Meten van de vorm en grootte van actief slib deeltjes vervoertechnische Agar met een Open Source Software pijpleiding

Samenvatting

De grootte en de vorm van deeltjes in actiefslibinstallatie zijn belangrijke parameters die worden gemeten met behulp van verschillende methoden. Onjuistheden voortvloeien uit niet-representatieve bemonstering, suboptimaal afbeeldingen en subjectieve analyse gebruikte parameters. Om deze fouten te minimaliseren en verlichten van de meting, presenteren we een protocol waarin elke stap, met inbegrip van een pijpleiding van opensource software.

Samenvatting

Experimentele bioreactoren, zoals deze behandelen afvalwater, bevatten deeltjes waarvan grootte en vorm belangrijke parameters zijn. Bijvoorbeeld, kunnen de grootte en vorm van actief slib Floc geven op welke voorwaarden op de microscale en ook rechtstreeks van invloed op hoe goed het slib vestigt zich in een clarifier.

Deeltjesgrootte en vorm zijn beide bedrieglijk 'eenvoudige' metingen. Vele subtiele problemen, vaak ongeadresseerde in informele protocollen, kunnen optreden wanneer bemonstering, imaging en analyseren van de deeltjes. Bemonsteringsmethoden een vertekend beeld kunnen geven of niet genoeg statistische stroomvoorziening. De monsters zelf slecht kunnen worden bewaard of wijziging tijdens immobilisatie ondergaan. Afbeeldingen kunnen niet worden van voldoende kwaliteit; overlappende deeltjes, kan scherptediepte, vergrotingsniveau, en diverse lawaai alle slechte resultaten opleveren. Slecht opgegeven analyse kan leiden tot vertekening, zoals die geproduceerd door handmatige afbeelding drempelmethode en segmentatie.

Betaalbaarheid en doorvoer zijn wenselijk naast reproduceerbaarheid. Een betaalbare, hoge doorvoer methode kunnen vaker meting van de deeltjes, produceren veel afbeeldingen met duizenden deeltjes. Een methode die gebruikmaakt van goedkope reagentia, een gemeenschappelijk ontleden Microscoop, en de software van de analyse van de vrij beschikbare open source kunt herhaalbare, toegankelijk, reproduceerbare en gedeeltelijk geautomatiseerde experimentele resultaten. Verder, het product van een dergelijke methode kunnen well-formatted, welomschreven en gemakkelijk te begrijpen door data-analysesoftware, versoepeling van zowel binnen-lab analyses en gegevens delen tussen labs.

We presenteren een protocol dat de gegevens van de stappen die nodig zijn voor de productie van dergelijk product, met inbegrip van: bemonstering, sample voorbereiding en immobilisatie in agar, digital image aquisition, digitale beeldanalyse en voorbeelden van experiment-specifieke figuur met behulp van de de resultaten van de analyse. We hebben ook een open-source data analyse pijpleiding ter ondersteuning van dit protocol opgenomen.

Inleiding

Het doel van deze methode is bedoeld als een welomschreven, herhaalbare en gedeeltelijk geautomatiseerde methode voor het bepalen van de grootte en vorm distributies van deeltjes in de bioreactoren, met name die met actief slib Floc en aërobe korrels^{1 , 2}. de grondgedachte achter deze methode waren om de betaalbaarheid, eenvoud, doorvoer, en herhaalbaarheid van onze bestaande interne protocollen,^3,4, verlichten deeltje meting voor anderen, en vergemakkelijken delen en vergelijking van de gegevens.

Er zijn twee brede categorieën voor de analyse van de meting van de deeltjes - direct beeldvorming en inferentiële methoden met behulp van deze kwaliteiten als lichtverstrooiing⁵. Hoewel inferentiële methoden kunnen worden geautomatiseerd en grote doorvoer hebben, is de apparatuur duur. Bovendien, terwijl de inferentiële methoden kunnen nauwkeurig bepalen het equivalent grootte van een deeltje⁶, bieden ze geen gedetailleerde vorm informatie⁷.

Vanwege de noodzaak van shapegegevens, hebben wij onze methode gebaseerd op directe imaging. Hoewel sommige high-throughput beeldvormende methoden bestaan, moeten ze traditioneel dure commerciële hardware of oplossingen op maat gebouwde^8,9. Onze methode is ontwikkeld om gemeenschappelijk, betaalbare hardware en software die, hoewel lijden aan een afname van de doorvoer, veel meer deeltjes beelden dan het minimum dat nodig is voor veel analyses^{10 produceert}tewerk te stellen.

Bestaande protocollen kunnen niet geven belangrijk bemonsterings- en afbeelding overname stappen. Andere protocollen kunnen handmatige stappen die invoering van subjectieve bias (zoals ad hoc drempelmethode¹¹) opgeven. Een duidelijk omschreven methode waarmee bemonstering, immobilisatie en afbeelding overname stappen gecombineerd met vrij beschikbare analysesoftware zal verbeteren zowel binnen-lab beeldanalyse en vergelijkingen tussen labs. Een belangrijk doel van dit protocol is bedoeld als een werkstroom en hulpmiddelen die tot reproduceerbare resultaten van verschillende labs voor hetzelfde monster leiden moeten.

Afgezien van het normaliseren van de installatiekopie van de analyse, worden de gegevens geproduceerd door deze pijpleiding vastgelegd in een welomschreven, goed geformatteerde bestand¹² geschikt voor gebruik populaire data analyse pakketten^13,14, versoepeling experiment specifieke analyses (zoals aangepaste figuur generatie) en faciliterende gegevensuitwisseling tussen labs.

Dit protocol wordt met name voorgesteld voor onderzoekers die vereisen deeltje shapegegevens, hebben geen toegang tot de inferentiële methoden, niet willen ontwikkelen hun eigen beeld analyse pijpleiding, en willen hun gegevens gemakkelijk delen met anderen

Protocol

1. het verzamelen van monsters voor analyse van het deeltje

1. Vastgesteld wat de omvang van de steekproef voor specifieke reactoren die voldoende deeltjes voor statistische analyse^{10 produceren zal} (> 500) terwijl het vermijden van overlapping van de particle.
   1. Ga ervan uit dat een bereik van 0,5 tot 2 mL per monster van het mengsel bevatten voldoende voor actiefslibinstallatie monsters met een mengsel bevatten geschorst vaste stoffen (MLSS) tussen 250 en 5000 mg/L.
   2. Anders, bereiden drie test agar platen met 0,5, 2 en 5 mL van het monster (stappen 1.2 via 2.7).
   3. Visueel schatten die (indien aanwezig) monster volumes beste voldoen aan de criteria vermeld in stap 1.1.
   4. Als deeltjes elkaar nog voor het 0,5 mL monster overlappen, herhaalt u stap 1.1.2 en 1.1.3 met drie monsters van 0,5 mL verdund met een toegevoegde 0,5, 1 en 2 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing om te bepalen van de mate waarin een 0,5 mL monster moet worden verdund vóór stap 2.1.
      Opmerking: Stappen 1.1 − 1.1.4 slechts eenmaal per experiment moet worden uitgevoerd, of als de reactor inhoud wijzigen zodat latere metingen niet langer voldoen aan de criteria vermeld in stap 1.1.
2. Het verwerven van een representatieve steekproef van een goed gemengde gedeelte van de reactor door grijpen ~ 40 mL in een bekerglas of 50 mL centrifugebuis voorzichtig mengen, en onmiddellijk het vastberaden monstervolume van de goed gemengde grijper te gieten in een centrifugebuis 15 mL. Verdun het monster, noodzakelijk, zoals bepaald door stap 1.1.4.
   Opmerking: Het protocol hier kan worden onderbroken en het monster kan worden opgeslagen in de koelkast (4 ° C) voor maximaal 48 uur. Het monster niet invriezen.
   Let op: gemeenschappelijke behoud media (bijvoorbeeld formaldehyde/formamide) zijn niet geschikt. Het grote oppervlak van de plaat, in combinatie met de open container, warmte van de lichtbron, en potentieel slecht geventileerde microscopie setup produceren onnodig gevaarlijke voorwaarden voor kleine winst in beeldkwaliteit.

2. voorbereiding van de agar platen van gebeitst, geïmmobiliseerdet deeltjes

1. 5 µL van 1% (m/v) methyleenblauw toevoegen aan elk monster, dan cap en voorzichtig omkeren 3 minste tijde te mengen. Het toestaan van monsters om vlek voor ten minste 5 maar niet meer dan 30 minuten bij kamertemperatuur.
2. Bereiden van ongeveer 10 mL per monster van 7,5% (m/v) agar in gedeïoniseerd water.
   Opmerking: Agar kan worden tevoren geproduceerd en opgeslagen voor onbepaalde tijd als gesteriliseerd. Agarose kan worden vervangen, maar beelden niet aanzienlijk worden verbeterd.
3. Smelt agar met behulp van een magnetron of water bad en laat lichtjes afkoelen vóór gebruik. De agar is volledig gesmolten en giet gemakkelijk zorgen. Solide bolletjes agar zal vlekken anders, slechte kwaliteitsbeelden te produceren.
4. Voldoende gesmolten 7,5% (m/v)-agar overbrengen in de centrifugebuis toe zodat het totale buis volume tussen 6,5 en 9 mL.
5. Recap centrifuge buizen en voorzichtig omkeren minstens 3 keer te mengen.
6. Terwijl het wijzen van het GLB uit de buurt van zichzelf of in een kap, open het GLB. Giet de inhoud van de buis in een 100 mm plastic petrischaal terwijl zachtjes het schommelen van de schotel om een volledige, gladde coating en een visueel uniforme verdeling van de deeltjes te bereiken.
   Let op: De warmte van de agar kan leiden tot een lichte overdruk in de buis. Dit vaak een hoorbare sisklank produceert en heeft het potentieel om te verdrijven van kleine druppeltjes hete agar.
7. Laat de platen afkoelen bij kamertemperatuur gedurende ten minste 5 minuten, totdat de agar stolt.
   Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Winkel verguld ondersteboven en verzegeld (bijvoorbeeld in een verzegelde plastic zak of met paraffine film) voor maximaal 48 uur in de koelkast (4 ° C).

3. het verwerven van deeltje beelden met behulp van een stereomicroscoop en digitale camera

1. Plaats de ongedekte plaat gezicht-omhoog in het werkgebied van de Microscoop van een stereomicroscoop staat van 10 x tot 20 x vergroting. Verlichten het monster uit de onderstaande lijst met zelfs, diffuus licht met behulp van apparatuur, zoals een LED-hulplicht stand of lichte plaat.
2. Open de afbeelding capture software, Controleer dat de Microscoop lichtpad is ingesteld op foto, en klik op de juiste camera uit de lijst van de camera.
3. De Microscoop aanpassen zodat meerdere deeltjes worden weergegeven in de software in het brandvlak met grote, goed-gedefinieerde randen. Een vergroting van 10-20 x gebruiken voor het meten van deeltjes met behoud van een relatief diep brandvlak.
   1. Tijdelijk verwijderen van de agarplaat en plaats de micrometer in het werkgebied. Pas de fijne focus totdat de afstudeerders op de micrometer sterk geconcentreerd is in de afbeelding capture software verschijnen.
   2. Indien niet eerder gekalibreerd, registreren de pixel micro/verhouding voor de huidige vergroting.
      1. De zoom op 100% instelt door te klikken op Zoom > ware grootte en selecteer Opties > Calibrate dan de rode kalibratiebalk in de belangrijkste viewport langs de lange as van de micrometer, met de verticale balken gecentreerd op de 0 en 200 µm afstudeerders uitlijnen. Voer in het dialoogvenster kalibreren de huidige vergrotingsfactor en de werkelijke lengte van 200 µm.
   3. Als al gekalibreerd Selecteer vergroting van de menubalk en selecteer de huidige vergroting niveau en bevestigen van de kalibratie.
      1. Selecteer metingen > lijn > willekeurige lijn. Klik op het snijpunt van de 0 afstuderen en de lange as van de micrometer. Klik nogmaals op het snijpunt op 200 en de lange de as. A juiste kalibratie moet weer ongeveer 200 µm. Verwijder de regel door tikken daarop, dringende verwijderen, en druk op Ja in het bevestigingsvenster.
         Opmerking: De aanwijzingen voor het selecteren van de camera en de kalibratie zijn specifiek voor de software die wordt gebruikt voor deze hardware. Soortgelijke functies moet beschikbaar zijn in andere beeldbewerkingssoftware. Het doel is om te bepalen van de pixel micron/verhouding van het beeld voor nauwkeurige deeltje grootte meten.
4. Vervang de agarplaat en aanpassen van de fijne focus om maximaal detail in de beeldbewerkingssoftware.
5. De denkbaar software zodanig aanpassen dat maximale beeldkwaliteit wordt bereikt.
   1. Verhoog de bitdiepte op de maximumwaarde die is toegestaan, door het keuzerondje te selecteren in het deelvenster van de Bitdiepte van de Camera zijbalk. De software te verwerven grijswaardenafbeeldingen door het bijbehorende keuzerondje te selecteren in het deelvenster Kleur of grijstinten van de zijbalk Camera instellen
   2. Alle panelen open zijbalk instorten tussen blootstelling en histogram. Verminderen van de winst tot 1.0 en verhoging van de blootstelling tot een duidelijk beeld wordt weergegeven in de viewport en tot het histogram wordt weergegeven als een distributie die niet door een van de uiteinden van het histogram vak is afgekapt.
   3. De histogram om te voorkomen dat- en onderbelichting aanpassen. Schuif de linkerrand van het histogram te net buiten de laagste waarden en de rechterrand aan net buiten de hoogste waarden in het deelvenster histogram van de zijbar camera.
6. Sla de afbeelding op als een ongecomprimeerde TIFF, met inbegrip van vergroting informatie in de metagegevens van afbeeldingen, met behulp van de bestand > opslaan als in het dialoogvenster selecteren van de TIFF-indeling, en ervoor te zorgen dat het vak met kalibratie-informatie opslaan wordt gecontroleerd.
   Opmerking: Het opslaan van metagegevens van afbeeldingen, met inbegrip van ruimtelijke kalibratie, acquisitie programma's kan verschillen. FIJI¹⁵, de onderliggende software die wordt gebruikt door de pijpleiding, begrijpt de meest voorkomende varianten. De belangrijke informatie om vast te leggen is de pixel hoogte, breedte en bijbehorende eenheid.
7. Met behulp van ofwel een mobiel podium of manueel het bewegen van de plaat zelf, selecteert u een ander gebied, die niet vorige beelden overlapt, na een pad die wisselt tussen links-naar-rechts en rechts-naar-links als omlaag de plaat; ook bekend als een 'grasmaaier zoekpatroon'. Herhaal stap 3.6 totdat voldoende beelden zijn geproduceerd om te vangen ten minste 500 visueel geschatte deeltjes, meer zijn beter.
   Opmerking: Alternatieven patronen (bv., circulaire, random) zijn aanvaardbaar, maar moet worden gerapporteerd. Het verwerven van meerdere overlappende afbeeldingen voor combinatie in een mozaïek via digitale stiksels produceert een resulterende bestandsgrootte die sterk downstream processing en artefacten uit het stiksel belemmert kan worden ingevoerd en wordt momenteel niet aangeraden.
8. Platen tot na beeldanalyse voor mogelijke follow-up imaging behouden. Gooi na definitieve imaging, afhankelijk van biologisch afval.

4. meten en analyseren van deeltje silhouetten

1. Installeer de vereiste afbeelding analyse Softwarepakketten
   1. Installeren van FIJI (een verbeterde versie van de National Institutes of Health ImageJ v1.52e de instructies op te volgen: https://imagej.net/Fiji/Downloads
   2. Git installeren, als niet reeds heden, door de instructies op te volgen: https://git-scm.com/downloads
   3. De code analyse deeltjes uit verwerven door middel van klonen van de git repository¹⁶.
      1. Ophalen op de command line, de nieuwste versie van de code door te typen:
         git clone https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis.git
         1. Installeren code analyse volgt de instructies in het tekstbestand README.md in de bovenste directory van de gekloonde repository gevonden.
            Opmerking: Met behulp van git heeft de voorkeur, zoals het zal automatisch het ophalen van de meest recente versie van de code. Als git niet beschikbaar is, is het ook mogelijk de code te downloaden als een zip-bestand op de release pagina op: https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis/releases
   4. Een tekstbestand lijst van de mappen moeten worden verwerkt, samen met de optionele parameters bewerken. Verwijzen naar de submap Voorbeelden/analyse voor een lijst met parameters en voorbeelden.
2. Voer de analyse op de opdrachtregel door te typen:
   < FIJI-PATH > \ImageJ-win64.exe--console - macro < paramsfile > SParMorIA-SludgeParticle_Morphological_Image_Analysis
   waarbij < FIJI-pad > staat voor de map waarin ImageJ-win64.exe zich bevindt en < paramsfile > de locatie van het tekstbestand met een beschrijving van de analyse-setup
   Opmerking: De naam van het uitvoerbare bestand kan verschillen, afhankelijk van welke besturingssysteem FIJI op is geïnstalleerd. Afhankelijk van het aantal en de grootte van de afbeeldingen, de analyse kan een paar minuten duren uren en wordt automatisch uitgevoerd.
3. De controle van een kwaliteitscontrole uitvoeren
   1. Onderzoeken van de kwaliteitscontrole bestanden in de submap van de overlay van de opgegeven uitvoermap. Opmerking Afbeeldingen met valse, gemiste en slecht gevangen deeltjes, allen duidelijk als schaduwrijke contouren die niet overeenkomen met de achtergrond. Raadpleeg voor voorbeelden van een dergelijke Figuur 3 . De deeltjes-gegevens zijn nu klaar voor experiment-specifieke analyse figuur generatie.
4. Verwerpen hele platen of individuele deeltjes door op te geven in de code van de analyse, de bekende bestanden en/of particle-id's worden genegeerd. Verwijzen naar voorbeelden/censuur in de opslagplaats voor relevante R en Python code.
5. Genereren van specifieke cijfers experiment met behulp van de resultaten van de analyse van de afbeelding voor elke afbeelding in een NETTE¹² door komma's gescheiden tekstbestand in de subdirectory van de resultaten van de opgegeven uitvoermap zijn opgeslagen. Verwijzen naar de voorbeelden/cijfers/R en voorbeelden/cijfers/Python submappen voor voorbeelden van het lezen van de bestanden met resultaten.

Resultaten

Bestanden die zijn gegenereerd
Het proces geïllustreerd in Figuur 1 zal produceren twee bestanden per beeld geanalyseerd. Het eerste bestand is een door komma's gescheiden waarde (CSV) tekstbestand waarin elke rij komt overeen met een afzonderlijke deeltjes en de kolommen beschrijven verschillende deeltje statistieken zoals gebied, cirkelvormigheid en degelijkheid en omschreven in de handleiding van ImageJ¹⁷. Voorbe...

Discussie

Hoewel het systeem van de analyse van het beeld vrij robuust is en QC stappen worden genomen om ervoor te zorgen dat slechte afbeeldingen worden verwijderd, kan juiste aandacht op specifieke kwesties in bemonstering, plaat voorbereiding en beeldacquisitie verbeteren, zowel de juistheid van de gegevens en het percentage beelden passeren van QC.

Bemonstering concentratie
Ervan uitgaande dat een representatieve steekproef is genomen, is de belangrijkste stap om ervoor te zorge...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10% Bleekvloeistofoplossing	Chlorox	31009	Voor desinfectie van de werkruimte.
15 mL centrifugeerbuisje met dop	Corning	430790	Per monster.
50 mL Erlenmeyer kolf	Corning	4980-50	Andere vaten zijn geschikt zolang ze meer dan 40 mL monster kunnen bevatten en mengen toestaan
500 mL Kimax fles	Kimble-Chase	14395-50	Of anders voldoende voor agar-verwerking
Agar	BD	214010	Sterk, om 7,5% gel te bereiden. 7 mL per monster.
Gegevensanalysesoftware	N/A	N/A	R of Python wordt aanbevolen
De-ioniseerd water	N/A	N/A	Voldoende om vlek en agar te bereiden. Als niet beschikbaar, kraan mag voldoende zijn.
Desktopcomputer	N/A	N/A	Beeldanalyse is niet CPU-intensief, elke 'gewone' desktopcomputer rond 2017 zou voldoende moeten zijn.
Externe harde schijf	Seagate	STEB5000100	Niet volledig vereist, maar uiterst nuttig gezien het aantal en de grootte van afbeeldingen. 2 of meer TB opslagruimte wordt aanbevolen.
FIJI	NIH	versie 1.51d	Versie is ImageJ core. Plug-ins zijn bijgewerkt op het moment van schrijven. Beschikbaar op: https://imagej.net/Fiji/Downloads
GIT	Open Source	versie 2.19.1 of hoger	Beschikbaar op: https://git-scm.com/
Beeldopnamesoftware	ToupView	versie 3.7.5177	Elke compatibel met camera, kan bij camera worden geleverd. Moet TIFF-afbeeldingen kunnen opslaan met ruimtelijke kalibratiegegevens.
Mechanische (X/Y) Stage	OMAX	A512	Niet volledig vereist, maar helpt de beeldacquisitie enorm.
Methyleenblauw	Fisher	M291-100	Sterk, om 1% w/v-oplossing te bereiden. 5 uL oplossing per monster.
Microscoopcamera	OMAX	A35140U	Elke digitale camera compatibel met microscoop. Resolutie die minimaal 5 µm per pixel biedt bij 10x vergroting en een dynamisch bereik van minimaal 8 bits per pixel per kleurenkanaal wordt aanbevolen.
Optische Stage Micrometer	OMAX	A36CALM1	Of anders voldoende voor ruimtelijke kalibratie.
Petrischaal, 100 mm	Fisher	FB0875712	1 per monster.
PVE	N/A	N/A	Standaard laboratoriumjas, handschoenen en beschermende brillen.
Sparmoria macro	NCSU	versie 0.2.1	Beschikbaar op GitHub-repository: https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis
Stereo-/dissectiemicroscoop	Nikon	SMZ-2T	Moet 10 tot 20x vergroting bieden en digitale foto's mogelijk maken, hetzij met een ingebouwde camera of een montagepunt voor een CCD.