumpyrofosfaat, 0,27 M sacharose, 0,1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x proteaserremmende cocktail, 1 μg/mL microcystin-LR en 0,5 mM diisopropylfluorfosfaat (DIFP).
   OPMERKING: De auteurs gebruiken routinematig een EDTA-vrij product, maar een EDTA-bevattende proteaseremmercocktail zou ook moeten werken. De lysisbuffer kan vooraf worden gemaakt zonder de β-mercapto-ethanol, proteaseremmers, microcystin-LR en DIFP, en opgeslagen bij 4 °C tot gebruik. Zorg ervoor dat de β-mercapto-ethanol, proteaseremmers, microcystin-LR en DIFP pas vlak voor gebruik worden toegevoegd.
   LET: DIFP is giftig en moet met zorg worden behandeld in een rookkap na lokale beoordeling van het risico op gezondheids- en veiligheid. DIFP kan worden toegevoegd aan de lysisbuffer en onmiddellijk worden gebruikt. Als alternatief kan de volledige lysisbuffer met alle andere componenten, waaronder DIFP, worden bij -80 °C worden opgeslagen en gedurende ten minste 4 weken worden opgeslagen.

2. Neutrofiele isolatie van volbloed

1. Verzamel 10 mL bloed in een bloedafnamebuis. Meng voorzichtig door het omkeren van buizen 7−8x.
2. Breng 10 mL bloed over in een conische buis van 50 mL.
3. Voeg 100 μL EDTA Stock Solution 1 toe aan het bloed. Meng voorzichtig.
4. Voeg 500 μL van de isolatiecocktail (50 μL/mL) van de neutrofiele isolatiekit(Table of Materials)toe aan het bloedbloedmonster.
5. Vortex de magnetische kralen uit de neutrofiele isolatie kit voor 30 s voor gebruik om de zeer fijne magnetische kralen opnieuw op te schorten.
6. Voeg 500 μL van de magnetische kralen toe aan het bloedmonster en meng voorzichtig door de buis meerdere keren om te keren.
7. Incubeer bij kamertemperatuur (RT) gedurende 5 min.
8. Vul de buis tot 50 mL met EDTA Stock Solution 2. Meng door heel voorzichtig op en neer te ponsen 2-3x.
9. Plaats de buis in de magneet en verwijder het deksel om latere agitatie van de buis te voorkomen.
10. Incubatie voor 10 min bij RT.
11. Pipetteer de verrijkte celsuspensie die de neutrofielen bevat zorgvuldig in een nieuwe conische buis van 50 mL.
    LET OP: Raak de zijkant van de buis die in contact komt met de magneet niet aan en vermijd het verzamelen en verstoren van de rode bloedcellen aan de onderkant van de buis. Laat ongeveer 10 mL van de rode bloedcelsussie achter aan de onderkant van de buis.
12. Draai de magnetische kralen voor 30 s voor gebruik en voeg 0,5 mL van de magnetische kralen toe aan de buis met de verrijkte neutrofielen. Meng voorzichtig door de buis om te keren.
13. Incubeer bij RT voor 5 min.
14. Plaats de buis in de magneet en verwijder het deksel om latere agitatie te voorkomen.
15. Incubeer bij RT voor 5 min.
16. Pipetteer de verrijkte celsuspensie die de neutrofielen bevat zorgvuldig in een nieuwe conische buis van 50 mL.
    LET OP: Raak de zijkant van de buis die in contact staat met de magneet niet aan. Laat ongeveer 5 mL van de suspensie aan de onderkant van de buis.
17. Om ervoor te zorgen dat magnetische kralen volledig uit het celmengsel worden verwijderd, plaatst u de buis met de verrijkte cellen in de magneet.
18. Incubatie voor 10 min bij RT.
19. Pipetteer de verrijkte celsuspensie die nu pure neutrofielen bevat zorgvuldig in een nieuwe conische buis van 50 mL.
    LET OP: Raak de zijkant van de buis die in contact staat met de magneet niet aan. Laat ongeveer 5 mL van de suspensie aan de onderkant van de buis.
20. Meng de geïsoleerde cellen met 1 mM EDTA Stock Solution 2 tot een eindvolume van ongeveer 41 mL. Pipetteer op en neer om te mengen.
21. Verdeel de oplossing gelijkmatig in twee buizen met ongeveer 20 mL in elke buis.
22. Centrifugeer beide buizen op 335 x g gedurende 5 min.
23. Neem tijdens deze centrifugatie MLi-2-remmervoorraad (200 μM/1.000x concentratie) uit de -80 °C-vriezer en laat bij RT achter voor later gebruik.
24. Onmiddellijk na de centrifugatie stap en zonder agitatie van de buizen, giet de supernatant zonder verstoring van de neutrofiele pellets. Resuspend elke cel pellet in 10 mL van celcultuur media (Tabel van materialen)bij RT door voorzichtig pipetteren cellen op en neer 4x.

3. LRRK2 kinase-remmerbehandeling van zuivere neutrofielen

1. Label een buis "DMSO" en de andere buis "MLi-2".
2. Voeg 10 μL DMSO toe aan de "DMSO" gelabelde buis en meng voorzichtig door 2x op en neer te paien met een pipet van 10 mL. Voeg aan de "MLi-2" gelabelde buis 10 μL van 200 μM MLi-2 voorraadoplossing (eindconcentratie 200 nM) toe en meng voorzichtig door 2x op en neer te paien met een 10 mL pipet.
3. Incubeer de monsters gedurende 30 min bij RT. Meng voorzichtig door inversie om de 10 min tijdens de incubatie.
4. Verwijder tijdens de incubatietijd 0,5 M DIFP-voorraad uit de vrieskist van -80 °C en plaats in een rookkap op ijs. Verwijder 1 mg/mL microcystin-LR voorraadoplossing uit de -80 °C vriezer en laat bij RT ontdooien. Neem een aliquot (0,25 mL) van de lysisbuffer uit de vriezer, laat het ontdooien bij RT en plaats deze vervolgens op ijs voor later gebruik.
5. Bereid 1 mL celkweekmedium voor dat 1 μL DMSO bevat en noem deze DMSO resuspension buffer. Bereid 1 mL RPMI-media voor die 1 μL van 200 μM MLi-2 bevatten en bel deze MLi-2 resuspension buffer.
6. Centrifugeer beide buizen na de incubatietijd van 30 min op 335 x g gedurende 5 min.
7. Gooi de supernatant in elke buis voorzichtig weg zonder de neutrofiele pellet te verstoren.
8. Voor het dmso-gelabelde monster schort de pellet voorzichtig op in 1 mL van de DMSO-hersuspensiebuffer en voor de MLi-2 gelabelde buis, de pellet opnieuw in 1 mL van de MLi-2 resuspension buffer.
9. Breng de geresuspendeerde celpellets over op overeenkomstige centrifugerende centrifugatiebuizen met het label "DMSO" en "MLi-2" en centrifugeer beide buizen op 335 x g gedurende 3 min.
10. Bereid tijdens de centrifugatiestap de lysebuffer voor. Voeg in de rookkap voorzichtig 0,25 μL van 0,5 M DIFP-oplossing en 0,25 μL van 1 mg/mL microcystin-LR toe aan de 0,25 mL lysisbuffer. Meng en laat op ijs tot het gebruik.
    OPMERKING: Voeg DIFP toe aan de lysisbuffer binnen 15 min cellyse, omdat DIFP relatief instabiel is in een waterige oplossing.
11. Onmiddellijk na de centrifugatie, zorgvuldig en volledig verwijderen van alle supernatant met een pipet zonder verstoring van de neutrofiele pellet en plaats de buizen op ijs.
12. Voeg onmiddellijk 100 μL lysisbuffer met DIFP en microcystine-LR toe aan elke buis. Met behulp van een 100-200 μL pipet, resuspend de cel pellets door pipetteren op en neer ongeveer 5-10x.
13. Lyse de cellen op ijs voor 10 min.
14. Centrifugeer buizen op 20.000 x g gedurende 15 min bij 4 °C om celafval te verwijderen.
15. Breng de "DMSO" en "MLi-2" supernatants met de neutrofiele lysaten over in nieuwe centrifugatiebuizen. Gooi de puinpellet weg.
    LET OP: De neutrofiele lysaten zijn nu klaar voor gebruik of kunnen worden vastgemaakt bevroren in vloeibare stikstof en worden opgeslagen bij -80 °C voor toekomstige analyse.

Resultaten

Onze test maakt het mogelijk het ondervragen van de activering van de PD-geassocieerde LRRK2 kinase in menselijke perifere bloed neutrofielen met LRRK2-afhankelijke Rab10 fosforylatie als een uitlezing. Neutrofielen zijn een homogene en overvloedige perifere witte bloedcellen populatie die hoge niveaus van zowel de LRRK2 en Rab10 eiwitten (Figuur 1) uitdrukt. De enige andere celpopulatie onder de resterende perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) met hoge kopieaantallen van beide eiwitte...

Discussie

Dwingend klinisch, genetisch en biochemisch bewijs wijst op een belangrijke rol voor LRRK2 en in het bijzonder de kinasefunctie bij de ziekte van Parkinson⁷. LRRK2 kinase remmers zijn ontwikkeld en zijn het invoeren van klinische proeven^2,4,12. Als zodanig is er behoefte aan het exploiteren van LRRK2 als biomarker voor doelbetrokkenheid en patiëntgelaagdheid. Ons protocol beschrijft een robuuste en gemakk...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1 mL Pipette tips	Sarstedt	70.762	of equivalent
1.5 mL Micro tubes	Sarstedt	72.690.001	of equivalent
10 mL Pipette tips	Sarstedt	86.1254.025	of equivalent
10 μL Pipette tips	Sarstedt	70.113	of equivalent
15 mL falcon tube	Cellstar	188 271	of equivalent
200 μL Pipette tips	Sarstedt	70.760.002	of equivalent
25 mL Pipette tips	Sarstedt	86.1685.001	of equivalent
50 mL falcon tube	Cellstar	227 261	of equivalent
BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube	BD	BD 367525	of equivalent
Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge	Beckman		of equivalent centrifuge met swingende mand voor 15 mL en 50 mL falcon tubes bij snelheid 1000-1200 x g
Category 2 biological safety cabinet.
cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail	Roche	11836170001
DIFP (Diisopropylfluorofosfaat)	Sigma	D0879	Bereid 0,5M stam oplossing in isopropanol met speciale voorzorgsmaatregelen
Dimethyl sulfoxide	Sigma	6250
Droge ijs of vloeibare stikstof
Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing	ThermoFisher	14190094	of equivalent
Easy 50 EasySep Magnet	Stemcell	18002	voor 1 x 50 ml kegelbuis
EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit	Stemcell	19666	Dit bevat oplossingen genaamd “Isolation Cocktail” en “RapidSpheres magnetische kralen
EGTA	Sigma	E3889
Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge	Eppendorf
Ethanol, in spuitfles
Ethyleendiaminetetraazijnzuur	Sigma	E6758
IJs
Isopropanol (watervrij)	Sigma	278475
Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 1% (v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerofosfaat, 5 mM natriumpyrofosfaat, 0,27 M sucrose, 0,1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystine-LR, 0,5 mM diisopropylfluorofosfaat (DIFP).			alternatief bevroren lysis buffer in aliquoten zonder Microcystine-LR, DIFP verkrijgbaar bij MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/)
Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2)	Merck	438194-10MG	of equivalent (potente en selectieve LRRK2 remmer)
Microcystine-LR	Enzo Life Sciences	ALX-350-012-M001	1 mg/ml stock in DMSO en bewaar bij -80 oC.
Na3VO4	Aldrich	450243
NaF	Sigma	S7920
Odyssey CLx scan Western Blot beeldvormingssysteem	Odyssey
Permanente markerpen
Persoonlijke beschermingsmiddelen
RPMI 1640 Medium	ThermoFisher	21875034	of equivalent
natriumpyrofosfaat	Sigma	S22
sucrose	Sigma	S0389
β-glycerofosfaat	Sigma	50020
β-mercaptoethanol	Sigma	M3148
Voorgestelde antilichamen voor Western blotting
Anti-RAB10 (fosfo T73) antilichaam [MJF-R21]	abcam	ab230261
Anti-α-tubuline	Cell Signaling Technologies	5174	gebruikt bij 1:2000 verdunning
Goat anti-muis IRDye 680LT	LI-COR	926-68020	gebruikt bij 1:10.000 verdunning
Goat anti-muis IRDye 800CW	LI-COR	926-32210	gebruikt bij 1:10.000 verdunning
Goat anti-konijn IRDye 800CW	LI-COR	926-32211	gebruikt bij 1:10.000 verdunning
MJFF-total Rab10 muisantilichaam	gegenereerd door nanoTools (nanotools.de)	niet van toepassing*	gebruikt bij 2 μg/ml eindconcentratie; * Het MJFF-total Rab10 antilichaam gegenereerd door nanoTools (www.nanotools.de) [11] zal in 2018 gecommercialiseerd worden door de Michael J Fox Foundation
Muis anti-LRRK2 C-terminus antilichaam	Antibodies Incorporated	75-253	gebruikt bij 1 μg/ml eindconcentratie
pS935-LRRK2	MRC PPU Reagents and Services	UDD2	gebruikt bij 1 μg/ml eindconcentratie