Een eenvoudige ATP-metende assay en leven/dood kleuring methode dienden te kwantificeren en te visualiseren van Neisseria gonorrhoeae voortbestaan na de behandeling met ceftriaxone. Dit protocol kan worden uitgebreid tot de antimicrobiële gevolgen van een antibioticum en kan worden gebruikt voor het definiëren van de minimale remmende concentratie van antibiotica in bacteriële biofilms.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Kwantitatieve onderzoek van antibiotische gevoeligheid van Neisseria gonorrhoeae met behulp van aggregaten ATP-gebruik commerciële testen en Live/Dead vlekken
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De opkomst van antibiotica resistente Neisseria gonorrhoeae (GC) is een wereldwijd gezondheidsbedreiging en wijst op de noodzaak om te identificeren van individuen die niet van de behandeling. Deze gram-negatieve bacterie veroorzaakt gonorroe uitsluitend bij mensen. Tijdens de infectie is het kundig voor formulier aggregaten en/of biofilms. De minimale remmende concentratie (MIC) test wordt gebruikt om te bepalen van de gevoeligheid voor antibiotica en definiëren passende behandeling. Het mechanisme van de uitroeiing in vivo en haar relatie tot laboratoriumresultaten zijn echter niet bekend. Een methode die bespreekt hoe de GC aggregatie beïnvloedt antibiotische gevoeligheid en toont de relatie tussen de totale omvang en antibiotische gevoeligheid werd ontwikkeld. Wanneer GC aggregaat, ze meer resistent tegen antibiotica doden zijn, surviving met de bacteriën in het midden ceftriaxone behandeling beter dan die in de periferie. De gegevens wijzen erop dat N. gonorrhoeae aggregatie zijn gevoeligheid voor ceftriaxone, die niet wordt weerspiegeld met behulp van de standaard agar plaat gebaseerde MIC methoden kan verminderen. De methode die wordt gebruikt in deze studie zal de onderzoekers voor het testen van bacteriële gevoeligheid onder klinisch relevante voorwaarden toestaan.
Inleiding
Gonorroe is dat een seksueel overdraagbare infecties (SOA)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), een gram-negatieve bacterie diplococcal, is de verwekker van de ziekte. Symptomen van genitale infectie kunnen leiden tot pijn tijdens het plassen, gegeneraliseerde genitale pijn en urethrale kwijting. -Infectie is vaak asymptomatisch2,3,4,5, en dit zorgt voor uitgebreide kolonisatie. Deze onbehandelde infecties zijn een belangrijke gezondheids-zorg, zoals ze het potentieel hebben om de transmissie van het organisme en dit kan leiden tot complicaties, zoals pelvic inflammatory disease (PID) en verspreid gonococcal infectie (DGI)6. Antibiotica-resistente gonorroe is een belangrijke volksgezondheid crisis en een toenemende sociaal-economische last7. Verminderde gevoeligheid voor cefalosporines heeft geresulteerd in behandeling regime verandering van een enkel antibioticum naar dual therapie, die azithromycine of doxycycline met ceftriaxone8 combineert. De grotere mislukking van ceftriaxone en azithromycine9,10, in combinatie met asymptomatische infecties, benadrukt de noodzaak voor het begrijpen van gonorroe behandeling mislukkingen.
De minimale remmende concentratie (MIC) test, met inbegrip van agar verdunning en disc diffusie proeven, is gebruikt als de standaard medische test voor het identificeren van de weerstand tegen een antibioticum. Het is echter onduidelijk of de MIC test bacteriële resistentie tegen antibiotica in vivo weerspiegelt. De vorming van bacteriële biofilms draagt bij tot het voortbestaan van de bacteriën in aanwezigheid van de bactericide concentraties van antibiotica: het testen van de MIC is niet in staat om te ontdekken dit effect11. Omdat GC biofilms op mucosal oppervlakken12 vormen kan, we veronderstellen dat antibiotica gevoeligheid binnen aggregaten zou verschillen van die in afzonderlijke GC gezien. Bovendien, hebben studies aangetoond dat drie variabele oppervlakte moleculen, Pili, dekking-geassocieerde proteïne (Opa fasen), en lipooligosaccharides (LOS), die tussen bacterie interacties regelen, tot verschillende formaat aggregaten13, leiden 14 , 15. de bijdrage van deze componenten tot resistentie tegen antibiotica is niet onderzocht vanwege het ontbreken van goede methoden.
Momenteel zijn er verschillende methoden voor het meten van biofilm uitroeiing. De meest gebruikte kwantitatieve methode is door het meten van de veranderingen in de biomassa met behulp van crystal violet kleuring van16. De methode vereist echter aanzienlijke experimentele manipulatie, die mogelijk fouten in experiment herhaald17 genereren kunt. De live/dead kleuringstechniek gebruikt hier kunt visualisatie van levende en dode bacteriën en hun verdeling binnen de biofilm. Echter kan de structuur van de biofilm opleveren als een fysieke barrière die kleurstofpenetratie vermindert. Daarom, om te kwantificeren live/dode bacteriën binnen een groep, de kleuring is beperkt tot kleine biofilms of zijn voorloper-microcolonies of samenvoegingen. Andere methoden, met inbegrip van de agar verdunning en schijf diffusie proeven, kunnen niet voor het meten van de effecten van aggregatie. Te onderzoeken GC gevoeligheid binnen aggregatie na antibiotica blootstelling, een ideale methode zou moeten hebben zowel een kwantitatieve bepaling dat kan meten bacteriën leven en visualiseren van hun distributie.
De hier beschreven procedure combineert een ATP-benutting-meting en een leven/dood kleuring assay aan kwantitatief en visueel onderzoekt de GC gevoeligheid binnen aggregaten in aanwezigheid van antibiotica.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. algemeen onderhoud van GC stammen
- Strijk N. gonorrhoeae -stammen op GCK agar met 1% Kellogg18 (tabel 1, tabel 2) uit de vriezer voorraden aanvult en incubeer 37 ° C met 5% CO2 voor 16-18 h. gebruik MS11 uiting van fase-variabele Opa (MS11Opa +), geen Opa (MS11ΔOpa), of een afgekapte LOS (MS11ΔLgtE).
- Kies zorgvuldig pili negatieve (kolonie zonder donkere rand) of positieve (kolonie met donkere rand) kolonies van elke stam op basis van de kolonie morfologie19 met behulp van een ontleden lichte Microscoop en streep op een nieuwe GCK bord.
- Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 voor 16-18 h vóór gebruik.
2. levensvatbaarheid kwantificering van GC aggregaties
- Verzamelen van GC met behulp van een steriele applicator. Doekje GC van de plaat en resuspendeer GC in voorverwarmde Bouillon (GCP, tabel 3) aangevuld met 4,2% NaHCO3 en 1% Kellogg oplossingen18. Spectrofotometrie gebruikt bij een golflengte van 650 nm (een OD650 1 = ~ 1 x 109 kve/mL) om te bepalen van de concentratie van zwevende bacteriën.
- Aanpassen van de concentratie van GC op ~ 1 x 108 CFU/mL.
- Voeg 99 µL van aangepaste GC schorsing in wells van een 96-wells-plaat.
- Incubeer de plaat gedurende 6 uur bij 37 ° C met 5% CO2 zodat de bacteriën tot totaal.
- Voeg 1 µL van seriële verdunde ceftriaxone (1000, 100, 50, 25, 12,5, 6.2, 3.1, 1.5, 0.8, 0,4 0,2 µg/mL) in elk putje. Laat enkele wells onbehandeld om te dienen als besturingselementen.
- Incubeer de plaat gedurende 24 uur bij 37 ° C met 5% CO2.
- Bewerk ultrasone trillingen ten de suspensie 3 keer in elk putje voor 5 s op 144 W en 20 kHz.
- Voeg 100 µL van verkrijgbare ATP gebruik gloed reagens in elk putje, Pipetteer omhoog-omlaag voor 3 keer en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C met 5% CO2.
- Zorgvuldig 150 µL van het mengsel van elk putje overboeken naar een nieuwe goed in een 96-Wells zwarte microplate en Vermijd invoering van bubbels.
- Meet de extinctie van elk putje op 560 nm met behulp van de-afleesapparaat.
- Bereken de overlevingskans door de verhouding van de lezing verkregen na seriële ceftriaxone behandeling naar de lezing van onbehandelde putten.
3. fluorescentie microscopische analyse van Live/Dead van GC aggregaten
- Verzamelen van GC met behulp van een steriele applicator. Doekje GC van de plaat en resuspendeer GC in voorverwarmde GCP media plus 1% Kellogg supplementen.
- Bepaal het aantal bacteriën door spectrofotometrie bij een golflengte van 650 nm en aanpassen van de concentratie van GC op ~ 1 x 107 CFU/mL.
- Voeg 198 µL van GC schorsing in in 8-well dekglaasje aan-onderste kamers.
- Incubeer de kamer voor 6 uur bij 37 ° C met 5% CO2 toe aggregatie vorming.
- Voeg 2 µL van ceftriaxone (100 µg/mL of verschillende verdunningen) in elk putje binnen elke voorwaarde aggregatie. Incubeer gedurende de gewenste tijd bij 37 ° C met 5% CO2.
- Voeg 0.6 µL van leven/dood kleuring oplossing mengsel in elk putje en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C met 5% CO2.
- Verwerven van Z-reeksen afbeeldingen met behulp van een confocal microscoop (een gelijkwaardige Microscoop kan worden gebruikt).
- Het analyseren van de beelden met behulp van ImageJ software voor het meten van de omvang van de GC aggregaten en de fluorescentie intensiteit ratio (FIR) van het leven-te-dode vlekken in elk aggregaat.
4. de beeldanalyse
- Schatting van de grootte van bacteriële aggregaten.
- Open ImageJ en een afbeelding door een raw-afbeeldingsbestand naar de ImageJ menubalk te slepen.
- Klik op U lijnen in de menubalk ImageJ en cirkel het gebied van elke samenvoeging in de afbeelding.
- Klik analyseren | Maatregel in de menubalk ImageJ.
- Het nummer in een nieuw venster onder de kolom gebied verkrijgen.
- Kwantificering van live-aan-dead verhouding van samenvoegingen
- Open ImageJ en een afbeelding door een raw-afbeeldingsbestand naar de ImageJ menubalk te slepen.
- Klik analyseren | Instellen van metingen in de menubalk ImageJ.
- Controleer de geïntegreerde dichtheid in het pop-upvenster en klik op OK.
- Klik op de afbeelding van de | Kleur | Kanalen Tool in de menubalk en selecteer kleur.
- Controleer kanaal 1 als de fluorescentie voor levende bacteriën kleuring.
- Klik op U lijnen in de menubalk ImageJ en cirkel het gebied van elke aggregatie.
- Klik analyseren | Maatregel in de menubalk ImageJ.
- Het nummer onder de kolom IntDen verkrijgen.
- Channel 2 controleren als de fluorescentie voor dood bacteriële kleuring. Herhaal stappen 4.2.6-4.2.8.
- De live-aan-dead-verhouding verkrijgen door te delen getal uit stap 4.2.8 door getal uit stap 4.2.9.
- Statistische analyse
- GraphPad Prism Open en voer de nummers in ImageJ verkregen aan de gewenste kolom.
- Klik op analyseren en selecteer t testen onder kolom analyses.
- Controleer de gewenste kolom voor vergelijking en klik op OK.
- De P-waarde onder venster analyse te verkrijgen.
- Selecteer de Lineaire regressie onder XY analyses uit stap 4.3.3
- Het R-plein en de P-waarde onder het venster analyse te verkrijgen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Twee methoden werden gebruikt: een ATP gebruik assay en een kwantitatieve analyse voor de kleuring van leven/dood. De resultaten kunnen worden gecombineerd of afzonderlijk gebruikt voor de behandeling van bacteriële voortbestaan binnen aggregaten na behandeling met antibiotica. De ATP gebruik assay gebleken voor het meten van nauwkeurig levensvatbare bacteriën in S. aureus biofilms20,21. Hier, werd MS11Opa + Pil + spannin...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Bacteriën kunnen vormen biofilms tijdens infectie van het menselijk lichaam. Traditionele MIC testen kan niet overeen met de concentratie die nodig zijn voor de uitroeiing van bacteriën in een biofilm. Om te testen antimicrobiële stoffen effecten op een biofilm, kunnen de methoden op basis van biofilm biomassa evenals plating CFUs verkeerde als gevolg van de impact van biofilm structuur. Bijvoorbeeld, werkt de plating-methode alleen als de biofilm kan worden verstoord. Vandaar, de CFU verkregen kan lager zijn dan het wer...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door een subsidie van de National Institute of Health W.S. AI123340 te D.C.S.. L.-C.W., J.W., AC, en E.N. werden ondersteund in het onderdeel/deelname aan "The eerstejaars innovatie & onderzoek Experience"-programma gefinancierd door de Universiteit van Maryland. De financiers had geen rol in de studie ontwerp, gegevensverzameling en analyse, besloten tot bekendmaking van, of de bereiding van het manuscript. Wij erkennen de UMD CBMG Imaging Core voor alle microscopie experimenten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 100x Kellogg's supplement | |||
| Agar | United States Biological | A0930 | |
| BacTiter Assay | Promega | G8232 | |
| Ceftriaxone | TCI | C2226 | |
| Difco GC medium base | BD | 228950 | |
| Ferric nitrate, nonahydrate | Sigma-Aldrich | 254223-10G | |
| Glucose | Thermo Fisher Scientific | BP350-1 | |
| L-glutamine Crystalline Powder | Fisher Scientific | BP379-100 | |
| BacLight live/dead staining | Invitrogen | L7012 | |
| MS11 Neisseria gonorrhoeae strain | vriendelijk verstrekt door Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research | ||
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | P290-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Proteose Peptone | BD Biosciences | 211693 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-10 | |
| Soluble Starch | Sigma-Aldrich | S9765 | |
| Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754-5G | |
| Equipment | |||
| Petri Dishes | VWR | 25384-302 | |
| 8-well coverslip-bottom chamber | Thermo Fisher Scientific | 155411 | |
| 96-well tissue culture plates | Corning, Falcon | 3370 | |
| Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood) | Nuaire | 32776 | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | Model 3530 | |
| Confocal microscope equipped with live imaging chamber | Leica | SP5X | |
| Corning 96 Well Black Polystyrene Microplate | Corning | 3904 | |
| Glomax Illuminator | Promega | E6521 | |
| Pipette tips (0.1-10 µL) | Thermo Fisher Scientific | 02-717-133 | |
| Pipette tips (1000 µL) | VWR | 83007-382 | |
| Pipette tips (200 µL) | VWR | 53509-007 | |
| Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV | Pharmacia Biotech | 80-2106-00 | |
| Sterile 15 ml conical tubes | VWR | 21008-216 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL) | Sorenson BioScience | 16070 | |
| Sterile polyester-tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-122 | |
| Sonicator | Kontes | Equivelent to 9110001 |
Referenties
- CDC STD Facts. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: http://www.cdc.gov/std/gonnorrhea/STDFact-gonorrhea-detailed.htm (2017).
- den Heijer, C. D., et al. A comprehensive overview of urogenital, anorectal and oropharyngeal Neisseria gonorrhoeae testing and diagnoses among different STI care providers: a cross-sectional study. BMC Infectious Diseases. 17 (1), (2017).
- Hein, K., Marks, A., Cohen, M. I. Asymptomatic gonorrhea: prevalence in a population of urban adolescents. The Journal of Pediatrics. 90 (4), 634-635 (1977).
- Hananta, I. P., et al. Gonorrhea in Indonesia: High Prevalence of Asymptomatic Urogenital Gonorrhea but No Circulating Extended Spectrum Cephalosporins-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strains in Jakarta, Yogyakarta, and Denpasar, Indonesia. Sexually Transmitted Diseases. 43 (10), 608-616 (2016).
- Chlamydia, W. H. O. Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, syphilis and Trichomonas vaginalis. Methods and results used by WHO to generate 2005 estimates. World Health Organisation, 2011. Prevalence and incidence of selected sexually transmitted infections. World Health Organisation. , accessed Oct 5 (2011).
- Mayor, M. T., Roett, M. A., Uduhiri, K. A. Diagnosis and management of gonococcal infections. American Family Physician. 86 (10), 931-938 (2012).
- Alirol, E., et al. Multidrug-resistant gonorrhea: A research and development roadmap to discover new medicines. PLOS Medicine. 14 (7), (2017).
- Workowski, K. A., Bolan, G. A. Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2015. MMWR Recommendations and Reports. 64, 1-137 (2015).
- Lahra, M. M., et al. Cooperative Recognition of Internationally Disseminated Ceftriaxone-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strain. Emerging Infectious Diseases. 24 (4), (2018).
- Wi, T., et al. Antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae: Global surveillance and a call for international collaborative action. PLOS Medicine. 14 (7), 1002344(2017).
- Singh, S., Singh, S. K., Chowdhury, I., Singh, R. Understanding the Mechanism of Bacterial Biofilms Resistance to Antimicrobial Agents. Open Microbiology Journal. 11, 53-62 (2017).
- Greiner, L. L., et al. Biofilm Formation by Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 73 (4), 1964-1970 (2005).
- Zollner, R., Oldewurtel, E. R., Kouzel, N., Maier, B. Phase and antigenic variation govern competition dynamics through positioning in bacterial colonies. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
- Stein, D. C., et al. Expression of Opacity Proteins Interferes with the Transmigration of Neisseria gonorrhoeae. across Polarized Epithelial Cells. PLoS One. 10 (8), 0134342(2015).
- LeVan, A., et al. Construction and characterization of a derivative of Neisseria gonorrhoeae strain MS11 devoid of all opa genes. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6468-6478 (2012).
- Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Curr Protoc Microbiol. , Chapter 1., Unit 1B.1 (2005).
- Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
- White, L. A., Kellogg, D. S. Neisseria Gonorrhoeae Identification in Direct Smears by a Fluorescent Antibody-Counterstain Method. Journal of Applied Microbiology. 13, 171-174 (1965).
- Swanson, J., Kraus, S. J., Gotschlich, E. C. Studies on gonococcus infection. I. Pili and zones of adhesion: their relation to gonococcal growth patterns. Journal of Experimental Medicine. 134 (4), 886-906 (1971).
- Herten, M., et al. Rapid in Vitro Quantification of S. aureus Biofilms on Vascular Graft Surfaces. Frontiers in Microbiology. 8, 2333(2017).
- Gracia, E., et al. In vitro development of Staphylococcus aureus biofilms using slime-producing variants and ATP-bioluminescence for automated bacterial quantification. Luminescence. 14 (1), 23-31 (1999).
- Webb, J. S., et al. Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Journal of Bacteriology. 185 (15), 4585-4592 (2003).
- Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide. Journal of visualized experiments. (47), (2011).
- Wang, L. C., Litwin, M., Sahiholnasab, Z., Song, W., Stein, D. C. Neisseria gonorrhoeae Aggregation Reduces Its Ceftriaxone Susceptibility. Antibiotics (Basel). 7 (2), (2018).
- Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 510-543 (2014).
- Hall-Stoodley, L., et al. Towards diagnostic guidelines for biofilm-associated infections. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 127-145 (2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
