Micro arrays gebruiken om micro-milieueffecten te ondervragen op cellulaire fenotypes bij kanker

Samenvatting

Het doel van de hier gepresenteerde methode is om te laten zien hoe micro Environment micro arrays (MEMA) kunnen worden gefabriceerd en gebruikt voor het ondervragen van de impact van duizenden eenvoudige combinatorische micro-omgevingen op het fenotype van gekweekte cellen.

Samenvatting

Het begrijpen van de impact van de micro-omgeving op het fenotype van cellen is een moeilijk probleem vanwege het complexe mengsel van zowel oplosbare groeifactoren als matrix-geassocieerde eiwitten in de micro-omgeving in vivo. Bovendien, gemakkelijk beschikbare reagentia voor het modelleren van micro-omgevingen in vitro meestal gebruik maken van complexe mengsels van eiwitten die zijn niet volledig gedefinieerd en lijden aan batch variabiliteit. Het micro Environment Microarray-platform (MEMA) maakt het mogelijk om duizenden eenvoudige combinaties van micro-milieu proteïnen te beoordelen voor hun impact op cellulaire fenotypes in één enkele test. De mema's worden bereid in goed platen, die het mogelijk maakt de toevoeging van individuele liganden om putten met opgesteld extracellulaire matrix (ECM) eiwitten scheiden. De combinatie van de oplosbare ligand met elke gedrukte ECM vormt een unieke combinatie. Een typische MEMA-test bevat meer dan 2.500 unieke combinatorische micro-omgevingen waarin cellen worden blootgesteld aan een enkelvoudige test. Als test case werd de borstkanker cellijn MCF7 verguld op het MEMA-platform. Analyse van deze assay geïdentificeerd factoren die zowel verbeteren en remmen van de groei en de proliferatie van deze cellen. Het MEMA-platform is zeer flexibel en kan worden uitgebreid voor gebruik met andere biologische vragen buiten kankeronderzoek.

Inleiding

Het kweken van kanker cellijnen op plastic in tweedimensionale (2D) monolagen blijft een van de belangrijkste werkpaarden voor kanker onderzoekers. Echter, de micro-omgeving wordt steeds meer erkend voor haar vermogen om cellulaire fenotypes beïnvloeden. Bij kanker, de tumor micro omgeving is bekend dat het beïnvloeden van meerdere cellulaire gedrag, met inbegrip van de groei, overleving, invasie, en reactie op therapie^1,2. Traditionele monolaag celculturen hebben doorgaans geen invloed op de micro-omgeving, wat heeft geleid tot de ontwikkeling van complexere driedimensionale (3D) assays om cellen te kweken, inclusief in de handel verkrijgbare gezuiverde kelder membraan extracten. Echter, deze gezuiverde matrices zijn meestal ingewikkeld om te gebruiken en lijden aan technische problemen zoals batch variabiliteit³ en complexe composities³. Als gevolg hiervan kan het moeilijk zijn om functie toe te wijzen aan specifieke eiwitten die invloed kunnen hebben op cellulaire fenotypes³.

Om deze beperkingen aan te pakken, hebben we de micro Environment Microarray (MEMA) technologie ontwikkeld, die de micro-omgeving verlaagt tot eenvoudige combinaties van extracellulaire matrix (ECM) en oplosbare groeifactor eiwitten^4,5 . Het MEMA-platform maakt identificatie mogelijk van dominante micro-omgevingsfactoren die van invloed zijn op het gedrag van cellen. Met behulp van een array-indeling, kunnen duizenden combinaties van micro-omgevingsfactoren worden getest in één experiment. De MEMA hier beschreven ondervraagt ~ 2.500 verschillende unieke micro voorwaarden. ECM-eiwitten gedrukt in goed platen vormen groei pads waarop cellen kunnen worden gekweekt. Oplosbare liganden worden toegevoegd aan individuele putten, waardoor unieke combinatorische micro-omgevingen (ECM + ligand) worden gemaakt op elke andere plek waar de cellen worden blootgesteld. Cellen worden meerdere dagen gecultiveerde, vervolgens vast, gekleurd en afbeelding gemaakt om cellulaire fenotypes te beoordelen als gevolg van blootstelling aan deze specifieke combinaties van micro omgevingen. Omdat de micro-omgevingen eenvoudige combinaties zijn, is het eenvoudig om eiwitten te identificeren die belangrijke fenotypische veranderingen in cellen stimuleren. Mema's zijn met succes gebruikt voor het identificeren van factoren die invloed hebben op meerdere cellulaire fenotypes, met inbegrip van die die de beslissingen van de cel van het lot stimuleren en de respons op therapie^4,5,6,7. Deze antwoorden kunnen worden gevalideerd in eenvoudige 2D-experimenten en kunnen vervolgens worden beoordeeld onder omstandigheden die meer volledig even de complexiteit van de tumor-micro omgeving. Het MEMA-platform is zeer aanpasbaar aan een verscheidenheid aan celtypen en eindpunten, op voorwaarde dat er goede fenotypische biomarkers beschikbaar zijn.

Protocol

Opmerking: Een overzicht van het gehele MEMA-proces, inclusief de geschatte tijd, wordt beschreven in het stroomdiagram in Figuur 1. Dit protocol Details de fabricage van MEMAs in 8-well platen. Het protocol kan worden aangepast voor andere platen of dia's.

1. bereiding van eiwitten, verdunningsmiddelen en kleurings buffers

1. Evenwichts flacons met ECMs, liganden en cytokines op kamertemperatuur (RT) en centrifugeer kort. Voeg het juiste volume van de juiste RT-buffer toe zoals aangegeven op het productgegevensblad. Volg de aanbeveling van de fabrikant voor voorraad concentraties.
   Opmerking: In tabel 1 en tabel 2vindt u een volledige lijst van de liganden en ecm's met hun voorraad en de uiteindelijke concentraties. Beide liganden en Ecm's worden meestal gebruikt bij de hoogste concentratie van het bereik dat door de fabrikant wordt aanbevolen en die een biologisch effect uitlokken in standaardcultuur testen van 2 dagen. Behandel eiwitten zachtjes en in bioveiligheidskasten onder laminaire stroming om verontreiniging te voorkomen.
2. Inincuberen flesjes met zachte schommelen bij RT voor 1 uur. Vortex eiwitten niet, want dit kan leiden tot denatureren.
3. Aliquot eiwitten voor lange termijn opslag, zodat alle aliquots alleen voor eenmalig gebruik zijn om afbraak met herhaalde vries/dooi cycli te voorkomen. Bewaar gelyofiliseerde eiwitten bij-80 °C (tenzij anders aangegeven) totdat het nodig is. Zorg voor het verzamelen van alle metadata voor toekomstig gebruik, zoals: (i) eiwit naam, (II) datum voorbereid, (III) partij/partijnummer, (IV) leverancier, (v) catalogus nummer, (VI) concentratie, (VII) volume, en (VIII) Voorbereider.
4. Bereid een verdunnings vloeistof buffer met 20% (v/v) glycerol, 10 mM EDTA, 200 mM tris-HCl, pH 7,2 en filter steriliseren. Bewaar deze buffer steriel en bewaar deze bij RT.
5. Bereid de kleurings buffer voor met 2% (w/v) BSA, 1 mM MgCl₂en 0,02% Nan₃ in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Filter en bewaar bij 4 °C.

2. bereiding van een ECM-bron plaat

1. Verwijder aliciteerde voorraden ECM-eiwitten die moeten worden gedrukt en ontdooien op ijs. Noteer alle lotnummers voor het bijhouden van metagegevens.
2. Veeg buisjes van ontdooide eiwitten zachtjes om een goede resuspensie te garanderen en in een centrifuge te draaien.
3. Maak ECM-print mengsels (Epm's) en een fluorescerende fiducial om te worden gebruikt door een vloeistof behandelings robot die de gerandomiseerde 384-well-bron platen zal maken.
   Opmerking: de 384-well bron platen worden gebruikt door een touch PIN array printer om de bedrukte arrays te maken in 8 well Plates.
   1. Label 1,5 mL micro centrifugebuizen voor elke EPM en de fiducial.
   2. Bereid elke EPM met een combinatie van 125 μL verdunningsmiddel buffer (zie stap 1,4) met het juiste volume ECM-voorraad en breng het mengsel tot een totaal volume van 250 μL met PBS. De uiteindelijke concentraties in elke EPM-buis zullen 1x ECM-eiwitten, 5 mM EDTA, 10% glycerol en 100 mM tris zijn.
   3. Maak een fluorescerende fiducial door het op te lossen in de door de fabrikant gespecificeerde juiste buffer en breng 250 μL over naar een gelabeld fiducial Tube.

3. creatie van de bron plaat met behulp van een Liquid handler

1. Ontwerp een 384-well plate layout die de posities van de ECMs willekeurig maakt en is geoptimaliseerd voor de array printer PIN Head die wordt gebruikt. Ontwerp de plaatsing van de fiducial zodat deze wordt afgedrukt in de rij 1, kolom 1 positie van elk goed om te helpen in de matrix oriëntatie.
   Opmerking: In totaal worden 14 − 15 replicaten van elke ECM gebruikt om robuuste gegevens te garanderen. Neem extra replicaten van collageen of een andere ECM op die een robuuste bevestiging oplevert voor de beoordeling van de uniformiteit van de binding. De lay-out moet mogelijk meerdere 384-put-platen gebruiken, afhankelijk van het aantal ECMs van belang.
2. Breng EPM-buizen over naar een vloeistof behandelaar, houd tubes bij 4 °C met een gekoeld buisrek of met een vloeibare Handling robot die zich in een koude ruimte bevindt.
3. Gebruik de software van de Liquid handler om een programma uit te voeren om 15 μL van elke EPM en de fiducial over te brengen naar de vooraf aangewezen putten binnen de 384-bron plaat (en).
4. Pipet in alle ongebruikte putjes om de luchtvochtigheid te verhogen en te beschermen tegen uitdroging tijdens het drukproces.
   Opmerking: Zie afbeelding 2 voor een voorbeeld van een 384-bron plaat set die is geoptimaliseerd voor een 4 x 7-pins kop en bevat een collageen I-blok en PBS.
5. Afdichtings plaat (en) en houd deze bij 4 °C tot u klaar bent om af te drukken.

4. Mema's printen met een array Printing robot

Opmerking: Het volgende deel van het protocol beschrijft specifiek de voorbereiding en het gebruik van MEMA om de impact van verschillende micro-milieu proteïnen op de groei en proliferatie van MCF7 cellen te onderzoeken. Het protocol kan echter gemakkelijk worden aangepast om verschillende liganden, Ecm's en cellen te gebruiken om andere cellijnen en eindpunten van belang te bestuderen.

1. Met behulp van een touch PIN printer, afdrukken EPMs en fiducial spots in 8 put platen. Druk meerdere replicaten van elke ECM-voorwaarde af om de reproduceerbaarheid te garanderen.
   Opmerking: andere plaat formaten of-dia's kunnen worden gebruikt voor afdrukken, maar buffer optimalisatie kan nodig zijn om optimale spot vorming te bereiken.
   1. Print de ECMs voor de MEMA met behulp van 350 μm diameter pinnen gerangschikt in een 4 x 7 printkop configuratie. Print de arrays in de 8-well platen als 20 kolommen door 35 rijen, voor een totaal van ~ 700 vlekken. Grotere arrays zijn mogelijk in deze platen, maar komen met een trade-off van verhoogde randeffecten in zowel celbinding als kleuring.
2. Na het printen, bewaar de platen in een exsiccator gedurende minimaal 3 dagen voorafgaand aan het gebruik.

5. creatie van ligand behandelings platen

1. Ontwerp een 96-well plate layout inclusief liganden van belang. Om de behandeling van veel MEMA platen tegelijk te vergemakkelijken, ontwerpt u deze plaat met spatiëring die het mogelijk maakt om een meerkanaals pipet te gebruiken met 4 verdeelde tips om vloeistoffen over te brengen tussen de putjes van 8-well MEMAs en een 96-well plate.
   Opmerking: In dit protocol wordt de volledige set van liganden die worden vermeld in tabel 2 gebruikt.
2. Liganden op ijs ontdooien. Knip en draai elke Tube kort.
3. Verdun de liganden met de door de fabrikant aanbevolen buffer (meestal PBS) tot een 200x werkvoorraad.
4. Pipet keer 10 μL van elke 200x ligand kolf in de overeenkomstige put binnen de 96-well plate.
5. Afdichting en bewaar de platen bij-20 °C.
   Opmerking: Maak ligand-behandelings platen in batches, waarbij alle metagegevens voor downstream-analyse worden vastgelegd.

6. culturing cellen op MEMAs

1. Blok Mema's gedurende 20 minuten met 2 mL per put van een niet-fouling blokkerende buffer met 1% niet-fouling blokkerende middel (tabel met materialen) in dubbel gedestilleerd water (DDH₂O).
2. Aanzuig buffer en drievoudige spoel putten met PBS. Om uitdroging te voorkomen, laat u het laatste volume van PBS in putjes tot het celbeplating klaar is.
   Opmerking: Het is zeer nuttig om twee bench arbeiders voor celkweek stappen op MEMAs hebben. Een werkbank medewerker kan aspiratie stappen uitvoeren, terwijl de tweede de additie stappen uitvoert. Het wordt aanbevolen om een 1 mL multichannel pipet te gebruiken met tips die zijn gespatieerd om de 8-Wells plaat te passen voor pipetteren en een Y-Splitter met twee Pasteur-pipetten om meerdere putten tegelijk te aspireren.
3. Zaad 2 x 10⁵ MCF7 cellen per goed in 2 ml van dulbecco's gemodificeerde eagle's medium (DMEM) medium met 10% foetaal runderserum (FBS).
   Opmerking: Voorafgaand aan een volledig MEMA-experiment, voert u een celtitratie-experiment uit om celaantallen zodanig te optimaliseren dat MEMA-vlekken hoge celaantallen hebben (maar niet Confluent zijn) aan het einde van de gewenste experimentele duur.
4. Na 2 − 18 h van adhesie, aspiraat medium en vervangen door 2 ml verlaagd groeimedium (DMEM met 0,1% FBS).
   Opmerking: Verlaagd serum (bijv. 0,1% FBS) of groeifactor-verarmd omstandigheden kunnen op dit moment worden gebruikt om de stimulerende impact van specifieke liganden te isoleren.
5. Een ligand-behandelings plaat op ijs ontdooien. Centrifugeer de ontdooide plaat bij 200 x g gedurende 1 minuut.
6. Breng 200 μL medium van elke put in de kweek plaat over naar de juiste put in de behandelings plaat. Pipet omhoog en omlaag om ligand volume te mengen met medium en breng dit mengsel terug naar de juiste put in de MEMA plaat.
7. Licht rots met de hand en retourneer MEMA platen naar de incubator. Cultuur voor de duur van het experiment in aanwezigheid van de ligand/ECM combinatie bij 37 °C en 5% CO₂.
   Opmerking: Een typische MEMA experiment loopt voor 72 h; experimenten met langere duur kunnen vervanging van medium en herbehandeling met ligand vereisen.
8. Pulse MEMA Wells bij 71 h met 100x 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) voor een uiteindelijke concentratie van 10 μM. inbroed in experimentele omstandigheden met EdU gedurende 1 uur bij 37 °C en 5% CO₂.
   Opmerking: Andere Live Cell behandelingen kunnen ook op dit moment worden gebruikt.

7. fixatie en kleuring van de Mema's

1. Na 72 h en eventuele Live-cel behandelingen, aspiraat Wells. Fixeer Mema's in 2 mL per put van 2% Paraformaldehyde (PFA) gedurende 15 min bij RT.
2. Aspirate PFA. Permeabilize met 2 ml per put van 0,1% nietionogene oppervlakteactieve stof gedurende 15 min.
3. Aspireren de nonionische oppervlakteactieve stof en wassen met 2 mL per put van PBS. De aspirate PBS. Was met 2 mL PBS met 0,05% Polysorbaat 20 (PBS-T).
   Opmerking: Het MEMA-oppervlak is hydrofoob en het niet wassen met PBS-T vóór de incubatie van vlekken en antilichamen zal resulteren in de vorming van holtes in putten tijdens incubatie stappen en aanleiding geven tot kleurings artefacten.
4. Aspirate PBS-T. Voeg EdU-detectie reactie reagentia toe. Incuberen voor 1 uur op RT, schommelen en beschermd tegen licht. Na 1 uur incubatie, dorst lessen-reactie met de meegeleverde commerciële dorst lessen-buffer.
   Opmerking: EdU detectie en vlekken/antilichaam stappen kunnen worden uitgevoerd in 1,5 mL per goed om de kosten te verlagen.
5. Zuig de dorst lessen-buffer op en was met PBS-T voordat u met vlekken of antilichamen inbroed.
6. Inincuberen MEMA putten met antilichamen tegen Histon H3K9me3 (1:1000) en fibrillarin (1:400) in kleurings buffer met 2% (w/v) boviene serumalbumine (BSA), 1 mM MgCl₂ en 0,02% Nan₃ 's nachts bij 4 °c.
   Opmerking: Voer antilichaamtitraties uit om optimale concentraties te bepalen voordat u ze op een volledige MEMA-set gebruikt.
7. Na primair antilichaam of vlek incubatie, was Wells 2x met PBS en één keer met PBS-T.
8. Voeg secundaire antilichamen toe (Donkey anti-muis IgG en Donkey anti-konijn IgG, beide 1:300) en 0,5 μg/mL 4 ′ 6 ‐ diamidino ‐ 2 ‐ phenylindole (DAPI). Inincuberen voor 1 uur bij RT in het donker.
9. Was Wells 2x met 2 mL per putje van PBS en laat ze in de laatste 2 mL PBS.
10. Ga verder naar Imaging of bewaar gekleurd MEMAs voor latere beeldvorming in PBS bij 4 °C beschermd tegen licht.

8. beeldvorming van Mema's

1. Afbeelding MEMA op een geautomatiseerd beeldvormings systeem met geschikte fluorescerende detectie kanalen.
2. Uitvoer resulterende afbeeldingsgegevens naar een beeldbeheersysteem. Segmenteer cellen en bereken intensiteitsniveaus met CellProfiler⁸.

9. gegevensanalyse

Opmerking: Gegevensanalyse bestaat uit normalisatie, variatie correctie en samenvatting van de onbewerkte CellProfiler afgeleide gegevens. In dit geval wordt de R-omgeving met aangepaste code gebruikt om alle stappen uit te voeren. Echter, elke statistische omgeving of softwareprogramma kan worden gebruikt om de equivalente acties uit te voeren. Een voorbeeld van de open source aangepaste code voor de R-omgeving voor analyse is beschikbaar op: https://www.Synapse.org/#!Synapse:syn2862345/wiki/72486.

1. De gesegmenteerde afbeeldingsgegevens vooraf verwerken en normaliseren.
2. Bepaal het aantal steun cellen met behulp van de DAPI gebeitste kernen.
3. Auto-Gate EdU-intensiteit om cellen te labelen als EdU⁺. Meet de proliferatie met behulp van het aandeel van EdU⁺ -cellen op elke plek.
4. Mediaan vat cytoplasmische vlekken en nucleaire morfologie metingen op het niveau van de spot.
5. Voer verwijdering van ongewenste variatie (RUV) normalisering op de gegevens om gegevenskwaliteit⁹te verbeteren.
   Opmerking: Deze aanpak wordt toegepast op elke intensiteit en morfologie signaal onafhankelijk als een matrix met matrices met behulp van de rijen en vlekken als de kolommen zoals eerder beschreven⁹.
6. Bivariate löss normalisering toepassen op de RUV genormaliseerde restanten met behulp van de array rij en array kolom als de onafhankelijke variabelen om te corrigeren voor ruimtelijke of intensiteit gerelateerde effecten.
7. Zodra de normalisatie is voltooid, de mediaan vat de replicaten voor elke micro-omgeving voorwaarde voor rapportage en verdere analyse.

Resultaten

Om de micro-milieueffecten op celgroei en proliferatie te vereenvoudigen en om voorwaarden te identificeren die de celgroei en-proliferatie bevorderen of remmen, werd de borstkanker cellijn MCF7 op een set van acht 8-goed-Mema's, zoals beschreven in het Protocol, gesebeerd. Deze test blootgestelde de cellen aan 48 verschillende ECMs en 57 verschillende liganden, voor een totaal van 2736 combinatorische micromilieuvoor waarden. Na 71 h in de cultuur werden cellen gepulseerd met EdU, vast, doordrongen en gekleurd met DAPI,...

Discussie

Het belang van "dimensionaliteit" en context is een motiverende factor geweest in de ontwikkeling van in-vitro cultuur systemen als hulpmiddelen bij de karakterisering van kankercellen door hun interactie met de micro-omgeving¹¹, en het vermogen van in vitro cultuur systemen die de in vivo-omgeving nabootsen, zijn een drijvende kracht achter de zoektocht naar verbetering van die cultuur systemen. In-vitro systemen blijven echter belangrijke instrumenten voor kankeronderzoek, juist vanwege hun verm...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Aushon 2470	Aushon BioSystems		Arrayer robotsysteem dat in het protocol wordt gebruikt
Nikon HCA	Nikon		High Content Imaging systeem ontworpen rond Nikon Eclipse Ti Inverted Microscope
BioTek Precision XS liquid Handler	BioTek		Robot voor vloeistofverwerking die in het protocol wordt gebruikt
Trizma hydrochloride bufferoplossing	Sigma	T2069
EDTA	Invitrogen	15575-038
Glycerol	Sigma	G5516
Triton X100	Sigma	T9284
Tween 20	Sigma	P7949
Kolliphor P338	BASF	50424591
384-well microarray plaat, cilindrische put	Thermo Fisher	ab1055
Nunc 8-well dish	Thermo Fisher	267062
Paraformaldehyde 16% oplossing	Electron Microscopy Science	15710
BSA	Fisher	BP-1600
Sodium Azide	Sigma	S2002
Cell Mask	Molecular Probes	H32713
Click-iTEdU Alexa Fluor	Molecular Probes	C10357
DAPI	Promo Kine	PK-CA70740043
ALCAM	R & D Systems	656-AL	ECM
Cadherin-20 (CDH20)	R & D Systems	5604-CA	ECM
Cadherin-6 (CDH6)	R & D Systems	2715-CA	ECM
Cadherin-8 (CDH8)	R & D Systems	188-C8	ECM
CD44	R & D Systems	3660-CD	ECM
CEACAM6	R & D Systems	3934-CM	ECM
Collagen I	Cultrex	3442-050-01	ECM
Collagen Type II	Millipore	CC052	ECM
Collagen Type III	Millipore	CC054	ECM
Collagen Type IV	Sigma	C5533	ECM
Collagen Type V	Millipore	CC077	ECM
COL23A1	R & D Systems	4165-CL	ECM
Desmoglein 2	R & D Systems	947-DM	ECM
E-cadherin (CDH1)	R & D Systems	648-EC	ECM
ECM1	R & D Systems	3937-EC	ECM
Fibronectin	R & D Systems	1918-FN	ECM
GAP43	Abcam	ab114188	ECM
HyA-500K	R & D Systems	GLR002	ECM
HyA-50K	R & D Systems	GLR001	ECM
ICAM-1	R & D Systems	720-IC	ECM
Laminin	Sigma	L6274	ECM
Laminin-5	Abcam	ab42326	ECM
Lumican	R & D Systems	2846-LU	ECM
M-Cad (CDH15)	R & D Systems	4096-MC	ECM
Nidogen-1	R & D Systems	2570-ND	ECM
Osteoadherin/OSAD	R & D Systems	2884-AD	ECM
Osteopontin (SPP)	R & D Systems	1433-OP	ECM
P-Cadherin (CDH3)	R & D Systems	861-PC	ECM
PECAM1	R & D Systems	ADP6	ECM
Tenascin C	R & D Systems	3358-TC	ECM
VCAM1	R & D Systems	ADP5	ECM
Vitronectin	R & D Systems	2308-VN	ECM
Biglycan	R & D Systems	2667-CM	ECM
Decorin	R & D Systems	143-DE	ECM
Periostin	R & D Systems	3548-F2	ECM
SPARC/osteonectin	R & D Systems	941-SP	ECM
Thrombospondin-1/2	R & D Systems	3074-TH	ECM
Brevican	R & D Systems	4009-BC	ECM
Elastin	BioMatrix	5052	ECM
Fibrillin	Lynn Sakai Lab OHSU	N/A	ECM
ANGPT2	RnD_Systems_Own	623-AN-025	Ligand
IL1B	RnD_Systems_Own	201-LB-005	Ligand
CXCL8	RnD_Systems_Own	208-IL-010	Ligand
IGF1	RnD_Systems_Own	291-G1-200	Ligand
TNFRSF11B	RnD_Systems_Own	185-OS	Ligand
BMP6	RnD_Systems_Own	507-BP-020	Ligand
FLT3LG	RnD_Systems_Own	308-FK-005	Ligand
CXCL1	RnD_Systems_Own	275-GR-010	Ligand
DLL4	RnD_Systems_Own	1506-D4-050	Ligand
HGF	RnD_Systems_Own	294-HGN-005	Ligand
Wnt5a	RnD_Systems_Own	645-WN-010	Ligand
CTGF	Life_Technologies_Own	PHG0286	Ligand
LEP	RnD_Systems_Own	398-LP-01M	Ligand
FGF2	Sigma_Aldrich_Own	SRP4037-50UG	Ligand
FGF6	RnD_Systems_Own	238-F6	Ligand
IL7	RnD_Systems_Own	207-IL-005	Ligand
TGFB1	RnD_Systems_Own	246-LP-025