Efficiënte differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in levercellen

Summary

Dit protocol Details een monolayer, serum-vrije methode voor het efficiënt genereren van hepatocyte-achtige cellen van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) in 18 dagen. Dit omvat zes stappen als hpscs sequentieel differentiëren in tussenliggende celtypen zoals de primitieve streak, definitieve endoderm, posterieure foregut en lever Bud voor ouders voor het vormen van hepatocyte-achtige cellen.

Abstract

De lever ontgift schadelijke stoffen, scheidt vitale eiwitten, en voert belangrijke metabole activiteiten, dus behoud van leven. Dientengevolge, leverfalen-die kan worden veroorzaakt door chronische alcohol inname, hepatitis, acute vergiftiging, of andere beledigingen-is een ernstige aandoening die kan uitmonden in bloeden, geelzucht, Coma, en uiteindelijk de dood. Echter, benaderingen voor de behandeling van leverfalen, evenals studies van de leverfunctie en ziekte, zijn gedeeltelijk gestoneerd door het ontbreken van een overvloedig aanbod van menselijke levercellen. Hiertoe beschrijft dit protocol de efficiënte differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) in hepatocyten achtige cellen, geleid door een ontwikkelings roadmap waarin wordt beschreven hoe lever lotgevallen worden gespecificeerd in zes opeenvolgende differentiatie stappen. Door het manipuleren van ontwikkelings signalerings trajecten ter bevordering van de lever differentiatie en expliciet onderdrukken van de vorming van ongewenste cel Fates, deze methode genereert efficiënt populaties van menselijke lever Bud voor ouders en hepatocyte-achtige cellen door dagen 6 respectievelijk 18 van de PSC-differentiatie. Dit wordt bereikt door de tijdelijk nauwkeurige controle van ontwikkelings signalerings trajecten, uitgeoefend door kleine moleculen en groeifactoren in een serumvrij kweekmedium. Differentiatie in dit systeem vindt plaats in monolagen en levert hepatocyten achtige cellen die karakteristieke hepatocyte enzymen uitdrukken en de mogelijkheid hebben om een muismodel van chronisch leverfalen te graveren. De mogelijkheid om efficiënt te genereren grote aantallen menselijke levercellen in vitro heeft vertakkingen voor de behandeling van leverfalen, voor drug screening, en voor mechanistische studies van leverziekte.

Introduction

Het doel van dit protocol is om de menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) efficiënt te differentiëren in verrijkte populaties van lever Bud-voorlopercellen en hepatocyten-achtige cel². Toegang tot een klaar aanbod van menselijke lever voorlopercellen en hepatocyte-achtige cel zal versnellen inspanningen om te onderzoeken van de leverfunctie en ziekte en kan nieuwe cellulaire transplantatie therapieën voor leverfalen^{3,4, 5}. Dit is in het verleden een uitdaging gebleken sinds hPSCs (waaronder embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen) in al....

Protocol

1. voorbereiding van differentiatie media

Opmerking: Raadpleeg de tabel met materialen voor de fabrikant informatie over de gebruikte materialen en reagentia.

1. Bereiding van basis chemisch gedefinieerde media (CDM)
   Opmerking: CDM2, CDM3, CDM4 en CDM5 zijn chemisch gedefinieerde media die worden gebruikt als basismedia koppelen voor het differentiëren van hpscs op levercellen in verschillende stadia. De samenstelling van deze media kan worden gevonden in tabel 1.
   1. Maak een stockoplossing met polyvinylalcohol (PVA) om CDM2 of CDM3 te maken. Los 0,5 g PVA-p....

Results

Na 24 h van APS-differentiatie, zullen kolonies over het algemeen een verschillende morfologie aannemen dan ongedifferentieerde kolonies die gelijktijdig met een verlies van de heldere grens zijn, die meestal hPSC-kolonies beschrijven. Morfologisch, primitieve streak cellen hebben over het algemeen een onregelmatige grenzen en zijn meer verspreid en minder compact dan hPSCs-dit is suggestief van een epitheliale-naar-mesenchymale overgang als pluripotente epiblast cellen differentiëren en .......

Discussion

Deze methode maakt het genereren van verrijkte populaties van lever Bud-voorlopercellen, en vervolgens hepatocyte-achtige cel, van hPSCs. Het vermogen om verrijkte populaties van menselijke levercellen te genereren is belangrijk voor het praktische gebruik van dergelijke cellen. Eerdere methoden voor het genereren van hepatocyten van hPSCs leverde onzuivere celpopulaties die zowel lever-als niet-levercellen bevatten die, bij transplantatie in knaagdieren, bot en kraakbeen opleverden naast leverweefsel^15.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Geltrex	Thermofisher Scientific	A1569601
1:1 DMEM/F12	Gibco	11320033
0.2 μm pore membrane filter	Millipore	GTTP02500
mTeSR1	Stem Cell Technologies	5850
Thiazovivin	Tocris Bioscience	3845
Accutase	Gibco or Millipore	Gibco A11105, Millipore  SCR005
IMDM, GlutaMAX™ Supplement	Thermofisher Scientific	31980030
Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX™ Supplement	Thermofisher Scientific	31765035
KOSR, Knockout serum replacement	Thermofisher Scientific	10828028
Poly(vinyl alcohol)	Sigma-Aldrich	P8136
Transferrin	Sigma-Aldrich	10652202001
Chemically Defined Lipid Concentrate	Thermofisher Scientific	11905031
Human Activin	R&D	338-AC
CHIR99201	Tocris	4423
PI103	Tocris	2930/1
Human FGF2	R&D	233-FB
DM3189	Tocris	6053/10
A83-01	Tocris	2939/10
Human BMP4	R&D	314-BP
C59	Tocris	5148
TTNPB	Tocris	0761/10
Forskolin	Tocris	1099/10
Oncostatin M	R&D	295-OM
Dexamethasone	Tocris	1126
Ro4929097	Selleck Chem	S1575
AA2P	Cayman chemicals	16457
Human recombinant Insulin	Sigma-Aldrich	11061-68-0