Methodenartikel

Productie, zuivering en kwaliteitscontrole voor Adeno-associated Virus gebaseerde vectoren

38.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58960

⸱

29 januari 2019

 ,  ,  ,  , 
1VIB-KU Leuven Center for Brain and Disease Research, 2Department of Neuroscience, KU Leuven, 3Leuven Brain Institute

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een efficiënte en reproduceerbare strategie om te produceren, titer en kwaliteitscontrole batches van adeno-associated virus vectoren. Het stelt de gebruiker om de voorbereiding van een vector met hoge-titer (≥1 x 1013 vector genomen/mL) en een hoge zuiverheid, in vitro of in vivo gebruiksklaar.

Samenvatting

Gene levering hulpmiddelen op basis van adeno-geassocieerde virussen (AAVs) zijn een populaire keuze voor de levering van transgenen aan het centrale zenuwstelsel (CNS), met inbegrip van gen-therapie-toepassingen. AAV vectoren zijn niet-repliceren, kunnen zowel de scheidingslijn en de niet-delende cellen infecteren en op lange termijn transgenic expressie. Nog belangrijker is, sommige serotypen, zoals het zojuist beschreven PHP. B, kan Kruis de bloed-hersen-barrière (BBB) in diermodellen, na systemische levering. AAV vectoren kunnen efficiënt geproduceerd worden in het laboratorium. Robuust en reproduceerbare protocollen zijn echter vereist om te verkrijgen van AAV vectoren met voldoende zuiverheid niveaus en waarden van de titer hoog genoeg voor in vivo toepassingen. Dit protocol beschrijft een efficiënte en reproduceerbare strategie voor AAV vector productie, op basis van een strategie voor de kleurovergang zuivering van iodixanol. De iodixanol zuivering methode is geschikt voor het verkrijgen van batches van hoge-titer AAV vectoren van hoge zuiverheid, in vergelijking met andere methoden van zuivering. Bovendien is het protocol over het algemeen sneller dan andere methoden die momenteel beschreven. Bovendien een kwantitatieve polymerase ketting reactie (qPCR)-gebaseerde strategie wordt beschreven voor een snelle en nauwkeurige bepaling van de vector-titer, evenals een silver kleuring methode om te bepalen van de zuiverheid van de vector-partij. Ten slotte, representatieve resultaten van gene levering aan de CNS, na systemische toediening van AAV-PHP. B, worden gepresenteerd. Dergelijke resultaten moeten mogelijk zijn in alle laboratoria met behulp van de protocollen die in dit artikel beschreven.

Inleiding

In de afgelopen 30 jaar, zijn wild-type AAVs ontworpen om te maken van recombinante AAV vectoren, die hebben bewezen bijzonder nuttige hulpmiddelen voor genenoverdracht naar de CNS1,2,3,4, 5,6 en gen-therapie benaderingen van ziekte (met inbegrip van FDA en EMA-goedgekeurde therapieën)4,7. Hun geschiktheid voor gebruik in het VNV is grotendeels afgeleid van hun vermogen om niet-delende, post mitotische cellen infecteren, meestal te vinden in de CNS-8. AAV gebaseerde vectoren hebben echter ook het voordeel dat een langdurige uitdrukking van een bepaalde therapeutische transgenic4,9 terwijl aanleiding kunnen geven tot een mildere immune reactie in vergelijking met andere virale vectoren7, 8,10,11,12.

De belangrijkste elementen van een vector AAV zijn het genoom en de Eiwitmantel. Wild-type AAVs zijn single-stranded (ss) DNA virussen met een genoom van ongeveer 5 kilobases (kb)13. Voor de productie van recombinante AAV vectoren, de rep en cap genen (nodig voor de replicatie van het genoom en de vergadering van de virale Eiwitmantel) zijn verwijderd uit het genoom van de wild-type AAV en in trans, ruimte wordt gelaten voor een expressie cassette met de transgenic14,15. De omgekeerde terminal herhalen sequenties (ITRs) van het oorspronkelijke virale genoom zijn de enige bewaarde elementen in een vector van AAV, zoals deze zijn essentieel voor replicatie en verpakking3,10,14. AAV vectoren kunnen worden ontworpen om transgenic expressie; een mutatie in één van de ITRs leidt tot de vorming van een haarspeld-lus waarmee effectief de generatie van een complementaire DNA strand3,7,15. Het belangrijkste voordeel van deze configuratie genoemd van het genoom van een zelf-complementaire (sc), is dat het de behoefte aan tweede-onderdeel synthese typisch in de conventionele levenscyclus van AAVs, aanzienlijk verhogen van de snelheid en de niveaus van transgenic expressie mijdt 1. niettemin, met behulp van een scAAV genoom vermindert de capaciteit van de lading van de vector tot ongeveer 2,4 kb. Het gaat hierbij om transgenic sequenties, evenals een regulerende sequenties zoals initiatiefnemers of microRNA-bandplaatsen, uitdrukking aan een bepaalde cel typen16beperken.

De AAV Eiwitmantel bepaalt de vector-host cel interactie en verleent een zekere mate van cel type of weefsel tropisme voor een AAV serotype, die kan ook worden benut om te beperken transgenic expressie aan specifieke locaties. Verschillende AAV serotypen worden gevonden in de natuur, terwijl anderen zijn vervaardigd in laboratoria door middel van recombinant benaderingen (dat wil zeggen, PHP. B). Daarnaast schenken sommige capsids ook andere nuttige kenmerken, zoals de mogelijkheid om over te steken de BBB, resulterend in de levering van transgenen in het centraal zenuwstelsel na systemische toediening. Dit is aangetoond voor AAV9, evenals voor de recent beschreven PHP. B Eiwitmantel17. Dientengevolge, deze serotypen blijken te zijn met name relevant voor nieuwe benaderingen van gen-therapie voor neurodegeneratieve aandoeningen1,17,18.

Het doel van dit protocol is voor het beschrijven van een voordelige methode voor de kleinschalige productie van AAV vectoren met hoge titer en zuiverheid. Hoewel de resultaten gepresenteerd hier gebruik maken van de PHP. B Eiwitmantel en een scAAV expressie cassette, het protocol is geschikt voor de productie van verschillende AAV vector serotypes en genoom configuraties, waardoor maximale experimentele flexibiliteit. Echter, de opbrengst van de vector en de laatste zuiverheid kunnen variëren afhankelijk van het gekozen serotype.

Het protocol zelf is een variant van de klassieke tri-transfectie methode voor de productie van de virale vector en omvat het gebruik van een iodixanol verloop voor vector-opschonen, die in vergelijking met het klassieke gebruik van cesium chloride (CsCl) verlopen, is geweest gemeld aan het produceren van AAV vectoren van hogere zuiverheid in een meer tijd-efficiënte manier19,20,-21.

De transfectie, zuivering en concentratiestappen zijn bedoeld om te worden uitgevoerd overeenkomstig de goede laboratoriumpraktijken (GLP) in een laboratorium van de weefselcultuur voor virale vector werk gewaardeerd. Elke taak moet worden uitgevoerd met inachtneming van de lokale en nationale wetgeving betreffende virale vector productie en gebruik. Werk moet worden uitgevoerd onder de motorkap van een laminaire flow en onder steriele omstandigheden. Binnen de vector-faciliteit, is het aanbevolen om het dragen van een schort lab, naast de reguliere weefselkweek laboratoriumjas. Bovendien moet een dubbele paar handschoenen, evenals kunststof overschoenen, te allen tijde worden gedragen.

Voordat beginnen de vector-productie, zorgen voor alle benodigde apparatuur en plasmiden beschikbaar zijn. 1) pCapsid plasmide bevat de rep -gen dat codeert voor vier niet-structurele eiwitten nodig voor replicatie, namelijk Rep78, Rep68, Rep52 en Rep40, en het GLB -gen dat codeert voor drie Eiwitmantel structurele eiwitten, namelijk VP1 VP2 en VP3. 2) pHelper plasmide bevat de genen E4 E2Aen VA van adenovirus, die AAV productie in HEK293T cellen vergemakkelijken. 3) pTransgene plasmide bevat de transgenic expressie cassette, geflankeerd door twee ITRs. Deze plasmiden kunnen gesynthetiseerd DOVO in het laboratorium met behulp van reeksen beschikbaar online22. Voor plasmiden DOVOgemaakt, is met name de scripts die roman transgenen, sequencing vereist, om ervoor te zorgen dat de transgenic en ITRs juist zijn. Anderzijds kunnen premade plasmiden direct worden verworven via online plasmide repositories. Indien nodig, plasmiden kunnen worden versterkt en gezuiverd met behulp van standaard kits, volgens de fabrikant instructies23.

Vector titer en zuiverheid kunnen nadelig beïnvloeden het vermogen van de transductie van de vector. Aanvullende protocollen worden geleverd om te evalueren van de kwaliteit van de geproduceerde vector. De definitieve vectoren zal zitten nuttig voor studies van de functie cel CNS in zowel in vitro als in vivo toepassingen.

Protocol

OplossingSamenstelling
Celkweek en transfectie
DMEM1DMEM 1 x
1% FBS (v/v)
1% GlutaMAX (v/v)
DMEM10DMEM 1 x
10% FBS (v/v)
1% GlutaMAX (v/v)
150 mM NaCl4.380 g NaCl
Maximaal 500 mL ultrazuiver water
AAV zuivering en ontzouten
5 M NaCl146.1 g NaCl
Maximaal 500 mL ultrazuiver water
1 M Tris-HCl (pH 8,5)12.11 g Tris baseLET OP
Maximaal 100 mL ultrazuiver water
Toevoegen van 1 M HCl met behulp van een pipet van Pasteur terug te brengen van de pH tot 8,5
Lysis-buffermengsel15 mL 5 M NaCl
25 mL van de 1 M Tris-HCl (pH 8,5)LET OP
Maximaal 500 mL ultrazuiver water
10 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)80 g NaCl
2 g KClLET OP
14.4 g nb2HPO4
2.4 g KH2PO4
Maximaal 1 L ddwater
1 M MgCl220.33 g MgCl2-6 H2O
Maximaal 100 mL ultrazuiver water
1 M KCl7.45 g KClLET OP
Maximaal 100 mL ultrazuiver water
5 x PBS Magnesium-kalium (PBS-MK)-stockoplossing250 mL 10 x PBS
2,5 mL 1 M MgCl2
6,25 mL 1 M KClLET OP
Omhoog tot 500 mL Ultrapure water H2O
15% Iodixanol12,5 mL van Optiprep dichtheid kleurovergang mediumLET OP
10 mL NaCl van 5 M
10 mL 5 x PBS-MK
17,5 mL ultrazuiver water
25% Iodixanol20,8 mL van Optiprep dichtheid kleurovergang mediumLET OP
10 mL 5 x PBS-MK
19.2 mL ultrazuiver water
100 µL van fenol rood
40% Iodixanol33.3 mL van Optiprep dichtheid kleurovergang mediumLET OP
10 mL 5 x PBS-MK
6.7 mL ultrazuiver water
60% Iodixanol50 mL Optiprep dichtheid kleurovergang voedingsbodemLET OP
100 µL van fenol roodLET OP
AAV zuiverheid controle
10 x Tris-acetaat EDTA (thee) buffer44.8 g Tris baseLET OP
11.4 mL ijsazijn (17.4M)
3.7 g EDTA
Maximaal 1 L ultrazuiver water
Agarose gel0,8 g Ultrapure agarose
Maximaal 100 mL 1 x thee buffer
Gel-buffer181.7 g Tris baseLET OP
1,5 g SDSLET OP
Breng pH op 8,45 met 1 M HClLET OP
Maximaal 500 mL ultrazuiver water
Kathode buffer 10 x121.14 g Tris baseLET OP
179.2 g TricineLET OP
1% SDS (w/w)LET OP
Maximaal 1 L ultrazuiver water
Anode buffer 10 x242.3 g Tris baseLET OP
Maximaal 1 L ultrazuiver water
Breng pH op 8,9 met 1 M HClLET OP
Monster buffer 5 xVoor 20 mL:
605 mg Tris baseLET OP
4 g SDSLET OP
10 mg Serva blauwe G
12 g Glycerol
PH 6.8 met 1 M HCl, aliquoot aanpassen en opslaan bij-20 ° CLET OP
Stapelen van gelVoor 2 gels:
400 µL acrylamideLET OP
750 µL gel buffer
1.85 mL ultrazuiver water
4 ΜL TEMEDLET OP
20 µL 10% APS (v/v)LET OP
Voeg TEMED en 10% APS onmiddellijk vóór het gieten van de gel. Gebruik beide chemicaliën onder een chemische motorkap.
Oplossen van gelVoor 2 gels:
3,32 mL acrylamideLET OP
3.35 mL gel buffer
1.14 mL ultrazuiver water
2.12 mL 50% glycerol
6 ΜL TEMEDLET OP
50 µL 10% APS (w/v)LET OP
Voeg TEMED en 10% APS onmiddellijk vóór het gieten van de gel. Gebruik beide chemicaliën onder een chemische motorkap.
Water-verzadigd butanol10 mL n-butanolLET OP
1 mL ultrazuiver water
Let op: Raadpleeg de tabel van de materialen voor richtlijnen voor het gebruik van gevaarlijke chemische stoffen.

Tabel 1: Samenstelling van de vereiste oplossingen.

1. Tri-transfectie van HEK293T cellen

Opmerking: Raadpleeg tabel 1 voor de samenstelling van de buffers en oplossingen die in het protocol worden gebruikt.
Opmerking: Uitvoering van dit deel van het protocol duurt ongeveer 4 dagen.

  1. Een flesje van menselijke embryonale nier (HEK) 293T cellen in een waterbad 37 ° C. vastgesteldop ontdooien
    Opmerking: Gebruik alleen de cellen die zijn gepasseerd is minder dan 20 x te garanderen optimale transfectie efficiëntie.
  2. Zaad HEK293T cellen bij een dichtheid van 2 x 10,3 tot 6 x 103 cellen/cm2 in DMEM10 15 cm diameter cel cultuur gerechten.
  3. De cellen groeien tot 70-80% samenkomst in een standaard incubator ingesteld bij 37 ° C, met 95% vochtigheid en 5% CO2.
    Opmerking: De productie van één partij van AAV vectoren met behulp van dit protocol vereist 18 cel cultuur gerechten (15 cm diameter). Een cel samenloop van 70% - 80% komt overeen met 6 x 10,3 tot 7 x 103 cellen/cm2, gehandhaafd in 17 – 20 mL DMEM10 kweekmedium.
  4. Polyethylenimine (PEI) bereiden / DNA mix met een concentratie-verhouding van 1/3.5 (w/w).
    1. De DNA-mix voorbereiden door 18 gerechten van de cultuur van de cel in een 50 mL conische buis door het mengen van 360 µg pΔF6, 180 µg voor pCapsid en 180 µg van pTransgene in 18 mL 150 mM NaCl.
    2. Verdeel de mix van DNA over drie 50 mL conische buizen (6 mL DNA mix per conische buis).
    3. Bereiden de PEI-mix voor zes cel cultuur gerechten in een nieuwe conische tube van 50 mL door het mengen van 840 µg PEI (1 µg/µL) in 6 mL 150 mM NaCl.
    4. Bereiden de PEI/DNA mix door toevoeging van 6 mL van de PEI mix (bereid in stap 1.4.3), druppel voor druppel, aan één van de conische buisjes die bevatten de DNA-mix (bereid in stap 1.4.2) en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
      Opmerking: Na 20 min van incubatie, zal de PEI/DNA mix enigszins troebel worden.
  5. Neem zes gerechten van de cultuur van de cel uit de incubator en volledig gecombineerd het medium van elke cultuur schotel in een laminaire flow-kap. Verwijder de sporen van het medium door het spoelen van de gerechten met 5 mL voorverwarmde Dulbecco-fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS).
  6. Zorgen voor de verdeling van DPBS over het gehele oppervlak door het kantelen van de schotel voorzichtig.
  7. De DPBS gecombineerd en zachtjes 12 mL van DMEM1 aan elk gerecht toevoegen.
    Opmerking: Vermijd het loskoppelen van de cellen door het toevoegen van het medium langzaam, van een pipet geplaatst aan de rand van de schotel.
  8. Meng de PEI/DNA door pipetteren op en neer 3 x - 5 x. Voeg 2 mL van het mengsel van PEI/DNA aan elk van de zes cel cultuur gerechten in een mode-druppelsgewijs, u het zorgvuldig verspreidt over het gehele oppervlak. Zodra de mix wordt toegevoegd aan elk gerecht, plaats u de gerechten terug in de incubator. Herhaal stappen 1.4.3– 1.8 voor de resterende cultuur gerechten.
  9. Incubeer de transfected cellen gedurende 5 uur bij 37 ° C, met een luchtvochtigheid van 95% en 5% CO2.
  10. Toevoegen van een extra 12 mL van DMEM10 aan elk gerecht cultuur zonder het verwijderen van het bestaande medium (total Mediuminhoud = 25 mL).
  11. Incubeer transfected cellen omhoog naar de post transfectie 72 uur bij 37 ° C, met 95% vochtigheid en 5% CO2.

figure-protocol-1
Aanvullende figuur 1: HEK 293T cel morfologie gevisualiseerd door fase contrast microscopie (links) met bevestiging van GFP meningsuiting gevisualiseerd door fluorescentie imaging (rechts). (A) succesvol transfectie van HEK293T cellen met een pTransgene van GFP-codering wordt bevestigd door fluorescentie imaging. (B) HEK293T cellen uitsluitend behandeld transfectie reagentia Toon geen GFP-expressie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

  1. De oogst van het medium en de cellen 72 h na transfectie. Gebruik een cel schraper om zorgvuldig de cellen uit de cultuur-Schotel los te maken. Het verzamelen van het medium en de cellen in een conische tube van 50 mL, gehouden op het ijs.
    Opmerking: De inhoud van twee cellen cultuur gerechten kunnen worden verzameld in een enkele 50 mL conische buis. Aan het eind van deze stap, zal elk van de negen buizen ongeveer 50 mL medium bevat.
  2. Centrifugeer de conische buisjes bij 420 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C met de versnelling en vertraging van de centrifuge ingesteld op maximaal.
  3. Zorgvuldig Verwijder het supernatant van elke buis. Gebruik geen pipetten om te voorkomen dat het verlies van materiaal. In plaats daarvan, zachtjes giet het supernatant in een afval container en plaats de buizen met de cel pellets terug op het ijs.
  4. Resuspendeer de pellet van elke cel in 2 mL lysisbuffermengsel rechtstreeks in de conische tube van 50 mL door pipetteren op en neer 5 – 10 x. Doen niet vortex. Zwembad de lysates uit drie buizen samen.
    Opmerking: Op dit punt, zal er drie 50 mL conische buizen, elke één met 6 mL geresuspendeerde cellen in lysis-buffermengsel.

2. AAV Vector zuivering

Opmerking: Uitvoering van dit protocol deel duurt ongeveer 1 dag. De volgende stappen tegelijkertijd uitvoeren op elk van de drie 50 mL conische buisjes met de geresuspendeerde in lysis-buffermengsel cellen (Zie de vorige opmerking).

  1. Bevriezen en ontdooien van de geresuspendeerde cellen 3 x lyse hen en laat de AAV-deeltjes. De bevriezing stap uitvoeren door het plaatsen van de buizen in een emmer met droogijs vermengd met ethanol. Uitvoeren ontdooien door onmiddellijk het plaatsen van de cellen in een waterbad bij 37 ° C. instellen
  2. Na de derde dooiende stap, centrifugeer bij 1.167 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C.
    Opmerking: Een merkbare pellet samengesteld uit cel puin zal worden gevormd. Bij de behandeling van de buizen, Vermijd plotselinge bewegingen zoals deze kunnen veroorzaken van het detachement van de pellet in het supernatant, waardoor de zuiverheid van de finale vector in gevaar zal komen.
  3. Zorgvuldig overbrengen het supernatant om 50 mL conische buizen schoon te maken en voeg vervolgens nuclease aan elke buis, om een eindconcentratie van 50 U/mL bezinken.
  4. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Swirl de conische buisjes van 50 mL met de hand elke 10 min om ervoor te zorgen dat de nuclease grondig wordt gemengd met de bovendrijvende substantie.
  5. De bovendrijvende substantie te verduidelijken door middel van centrifugeren bij 13,490 x g gedurende 20 min bij 4 ° C.
  6. Een 0,45 µm filter koppelen aan een 10 mL spuit en plaats deze op de top van een schone 50 mL conische buis. Verwijder de plunjer voorzichtig en vul de injectiespuit met het supernatant uit stap 2.5.
  7. Gebruik de zuiger te dwingen de lysate door het filter. Een nieuwe filter- en spuit gebruiken voor elke buis van supernatans verkregen in stap 2.5.
    Opmerking: De verkregen fractie staat bekend als 'ruwe lysate'.
  8. Elk van de 15%, 25%, 40% en 60% iodixanol-gehalten in vier aparte 50 mL conische buisjes, te bereiden volgens de aanwijzingen van tabel 1.
  9. De hellingen van de iodixanol in drie ultracentrifugatie buizen met behulp van de volgende volgorde van iodixanol breuken bereiden: 8 mL 15% iodixanol, 5,5 mL 25% iodixanol en 40% iodixanol 5 mL 4.5 mL van 60% iodixanol.
    Let op: Iodixanol kan irritatie aan ogen, huid en de gastro-intestinale en respiratoire traktaten. Bij het verwerken van iodixanol verlopen, Draag handschoenen en werken onder de motorkap van een laminaire flow.
    1. Pipetteer 8 mL 15% iodixanol in elke buis ultracentrifugatie.
    2. Pipetteer 5,5 mL van 25% iodixanol-oplossing in een schone 50 mL conische buis (figuur 1A).
    3. Gebruik een niet-afgestudeerd Pasteur Pipet (zoals de hals van de ultracentrifugatie buis te smal voor conventionele pipetten is) aan zorgvuldig laag 5,5 mL van de oplossing iodixanol 25% onder de 15% iodixanol-oplossing (figuur 1B).
      Opmerking: Dit kan met succes worden bereikt door het toevoegen van de iodixanol in drie stappen, omdat de Pipet van Pasteur slechts ongeveer 2 mL kan volhouden.
    4. Het toevoegen van de 40% en 60% iodixanol oplossingen zoals beschreven in stap 2.9.3. De verschillende iodixanol interfaces niet storen tijdens gelaagdheid.
      Opmerking: De juiste voorbereiding van de verschillende iodixanol breuken kan worden gewaarborgd door visuele bevestiging dankzij de fenol rode toegevoegd aan de iodixanol breuken (Zie de instructies in tabel 1). Aangezien elke breuk een specifieke dichtheid heeft, zij zal niet intermix tijdens de gelaagdheid stap, als het goed wordt uitgevoerd (Zie Figuur 1 c).
  10. De ruwe lysate bovenop het verloop van de iodixanol van 15% met een pipet van Pasteur laag. Drop door drop om verstoring van de interface tussen de ruwe lysate en de iodixanol oplossing gaan.
  11. Vul de ultracentrifugatie buis met lysis-buffermengsel totdat de meniscus bereikt de basis van de hals van de buis om ervoor te zorgen dat de buis niet instort onder de zeer hoge krachten gegenereerd tijdens de ultracentrifugatie (Figuur 1 c).
  12. Sluit de ultracentrifugatie buizen met behulp van passende deksels. Gebruiken een digitale schaal om ervoor te zorgen dat alle drie ultracentrifugatie buizen hebben hetzelfde gewicht. Pas het gewicht, indien nodig, door het toevoegen van meer lysis-buffermengsel bovenop de 'ruwe lysate'.
    Opmerking: Het gewicht verschil tussen de buizen ultracentrifugatie dient zich onder 0.1 g voor de veilige werking van de ultracentrifuge. Ultracentrifuges potentieel gevaarlijke stukken van materiaal zijn en mag alleen worden gebruikt door goed opgeleid personeel.
  13. Centrifugeer de buizen 301,580 x gmet behulp van een vaste-hoek titanium rotor, gedurende 1 uur en 40 minuten bij 12 ° C, met behulp van de maximumsnelheid van versnelling en vertraging.
  14. Steek voorzichtig een roestvrij stalen botte naald op de 40% en 60% iodixanol interface.
    1. Bevestig de naald op een 5 mL-spuit (figuur 1E).
    2. Alleen de duidelijke breuk, met de vector deeltjes gecombineerd.
      Opmerking: Het totale volume verzameld is ongeveer 2,5-3 mL. Vermijd het verzamelen van materiaal vanuit de interface van 25-40%, aangezien dit het niveau van verontreiniging in de finale vector-partij, als gevolg van de aanwezigheid van niet-wenselijk eiwitten zal toenemen.
    3. Verwerken van de verzamelde fractie (ontzouten en concentratie) of het 's nachts te bewaren bij 4 ° C.

figure-protocol-2
Figuur 1: opstelling voor kleurovergang zuivering van iodixanol en latere vector collectie. (A) vóór het verlopen van de verschillende iodixanol in de buis ultracentrifugatie pipetteren, Pipetteer een voldoende volume van de oplossing van elke iodixanol in een aparte conische buis. (B) vervolgens gebruik een Pasteur Pipetteer sequentieel overbrengen van elke oplossing van de iodixanol naar de ultracentrifugatie buis: lagen van een steeds hogere iodixanol concentratie moeten worden toegevoegd aan de onderkant van de buis onder de vorige lagen. (C) laag de ruwe vector lysate bovenop eens het verloop is opgesteld. Dit systeem voor het verzamelen van vector gebruikt geen scherpe naalden, die het gevaar van ' prikaccidenten '. (D) een roestvrij staal 316-spuit naald wordt ingebracht via het verloop van de iodixanol tot de 40% / 60% iodixanol-interface. (E) Vector deeltjes zijn te vinden in de fase van het iodixanol van de 40% en zijn verzameld. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

3. ontzouten en concentratie van de Vector AAV

Opmerking: Uitvoering van dit deel van het protocol duurt ongeveer 2 h.

  1. Prerinse het membraan van de filter van de centrifugaal filteren door toevoeging van 5 mL 1 x PBS-MK en Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 4000 x g.
  2. Voeg 5 mL 1 x PBS-MK op de verzamelde AAV vector breuk, meng en voeg vervolgens het totale volume aan het filter. Bij toevoeging van 1 x PBS-MK, troebelheid wordt waargenomen. Centrifugeer bij 4000 x g tot het volume aanwezig is op de kegel-vormig filter is teruggebracht tot 1 mL. Gooi de doorstroom in de collectie van de buitenste buis opgebouwde.
  3. Voeg 13 mL 1 x PBS-MK naar de kegelvormige filter en herhaal het centrifugeren stap zo vaak als nodig (minimaal 3 x), er is geen meer troebelheid waargenomen wanneer vers 1 x PBS-MK wordt toegevoegd.
  4. In de finale wassen stap en voeg 13 mL PBS + 0,01% (v/v) niet-ionogene oppervlakteactieve stof en centrifuge op 4000 x g totdat het volume wordt gereduceerd tot 300-350 µL.
  5. Het verzamelen van de resterende fractie aanwezig op het filter waarbij het hele volume in een buis van steriele skirted microcentrifuge eveneens.
    Opmerking: Dit gedeelte bevat de ontzout en geconcentreerde AAV-vector. In de volgende stappen van dit protocol, is dit gedeelte bedoeld als de 'primaire' breuk. Zorg ervoor dat de buis onder de motorkap te verwerken en op te slaan bij 4 ° C.
  6. Spoelen van het filter met 200 µL van 1 x PBS-MK voor het verzamelen van de resterende vector deeltjes op het filter behouden. Verzamelen in een steriele microcentrifuge buis.
    Opmerking: Dit is een voorraad van verdunde vector, die geschikt is voor sommige toepassingen vereisen lager vector titers kan zijn. In toekomstige stappen, is dit gedeelte bedoeld als de "secundaire" breuk.
  7. Voor korte termijn opslag, slaan de vector fraction(s) bij 4 ° C (minder dan 2 weken). Aliquot en winkel de vector bij 20 ° C wanneer langdurige opslag vereist is.
  8. Kwaliteitscontrole uitvoeren zoals beschreven in sectie 4.

4. titratie van de Vector door kwantitatieve Polymerase-kettingreactie

Opmerking: Uitvoering van dit deel van het protocol duurt ongeveer 3 uur.

  1. Standaard curve
    1. Linearize het uitdrukken van transgenic plasmide (pTransgene) gebruikt voor de transfectie van HEK-293T cellen in sectie 1.
    2. Voorbereiden van de beperking digest mix in een tube van 0,5 mL microcentrifuge (Zie tabel 2 voor de samenstelling van de beperking digest mix).
      Opmerking: Aanpassen van de samenstelling van de beperking digest mix volgens het enzym gebruikt en de verwante richtlijnen van de fabrikant.
    3. Incubeer de beperking digest mix gedurende 1 uur bij 37 ° C.
    4. Controleer de efficiëntie van de beperkingsspijsvertering door de gelineariseerde plasmide uit te voeren op een agarose gel van 0,8% (m/v) bij 100 V voor de volledige spijsvertering 1 h. van de plasmide moet produceren een één fragment van gedefinieerde grootte.
    5. Zuiveren van de lineaire plasmide DNA met behulp van een PCR zuivering kit, na24van de instructies van de fabrikant, en de concentratie van DNA met een spectrofotometer meten door het meten van de absorptie bij 260 nm. Na de titratie, slaat u de resterende hoeveelheid de lineaire plasmide bij 20 ° C voor verder gebruik.
    6. De moleculen (d.w.z. DNA kopieën) van de voorraad van de plasmide per microliter als volgt berekenen.
      1. Eerst berekenen het molecuulgewicht van de plasmide. Ervan uitgaande dat het gemiddelde gewicht van een DNA-basenpaar (bp) 650 Dalton (Da is) en dat één mol van een bp 650 g weegt, kan het molecuulgewicht van elke sjabloon double-stranded DNA door middel van het product van de lengte (in bp) en het gewicht per basenpaar worden geschat.
        Plasmide moleculair gewicht [g/mol] = plasmide grootte [bp] x 650 [Da/bp]
      2. Vervolgens berekent het aantal mol van plasmide per microliter.
        Mol plasmide per microliter = plasmide concentratie [g/µL] / plasmide moleculair gewicht [g/mol]
        Opmerking: De inverse van het moleculair gewicht is het aantal mol van plasmide aanwezig in 1 g van het materiaal.
      3. Vervolgens berekent het aantal plasmide moleculen per microliter, met behulp van Avogadro van nummer (6.022 x 1023 moleculen/mol).
        Moleculen van plasmide per microliter = mol plasmide per microliter [mollen/µL] x Avogadro van nummer [moleculen/mol]
      4. Ten slotte, Verdun de plasmide voorraad (moleculen/µL) om op te halen een 100 µL-oplossing met de gewenste concentratie van 1 x 109 moleculen (vector genoom (vg) per microliter).
        Plasmide voorraad (100 µL) = (gewenste concentratie [moleculen/µL] x 100 µL) / plasmide moleculen [moleculen/µL]
    7. Maak seriële verdunningen van de plasmide voorraad (1 x 109 vg/µL) in triplicates:
      10 µL van 1 x 109 vg/µL plasmide voorraad + 90 µL van H2O = 1 x 108 vg/µL oplossing
      10 µL van verdunning 1 x 108 vg/µL + 90 µL van H2O = 1 x 107 vg/µL oplossing
      10 µL van 1 x 107 vg/µL verdunning + 90 µL van H2O = 1 x 106 vg/µL oplossing
      10 µL van 1 x 106 vg/µL verdunning + 90 µL van H2O = 1 x 105 vg/µL oplossing
      Blijven een 1 x 101 vg/µL oplossing te verkrijgen.
    8. Houden de seriële verdunningen van de standaard plasmide voorraad op ijs totdat ze worden geladen op de qPCR plaat (paragraaf 4.3).
ComponentBedrag
10 x restrictie-enzym buffer5 ΜL
Restrictie-enzym2,5 ΜL
Plasmide5 µg
H2Omaximaal 50 µL

Tabel 2: Beperking digest mix samenstelling.

Tabel 3: voorraad plasmide volume rekenmachine. Klik hier om te downloaden van deze tabel.

  1. DNA-extractie uit de AAV-vector
    1. Meng 2 µL van de AAV vector voorraad (de primaire fractie uit stap 3.5) met 198 µL van DNase ik buffer (1 x) in strip buizen (PCR buizen) en voeg 2 µL van DNase ik.
      Opmerking: DNase die ik genetische materiaal dat niet is opgenomen in een vector Eiwitmantel degraderen zal (die zou verstoren de qPCR resultaten). Deze oplossing is verdunning 'dil1 x 10-2' genoemd.
    2. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C, gevolgd door 10 min bij 95 ° C.
      Opmerking: Het protocol op dit punt kan worden gestopt en het materiaal kan worden opgeslagen voor onbepaalde tijd bij 4 ° C, om te voorkomen dat de verslechtering van het product.
    3. Voeg 2 µL van proteïnase K aan de oplossing van de dil1 x 10-2 (step 4.2.1) en incubeer gedurende 60 min bij 50 ° C, gevolgd door 20 min bij 95 ° C.
      Opmerking: Deze stap zal de AAV vector Eiwitmantel demonteren en introductie van het genoom van AAV vector in de oplossing. Add proteïnase K in overmaat het eiwit (Eiwitmantel) inhoud van het monster is niet bekend. Opmerking, het is essentieel om ervoor te zorgen dat alle proteïnase K-activiteit wordt verwijderd door denaturatie, voorafgaand aan de qPCR, om problemen te vermijden met aantasting van de (gedeeltelijke) polymerase beïnvloeden het eindresultaat.
    4. Maak 1:10 seriële verdunningen van het proteïnase K behandeld dil1 x 10-2 oplossing (stap 4.2.3) in 1,5 mL microcentrifuge buizen als volgt:
      10 µL van dil1 x 10-2 + 90 µL van H2O = dil1 x 10-3 verdunning
      10 µL van dil1 x 10-3 + 90 µL van H2O = dil1 x 10-4verdunning
      10 µL of dil1 x 10-4 + 90 µL van H2O = dil1 x 10-5 verdunning
    5. Houd de seriële verdunningen van DNA geëxtraheerd uit de vector op ijs totdat ze worden geladen op de qPCR plaat (paragraaf 4.3).
  2. Titratie door SYBR Green detectie gebaseerde qPCR
    1. De master mix van qPCR in een 1,5 mL microcentrifuge buis, voorbereiden van zowel de normen als het monster. Gebruik 10 µL van SYBR Green Master Mix, 1 µL van voorwaartse primer (voorraad 10 µM), 1 µL van omgekeerde primer (10 µM stock) en 3 µL van H2O per reactie. Zie het protocol in tabel 4 voor primer sequenties.
    2. Pipetteer de master mix van qPCR omhoog en omlaag, maar niet niet vortex.
    3. Voeg 15 µL van de master mix van qPCR, gevolgd door ofwel 5 µL van de standaard curve bereid in punt 4.1 of het DNA geëxtraheerd uit de AAV-vector in punt 4.2, in elk putje. Omvatten drie putten met alleen de qPCR master mix, als een negatieve controle. Zie Figuur 2 voor de lay-out van de plaat.
    4. Afdichting van de plaat met een verzegeling film en kort centrifugeren de qPCR plaat bij 1.500 x g gedurende 30 s bij 4 ° C.
    5. Voer de qPCR reactie op een plaat gebaseerde real-time PCR versterking en opsporing instrument, met behulp van de voorwaarden die in tabel 5wordt voorgesteld.
De naam van de primerVolgorde
Voorwaartse primer5'-CCCACTTGGCAGTACATCAA-3'
Omgekeerde primer5'-GCCAAGTAGGAAAGTCCCAT-3'

Tabel 4: Primer sequenties ontworpen jegens de organisator CBA.

figure-protocol-3
Figuur 2: plaat lay-out voor qPCR gebaseerde vector titratie. De monsters zijn kleurgecodeerde: groen = standaard curve; blauw = H2O controle; grijs = primaire Fractie; Oranje = secundaire Fractie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

StapTijdTemperatuurCycliDoel
Pre-incubatie5 min95 ° Cx1DNA denaturatie- en polymerase activering (hot-start reactie).
Amplificatie10 min95 ° Cx1Versterking van het DNA. Instellingen kunnen worden geoptimaliseerd als alternatieve inleidingen met verschillende onthardende temperatuur worden gebruikt.
10 s95 ° Cx40
40 s60 ° C
1 s72 ° C
Koeling10 s40 ° Cx1Plaat koeling. Einde van de PCR.

Tabel 5: Thermische fietsen protocol voor SYBR groen gebaseerde qPCR titratie.

  1. Data-analyse om te bepalen van de titer van de vector AAV
    1. Vul de gegevens werkbladcellen (tabel 6A) met de Ct-waarden voor de verschillende verdunningen van het standaardmonster in sectie 4.1 voorbereid voor het genereren van een standaard curve verkregen.
      Opmerking: De vergelijking van de standaard curve wordt getoond (y = een ln (x) + b) samen met de R2 efficiëntie (tabel 6B). Een qPCR moet hebben een rendement van bijna 100% en R2 dicht bij 1.0 (≥ 0,96).
    2. Gebruik de berekende waarden voor a en b te vullen in de corresponderende gegevenscellen in het werkblad (tabel 6 c).
    3. Vul het werkblad met de Ct-waarden voor de verschillende verdunningen van het monster van de AAV bereid in punt 4.2 verkregen.
    4. Bereken de gemiddelde AAV vector titer in vector genomen per microliter van de 'primaire breuk' met behulp van de volgende formule:
      figure-protocol-4
      Opmerking: de factor 400 wordt gebruikt voor één gestrande genomen, terwijl sc genoom een vermenigvuldigingsfactor van 200 gebruiken25. In feite, als DNA hoeveelheden dubbele tijdens elke cyclus van de qPCR, sc die DNA is gedetecteerd 2 x in vergelijking met een ss-genoom. Het doel van de titratie is het berekenen van de concentratie in termen van vector genomen per microliter. Er is een correctie nodig voor het uitvoeren van de qPCR bij gebruik van 2 µL van de grondstof (stap 4.2.1). DIL vertegenwoordigt de verdunningsfactoren uit stap 4.2.4. De titer van de "secundaire" AAV vector breuk (stap 3.6) kan gelijktijdig worden berekend.

Tabel 6: sjabloon voor data-analyse van qPCR. Klik hier om dit bestand te downloaden.

5. zuiverheid controle door SDS-pagina en zilveren kleuring

Opmerking: Uitvoering van dit deel van het protocol duurt ongeveer 5 uur.

  1. 70% (v/v) ethanol grondig schoon de glazen platen gebruikt voor het gieten van de gels te gebruiken
  2. Monteer de gel gieten systeem. Zorg ervoor dat de onderkant van de glazen platen niet gechipt zijn, om te voorkomen lekkage van het mengsel van acrylamide bij het gieten van de gel.
  3. Het stapelen en het oplossen gel oplossingen in twee aparte 50 mL conische buisjes voorbereiden. Het weglaten van de tetramethylethylenediamine (TEMED) en de 10% (m/v) ammonium persulfate (APS), zoals zij verantwoordelijk voor de polymerisatie van de gel zijn. Voeg ze onmiddellijk vóór het gieten van de gel.
    Opmerking: Het definitieve percentage van acrylamide in de gel van invloed op het profiel van de scheiding van de eiwitten: meestal een eindconcentratie van 10% (v/v) van acrylamide zullen volstaan om te testen van de zuiverheid van een AAV vector voorbereiding.
  4. Meng voorzichtig door het wervelende de buis die de gel-componenten bevatten. Doen niet vortex, omdat buitensporige oxygenatie polymerisatie kan schaden.
  5. TEMED en 10% (m/v) APS aan het oplossen gel-oplossing toevoegen. Meng en giet in de gel houder totdat zij 1-2 cm onder de bovenkant van de kleine glazen plaat tot.
  6. Plaats een laagje water verzadigde butanol op de bovenkant van het acrylamide-mengsel. Dit zal ervoor zorgen dat de vorming van een plat oppervlak tijdens de polymerisatie. Laat de gel onder alcohol langer dan 30 minuten niet zal uitdrogen van de gel en afbreuk doen aan haar functie.
    Let op: Butanol is gevaarlijk in geval van contact met de huid. Het vormt ook een brand risico. Voorzichtig behandelen.
  7. Wachten op de gel te polymeriseren en vervolgens giet af de butanol. Tip: Controleer om te zien of de mix van de overtollige gel in de buis gestold is. Polymerisatie vindt plaats in minder dan 20 min. wassen het oppervlak van de gel met H2O en vervolgens droog met keukenpapier, verzorgen niet te verstoren van het oppervlak van de gel.
  8. Voeg TEMED en 10% (m/v) APS aan de stapelvolgorde gel en giet de gel in de gel-houder bovenop de scheitrechter gel.
  9. Plaats de meegeleverde kam in de gel. Deze actie met een gestage beweging om te voorkomen dat de vorming van luchtbellen in de putjes uitvoeren.
  10. Wacht minstens 20 min voor de gel te polymeriseren. Tip: Controleer dat als de overtollige gel mix in de conische buis heeft verhard.
  11. Voorbereiden van de twee mixen (tabel 7) voor zowel de primaire als de secundaire AAV vector breuken (stappen 3.5 en 3.6, respectievelijk).
Hoog gehalteLage bedrag
AAV vector voorraad5 ΜL1 ΜL
5 x monster buffer3 ΜL3 ΜL
H2O7 ΜL11 ΜL

Tabel 7: Samenstelling van de steekproef mixen vereist voor Zilveren kleuring.

  1. De monster mixen volledig te denatureren door verhitting hen gedurende 5 min bij 95 ° C. Monteer de elektroforese tank, met aandacht voor de oriëntatie van de elektrode.
  2. Vul de tank met 1 x kathode buffer aan de binnenkant van de elektrode vergadering en 1 x anode buffer aan de buitenkant.
    Opmerking: De Anode buffer kan worden gerecycleerd uit run-to-run. Verse kathode buffer moet altijd worden gebruikt.
  3. Verwijder van de kam van de gel en reinig de putten van de gel met 1 x kathode buffer.
  4. Laden 1 µL van eiwit ladder in een put. Laden van de monster-mixen in verschillende putjes op het zelfde gel (figuur 3). De gel op 50 V uitvoeren, totdat de monsters het oplossen gel invoert. Verhoog de spanning tot 100 V tot de voorkant van de kleurstof de ondergrens van de gel bereikt.
  5. Pak de gel zorgvuldig uit de glazen platen en gebruik het zilver kleuring kit (volgens de fabrikant instructies26) om te visualiseren de virale eiwitten (VP1 en VP2 VP3 subeenheden) waaruit de AAV Eiwitmantel, evenals over controleren voor mogelijke eiwit besmetting (figuur 3).

figure-protocol-5
Figuur 3: evaluatie van de zuiverheid van de vector met behulp van SDS-pagina en zilveren kleuring. Met behulp van een Tricine-SDS-gel, 5 µL van diverse vector bereidingen werden gescheiden. Eiwitten werden later ontdekt door zilveren kleuring. Vectoren worden beschouwd als pure wanneer VP1 (82 kDa), VP2 (67 kDa), en VP3 (60 kDa) zijn zichtbaar in een 1:1:10 verhouding lane (1), zonder buitensporige achtergrond (lane 2) of niet-specifieke banden (lane 3). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Resultaten

AAV9 werd overwogen, tot voor kort als de meest effectieve AAV vector serotype in overschrijding van de BBB en transducing van cellen van het centraal zenuwstelsel, na de perifere toediening. Een belangrijke stap vooruit in Eiwitmantel ontwerp werd bereikt toen Deverman et al. rapporteerde het gebruik van een Eiwitmantel selectiemethode Cre recombinatie gebaseerde AAV-gerichte evolutie (maken)17genoemd. Met behulp van deze methode, zij een nieuwe Eiwitmantel, genaamd PHP geïdentificeerd. B, die zij als kundig voor de meerderheid van astrocyten en neuronen in meerdere regio's van CNS, na systemische injectie17transduce gemeld. Op dit punt, het moet worden opgemerkt dat hoewel PHP. B biedt positieve resultaten in C57/Bl6 muizen (dat was de stam in de eerste isolatie-experimenten), voorlopige rapporten suggereren dat de doeltreffendheid ervan kan variëren in een stam-afhankelijke manier. Verdere experimenten zal ongetwijfeld meer licht werpen op deze kwestie31.

Echter, ondanks deze problemen, PHP. B biedt spannende mogelijkheden voor het manipuleren van de noninvasive gen in het VNV van muizen, met inbegrip van proof-of-concept gene therapie experimenten in ziekte modellen. Als zodanig, kozen we voor de evaluatie van de efficiëntie van transgenic expressie met behulp van PHP. B versus AAV9, dat is de vector van de 'gouden standaard' voor CNS transductie na toediening van de perifere sinds 20092. Voor het uitvoeren van een directe vergelijking van beide serotypes, onder optimale omstandigheden voor transgenic expressie, gebruikten we een sc genoom configuratie32. Beide vectoren droeg de transgenic voor de groen fluorescente proteïne (GFP) onder de controle van de alomtegenwoordige kip β-actine (CBA) promotor. Vrouwelijke C57/Bl6 muizen op postnatale dag 42 (ongeveer 20 gram in gewicht) ontvangen een dosis van 1 x 1012 vg per muis van beide scAAV2/PHP. B-CBA-GFP of scAAV2/9-CBA-GFP. Vector beheer was uitgevoerd via staart veneuze injectie. De experimenten werden goedgekeurd door de ethische commissie van de KU Leuven.

Drie weken postinjection, de muizen onderging transcardial perfusie met ijskoude PBS, gevolgd door 4% (m/v) ijskoude paraformaldehyde (PFA). Hun hersenen zijn geoogst en onderging verdere postfixation door een overnachting incubatie in de dezelfde fixeer, vóór de overbrenging tot 0,01% (g/v) nb-azide/PBS voor opslag tot verdere analyse. Daarna, de hersenen zijn gesegmenteerd met behulp van een vibrerende microtoom, en immunohistochemistry werd uitgevoerd op 50 µm dik secties.

Om te beoordelen van de niveaus van transgenic expressie, secties met primaire antilichamen tegen GFP (konijn anti-GFP), werden gekleurd met detectie met behulp van secundaire antilichamen zijn geconjugeerd aan een fluorescerende kleurstof (anti-konijn Alexa Fluor 488) (figuur 4A, B ). Fluorescentie intensiteit metingen (in willekeurige eenheden [au]) bevestigd dat een aanzienlijke toename van de GFP expressie wanneer een sc genoom en de PHP. B Eiwitmantel werden gebruikt ten opzichte van AAV9. GFP stijgingen werden waargenomen in de hersenen (2105 ± 161 vs. 1441 ± 99 au; p = 0.0032), het cerebellum (2601 ± 196 vs. 1737 ± 135 au; p = 0.0032), en de hersenstam (3082 ± 319 vs. 2485 ± 88 au; p = 0.0038) (figuur 4C).

figure-results-1
Figuur 4: systemische levering van scAAV2/PHP. B-CBA-GFP leidt tot een hoge GFP-expressie in het VNV. scAAV2/PHP. B-CBA-GFP of scAAV2/9-CBA-GFP (1 x 1012 vg/muis) werd toegediend aan 6-weken oude C57/Bl6 muizen via staart veneuze injectie. GFP werd ontdekt met behulp van immunohistochemistry op coronale hersenen secties 3 weken postinjection. (A) het cerebrum en (B) de kleine hersenen en hersenstam worden getoond. Schaal bars = 1 mm. (C) de kwantificering van de fluorescentie van de relatieve intensiteiten werd uitgevoerd om te bepalen van de niveaus van GFP signaal bereikt met elke vector (10 secties per muis; drie muizen per vector groep). Een one-way ANOVA test werd uitgevoerd, gevolgd door een tweezijdige Student t-test; de gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaardafwijking; p < 0,01; au. willekeurige eenheden. pCapsid, gebruikt voor de productie van de vector van AAV, bevat het gen rep van serotype 2 en het gene GLB van serotype PHP. B of AAV9, dienovereenkomstig. Dit cijfer is gewijzigd van Rincon et al.32. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussie

De productie van recombinante vectoren van AAV beschreven hier gebruik materialen en uitrusting die gemeenschappelijk zijn voor de meeste moleculaire biologie labs en cel cultuur faciliteiten. Het stelt de gebruiker te verkrijgen pure, preklinische rang AAV vectoren die richten op meerdere cel- en weefseltransplantaties typen in een heel scala van in vitro en in vivo toepassingen kunnen worden gebruikt. Een van de grootste voordelen van dit protocol, in vergelijking met anderen (dat wil zeggen, CsCl gebaseerde zuivering), is de kortere werktijd nodig. Kant-en-klare AAV vectoren zijn verkrijgbaar in maximaal 6 werkdagen na de initiële transfectie van HEK293T cellen.

Verschillende factoren kunnen negatieve invloed hebben op de uiteindelijke opbrengst of de kwaliteit van de AAV-vector. Arme transfectie efficiëntie is een van de belangrijkste redenen voor een lage virale opbrengst33. Een belangrijke aanbeveling is het gebruik van HEK293T cellen, die hebben niet meer dan 20 keer gepasseerd zijn en hoeft niet een cel samenloop groter is dan 90% op het moment van transfectie21. Bovendien, heeft de methode van de transfectie gekozen een grote invloed op de resultaten. Dit protocol is gebaseerd op het gebruik van PEI. PEI is een kationische polymeer met de mogelijkheid om het leveren van exogene DNA aan de celkern door middel van de generatie van complexen van polymeer en nucleic zuur, bekend als polyplexes, die in beslag zijn genomen door de cel en verhandelde via Endosomen34. PEI gebaseerde transfectie is gemakkelijk en snel uit te voeren, in tegenstelling tot andere veelgebruikte methoden, zoals het co neerslaan van DNA met calciumfosfaat35. PEI gebaseerde transfectie is ook veel goedkoper in vergelijking met andere onlangs ingevoerde methoden, zoals het gebruik van kationische lipiden en magneet-gemedieerde transfectie36.

De zuivering strategie speelt een sleutelrol in het protocol. Vergeleken met andere methoden, neiging iodixanol gebaseerde zuivering om een hoger percentage van lege virale deeltjes (20%)20bevatten. Dit wordt gecompenseerd, tot op zekere, door het feit dat iodixanol gebaseerde zuivering routinematig in AAV vector preparaten met een deeltje-naar-infectiviteit-verhouding van minder dan 100 resulteert. Dit betekent een aanzienlijke verbetering in vergelijking met conventionele CsCl gebaseerde procedures, waarvoor aanzienlijke verlies van deeltje infectiviteit gerapporteerde37is. Een andere gemeenschappelijke alternatieve methode voor het zuiveren van AAV vectoren is chromatografie-gebaseerde zuivering. Echter, deze methode heeft het grote nadeel dat een bepaalde kolom vereist voor elke vector Eiwitmantel gebruikt is: bijvoorbeeld, terwijl AAV2 klassiek geïsoleerd met behulp van heparine kolommen is, deze methode werkt niet met AAV4 en AAV5, die niet beschikken over heparine-bindende sites op hun capsids38. Gezien het feit dat de chromatografie zuivering ook duur is, is iodixanol gebaseerde zuivering over het algemeen meer geschikt voor laboratoria die wil produceren van kwalitatief hoogwaardige batches van AAV vectoren op een kleine schaal33,39, 40. het maximaliseren van de uiteindelijke opbrengst en de zuiverheid van de vector, uiterste zorg is echter nodig bij het maken van de iodixanol verlopen. De verschillende iodixanol breuken moeten worden overgedragen aan de ultracentrifugatie buis met behulp van een steriele Pipet van Pasteur waarvan tip is het aanraken van de wand van de buis: iodixanol moet worden verbannen uit de pipet langzaam en continu. De vector deeltjes zich ophopen in de 40% iodixanol laag, moet zorg men zich ervan vergewissen dat de kleurovergang interfaces Meng geen20. Tot slot, de breuk met de vector hersteld zouden moeten worden door het inbrengen van een botte naald van roestvrij staal met een graadmeter niet groter is dan 20 G. Maximaliseren van de terugwinning van de vector, moet de duidelijke breuk in zijn geheel worden opgehaald. Tijdens deze stap is de timing van cruciaal belang. Om te voorkomen dat afbreuk te doen aan de zuiverheid van de voorbereiding, is het essentieel om te stoppen met de collectie voordat andere (verontreinigende) fasen van het verloop worden verzameld.

Verschillen in de verkregen vector-titer kunnen ook worden toegeschreven aan het intrinsieke vermogen van de vector te produceren verpakte deeltjes. Een vergelijking tussen verschillende AAV serotypen bleek dat sommige AAV-vectoren moeilijker zijn te produceren op een hogere titer dan anderen (bijvoorbeeld AAV2)41. Neerslag van de vector; tijdens de demineralisatie stap, kan een mogelijke oorzaak voor een lagere titer en eenvoudig voorkomen door het vermijden van overconcentration33. Bovendien, het is ook mogelijk dat de efficiëntie van iodixanol verloop gebaseerde zuivering enigszins tussen serotypes verschilt en, derhalve, verschillen in de titer verkregen met verschillende serotypes kunnen worden waargenomen41.

Ten slotte moet erop worden gewezen dat hoewel qPCR een zeer nauwkeurige methode voor DNA kwantificering is sommige inherente variabiliteit in de techniek kan worden waargenomen. Nauwkeurigheid in de titratie is voornamelijk afhankelijk van de precieze pipetteren en de juiste vortexing voor alle oplossingen. Om te garanderen de nauwkeurigste titer lezen, de qPCR zelfstandig kan worden herhaald, en de verkregen waarden worden gemiddeld. De keuze van de inleidingen gepresenteerd in dit protocol is gebaseerd op de volgorde van de promotor van de CBA gelegen in de pTransgene-plasmide gebruikt in ons laboratorium. De promotor CBA is een sterke synthetische promotor die over meerdere celtypen wijd in het vectorveld op station expressie is gebruikt. Het bevat meerdere elementen, met inbegrip van het cytomegalovirus (CMV) vroege enhancer element; de promotor, eerste exon en de eerste intron van het CBA-gen; en de splice acceptor van het konijn β-globine-gen. Inleidingen kunnen echter worden ontworpen voor vrijwel elk element dat is gelegen binnen de cassette van de expressie (met inbegrip van de promotor, transgenic en regulerende elementen). De vergelijking van de titer over partijen is ook mogelijk, mits inleidingen worden gebruikt tegen gebieden gemeen hebben de betrokken vectoren.

Kortom, kan dit protocol worden gebruikt voor de productie van AAV vectoren met een scala aan capsids, genoom configuraties, promotor types en transgenic ladingen. Hierdoor zullen de gebruikers aan te passen gemakkelijk de uiteindelijke kenmerken van hun vectoren best aan experimentele behoeften. In het voorbeeld gepresenteerd in de representatieve resultaten, het gebruik van de PHP. B Eiwitmantel, die efficiënt de BBB kruist, gaf hoogefficiënte genexpressie in het VNV, volgende staart veneuze injectie32. De systemische toediening van CNS penetrant vectoren heeft aanzienlijke voordelen met betrekking tot de mogelijke bijwerkingen2,17,32. Een mogelijk alternatief voor perifere injectie, terwijl het vermijden van de valkuilen van invasieve technieken, is intrathecale levering, die uit de levering van de AAV-vector in de cerebrospinale vloeistof bestaat. Deze bezorgingsroute is bewezen effectief, waarin wijdverbreide uitdrukking van transgenic over de CNS, minder af-target effecten in perifere organen, en lage niveaus van immuunrespons42. Intrathecale injecties zijn echter veel meer uitdagend, zoals zij hogere technische vaardigheden dan staart veneuze injectie vereist.

Verdere ontwikkeling van de Eiwitmantel om deze technologie te verfijnen zal worden bepaald door de mogelijkheden voor AAV vector gebruik in gen-therapie-toepassingen. Een dergelijke aanpak bieden aantrekkelijke mogelijkheden om te behandelen momenteel ongeneeslijke CNS aandoeningen, zoals Amyotrofische laterale sclerose, de ziekte van Charcot-Marie-Tooth, Parkinson en de ziekte van Alzheimer18.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

M.R. wordt ondersteund door een Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO) postdoctoral fellowship (133722/1204517N) en de voortdurende steun van de Fundación cardiovasculaire de Colombia en de administratieve afdeling Wetenschappen, erkent Technologie en innovatie (Grant CT-FP44842-307-2016, projectcode 656671250485). M.M. wordt ondersteund door een FWO doctorale fellowship (1S48018N). M.G.H. werd gesteund door een VIB institutionele grant en externe steun van de Thierry Latran Stichting (SOD-VIP), de Stichting Alzheimer onderzoek (SAO-FRA) (P #14006), het FWO (Grant 1513616N) en de European Research Council (ERC) (Starting Grant 281961 - AstroFunc; Bewijs van Concept subsidie 713755 - AD-VIP). De auteurs erkennen Jeason Haughton voor zijn hulp met muis veehouderij, Stephanie Castaldo voor haar instructies voor het uitvoeren van de staart ader injecties en Caroline Eykens voor het verstrekken van de beelden van transfected cellen van de HEK293T. M.G.H. erkent Michael Dunlop, Peter Hickman en Dean Harrison.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Plasmid productie
pTransgene plasmidDe novo ontwerp of verkregen uit een plasmide repositoryN/AZie stap 1 van het hoofdprotocol voor meer details
pCapsidDe novo ontwerp of verkregen uit een plasmide repositoryN/AZie stap 1 van het hoofdprotocol voor meer details
pHelperAgilent240071
Plasmid Plus maxi kitQiagen12963
QIAquick PCR-zuiveringskitQiagen28104
AAV Helper-Free SystemAgilent240071
Celcultuur en transfectie
Dulbecco’s Gemodificeerd Eagle Medium (DMEM), hoge glucose, geen glutamineLife Technologies11960-044Supplement DMEM met FBS (1% of 10% v/v) en GlutaMAX 200 mM (1% v/v) en filter sterieel het medium met behulp van een 0.22 µm filter
Fetaal bovien serum (FBS)GIBCO10500-064
GlutaMAX supplementGIBCO35050038
(200 mM)
Corning fles-bovenkant vacuümfiltersysteemSigma-AldrichCLS430769
Dulbecco’s Fosfaat Gebufferde Saline (DPBS) zonder calcium en zonder magnesiumGIBCO14190094
HEK293T cellenAmerican Tissue Culture CollectionCRL3216Bij ontvangst, ontdooi de cellen en kweek zoals beschreven in het protocol. Na een minimaal aantal passages, bevriest u een subfractie voor toekomstig gebruik in aliquoten. Gebruik altijd cellen onder passagenummer 20. Zodra gekweekte cellen meer dan 20 keer zijn gepasseerd, start u een kweek opnieuw van de opgeslagen aliquoten
Celcultuur schaaltjesGreiner Cellstar63916015 cm diameter kweek schaaltjes
Cel schrabbersVWR10062-904
Polyethylenimine (PEI)Polyscience23966-2PEI in poedervorm wordt opgelost in 1 µg/µL in gedeïoniseerd water (ddwater) op pH=2 (gebruik HCl). Bereid in een beker en roer gedurende 2-3 uur. Wanneer opgelost, brengt u de pH terug naar 7 met NaOH. Filter sterieel en bewaar de gesuspendeerde stockoplossing in 1 ml aliquoten bij -20 °C. PEI aliquoten kunnen worden ingevroren/ontdooid meerdere keren.
Virkon oplossingFisher ScientificNC9821357Desinfecteer elk materiaal dat in contact is geweest met geassembleerde vectordeeltjes met Virkon oplossing
Mutexi lange mouwen schortenFisher Scientific11735423Draag een schort over de bovenkant van een normale laboratoriumjas
Fisherbrand maximale bescherming wegwerpbare overschoenenFisher Scientific15401952
AAV-zuivering en ontzouting
Optiprep dichtheidsgradiënt mediumSigma-AldrichD1556Optiprep is een 60% (w/v) oplossing van iodixanol in water (sterieel). WAARSCHUWING. Gebruik onder een laminaire flow hood. Draag handschoenen
FenolroodSigma-AldrichP0290WAARSCHUWING. Gebruik onder een laminaire flow hood
Pasteur pipetSigma-AldrichZ627992Steriliseer voor gebruik
OptiSeal Polypropyleen buizenBeckman361625
Benzonase (250 U/µL)Sigma-AldrichE1014Wordt geleverd als een klaar-voor-gebruik oplossing
Acrodisc spuitfilterPall Corporation4614
Omnifix spuit (5 mL)Braun4617053V
Blunt spuitnaaldSigma AldrichZ261378Roestvrijstalen 316 spuitnaald, pipeterend stomp 90° tip gauge 16, L 4 inch. Wordt in de tekst aangeduid als een stomp-eindnaald
Aqua EcotainerB. Braun0082479ESterieel endotoxinevrij water. Wordt aangeduid als 'Ultrapuur water'
Amicon ultra-15 centrifugaalfiltereenheidMilliporeUFC910024Deze filters concentreren het eindproduct door de vectordeeltjes in opeenvolgende centrifugatiestappen te verzamelen
Pluronic F68 (100x)Thermo Fisher24040032Niet-ionische oppervlakteactieve stof. Verdun in steriele PBS om te gebruiken bij 0.01% (v/v)
Fisherbrand Steriele Microcentrifugebuizen met schroefdop (2 mL)Fisher Scientific02-681-374Gebruik buizen met een rand voor eenvoudige hantering
AAV-titratie
Beperkingsenzym: StuI (10 U/µL)PromegaR6421
DNAse I (1 U/µL)Fisher ScientificEN0521
Proteinase KSigma-Aldrich3115852001Reconstitueer in ultrapuur water en gebruik bij een eindconcentratie van 10 mg/mL. De oplossing kan worden bewaard bij -20 °C
EasyStrip Plus Tube Strips (met bijgevoegde doppen)Fisher ScientificAB2000
Eppendorf microtube 3810xSigma-AldrichZ606340-1000EA
LightCycler 480 SYBR Green I Master MixRoche4707516001
LightCycler Multiwell Plates, 96 wellenRoche4729692001Witte polypropyleen plaat (met unieke identificerende barcode)
Microseal 'A' PCR plaat en PCR Plaat Sealing FilmBio-Radm

Referenties

  1. Daya, S., Berns, K. I. Gene Therapy Using Adeno-Associated Virus Vectors. Clinical Microbiology Reviews. 21 (4), 583-593 (2008).
  2. Duque, S., et al. Intravenous Administration of Self-complementary AAV9 Enables Transgene Delivery to Adult Motor Neurons. Molecular Therapy. 17 (7), 1187-1196 (2009).
  3. Bourdenx, M., Dutheil, N., Bezard, E., Dehay, B. Systemic gene delivery to the central nervous system using Adeno-associated virus. Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, (2014).
  4. Kantor, B., McCown, T., Leone, P., Gray, S. J. Clinical Applications Involving CNS Gene Transfer. Advances in Genetics. 87, 71-124 (2014).
  5. Crystal, R. G. Adenovirus: The First Effective In Vivo Gene Delivery Vector. Human Gene Therapy. 25 (1), 3-11 (2014).
  6. Weinberg, M. S., Samulski, R. J., McCown, T. J. Adeno-associated virus (AAV) gene therapy for neurological disease. Neuropharmacology. 69, 82-88 (2013).
  7. Henckaerts, E., Linden, R. M. Adeno-associated virus: a key to the human genome? Future Virology. 5 (5), 555-574 (2010).
  8. Howarth, J. L., Lee, Y. B., Uney, J. B. Using viral vectors as gene transfer tools (Cell Biology and Toxicology Special Issue: ETCS-UK 1 day meeting on genetic manipulation of cells). Cell Biology and Toxicology. 26 (1), 1-20 (2010).
  9. Nathwani, A. C., et al. Adenovirus-Associated Virus Vector-Mediated Gene Transfer in Hemophilia B. The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).
  10. Carter, B. J. Adeno-associated virus and the development of adeno-associated virus vectors: a historical perspective. Molecular Therapy. 10 (6), 981-989 (2004).
  11. Schambach, A., Zychlinski, D., Ehrnstroem, B., Baum, C. Biosafety Features of Lentiviral Vectors. Human Gene Therapy. 24 (2), 132-142 (2013).
  12. Van Vliet, K. M., Blouin, V., Brument, N., Agbandje-McKenna, M., Snyder, R. O. The Role of the Adeno-Associated Virus Capsid in Gene Transfer. Methods in Molecular Biology. 437, 51-91 (2008).
  13. Rincon, M. Y., VandenDriessche, T., Chuah, M. K. Gene therapy for cardiovascular disease: advances in vector development, targeting, and delivery for clinical translation. Cardiovascular Research. 108 (1), 4-20 (2015).
  14. Samulski, R. J., Muzyczka, N. AAV-Mediated Gene Therapy for Research and Therapeutic Purposes. Annual Review of Virology. 1 (1), 427-451 (2014).
  15. McCarty, D. M. Self-complementary AAV Vectors; Advances and Applications. Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).
  16. Choi, J. H., et al. Optimization of AAV expression cassettes to improve packaging capacity and transgene expression in neurons. Molecular Brain. 7, 17(2014).
  17. Deverman, B. E., et al. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nature Biotechnology. 34 (2), 204-209 (2016).
  18. Jackson, K. L., Dayton, R. D., Deverman, B. E., Klein, R. L. Better Targeting, Better Efficiency for Wide-Scale Neuronal Transduction with the Synapsin Promoter and AAV-PHP.B. Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, (2016).
  19. Lock, M., et al. Versatile Manufacturing of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors at Scale. Human Gene Therapy. 21 (10), 1259-1271 (2010).
  20. Strobel, B., Miller, F. D., Rist, W., LamLa, T. Comparative Analysis of Cesium Chloride- and Iodixanol-Based Purification of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors for Preclinical Applications. Human Gene Therapy Methods. 26 (4), 147-157 (2015).
  21. Jungmann, A., Leuchs, B., Katus, H. A., Rommelaere, J., Müller, O. J. Protocol for efficient generation and characterization of adeno-associated viral (AAV) vectors. Human Gene Therapy Methods. , (2017).
  22. Tolmachov, O. Designing Plasmid Vectors. Methods in Molecular Biology. 542, 117-129 (2009).
  23. QIAGEN Plasmid Purification Handbook. , Available from: https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=46205595-0440-459e-9d93-50eb02e5707e&lang=en (2018).
  24. QIAquick PCR Purification Kit Protocol. , Available from: http://2012.igem.org/wiki/images/a/a3/QIAquick_PCR-purification.pdf (2008).
  25. Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR. Human Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
  26. Sigma. ProteoSilver Silver Stain Kit (PROTSIL1) - Bulletin, ProteoSilver. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/protsil1bul.pdf (2018).
  27. Machholz, E., et al. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. (67), e2771(2012).
  28. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  29. Puntel, M., et al. Gene transfer into rat brain using adenoviral vectors. Current Protocols in Neuroscience. 50 (1), (2010).
  30. Bachman, J. Immunohistochemistry on Freely Floating Fixed Tissue Sections. Methods in Enzymology. 533, 207-215 (2013).
  31. Hordeaux, J., et al. The Neurotropic Properties of AAV-PHP.B Are Limited to C57BL/6J Mice. Molecular Therapy. 26 (3), 664-669 (2018).
  32. Rincon, M. Y., et al. Widespread transduction of astrocytes and neurons in the mouse central nervous system after systemic delivery of a self-complementary AAV-PHP.B vector. Gene Therapy. 25 (2), 83-92 (2018).
  33. Crosson, S. M., Dib, P., Smith, J. K., Zolotukhin, S. Helper-free Production of Laboratory Grade AAV and Purification by Iodixanol Density Gradient Centrifugation. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 10, 1-7 (2018).
  34. Merdan, T., Kunath, K., Fischer, D., Kopecek, J., Kissel, T. Intracellular processing of poly(ethylene imine)/ribozyme complexes can be observed in living cells by using confocal laser scanning microscopy and inhibitor experiments. Pharmaceutical Research. 19 (2), 140-146 (2002).
  35. Meissner, P., et al. Transient gene expression: recombinant protein production with suspension-adapted HEK293-EBNA cells. Biotechnology and Bioengineering. 75 (2), 197-203 (2001).
  36. Reed, S. E., Staley, E. M., Mayginnes, J. P., Pintel, D. J., Tullis, G. E. Transfection of mammalian cells using linear polyethylenimine is a simple and effective means of producing recombinant adeno-associated virus vectors. Journal of Virological Methods. 138 (1-2), 85-98 (2006).
  37. Zolotukhin, S., et al. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Therapy. 6 (6), 973-985 (1999).
  38. Kaludov, N., Handelman, B., Chiorini, J. A. Scalable Purification of Adeno-Associated Virus Type 2, 4, or 5 Using Ion-Exchange Chromatography. Human Gene Therapy. 13 (10), 1235-1243 (2002).
  39. Nass, S. A., et al. Universal Method for the Purification of Recombinant AAV Vectors of Differing Serotypes. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 9, 33-46 (2017).
  40. Qu, G., et al. Separation of adeno-associated virus type 2 empty particles from genome containing vectors by anion-exchange column chromatography. Journal of Virological Methods. 140 (1-2), 183-192 (2007).
  41. Holehonnur, R., et al. Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala. BMC Neuroscience. 15, 28(2014).
  42. Wang, H., et al. Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis. Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

AAV vectorproductieiodixanolgradi ntzuiveringbepaling van vectortiterqPCR gebaseerde titeranalysezuiverheid via zilverkleuringultracentrifugatieprotocoltransfectie van HEK cellengentherapie in het CZSAAV PHP B serotype

Gerelateerde artikelen