Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Plaats-geleide mutagenese voor In Vitro en In Vivo experimenten wordt geïllustreerd met RNA interacties in Escherichia Coli

20.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58996

⸱

5 februari 2019

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Southern Denmark

In dit artikel

Samenvatting

Plaats-geleide mutagenese is een techniek die wordt gebruikt om specifieke mutaties in deoxyribonucleic acid (DNA). Dit protocol beschrijft hoe het te doen plaats-geleide mutagenese met een 2-step en 3-staps polymerase-kettingreactie (PCR) gebaseerde benadering, die is van toepassing op elk fragment van DNA van belang.

Samenvatting

Plaats-geleide mutagenese is een techniek die wordt gebruikt om specifieke mutaties in het DNA te onderzoeken van de wisselwerking tussen kleine niet-coderende RNA acid (sRNA) moleculen en doel messenger RNAs (mRNAs). Daarnaast wordt plaats-geleide mutagenese gebruikt voor het toewijzen van specifieke proteïne bandplaatsen aan RNA. Een 2-stap en 3 introductie van de PCR op basis van mutaties wordt beschreven. De aanpak is relevant voor alle eiwit-RNA en RNA-RNA interactie studies. Kortom, de techniek is gebaseerd op het ontwerpen van inleidingen met de gewenste mutation(s), en door middel van 2 of 3 stappen van PCR synthese van een PCR-product met de mutatie. Het PCR-product wordt vervolgens gebruikt voor het klonen. Hier beschrijven we hoe u kunt plaats-geleide mutagenese met zowel de 2 - en 3-stap-benadering om mutaties op de sRNA, McaS en de mRNA, csgD, RNA-RNA en de RNA-eiwit interacties te onderzoeken uitvoeren. We passen deze techniek om te onderzoeken van RNA interacties; de techniek is echter die van toepassing zijn op alle mutagenese studies (bijv. DNA-eiwit interactie, aminozuur vervanging/verwijderen/toevoeging). Het is mogelijk om elke vorm van mutatie met uitzondering van niet-natuurlijke grondslagen, maar de techniek is alleen van toepassing als een PCR-product kan worden gebruikt voor downstream toepassing (bijvoorbeeld klonen en sjabloon voor verdere PCR).

Inleiding

DNA wordt vaak genoemd de blauwdruk van een levende cel omdat alle structuren van de cel zijn gecodeerd in de opeenvolging van haar DNA. Nauwkeurige replicatie en DNA herstelmechanismes voorkomen dat slechts zeer lage tarieven van mutaties, die is van essentieel belang voor de instandhouding van de juiste functies van gecodeerde genen. Wijzigingen van de opeenvolging van DNA kunnen opeenvolgende functies op verschillende niveaus, beginnend met DNA (erkenning door de transcriptiefactoren en restrictie-enzymen), vervolgens RNA (base-paar complementariteit en secundaire structuur verbouwingen) en/of eiwit (amino zure vervangingen, weglatingen, toevoegingen of frame-verschuivingen). Terwijl vele mutaties genfunctie niet aanzienlijk beïnvloeden, kunnen sommige mutaties in het DNA grote gevolgen hebben. Plaats-geleide mutagenese is dus een waardevol instrument voor het bestuderen van het belang van specifieke DNA sites op alle niveaus.

Dit protocol beschrijft een gerichte mutagenese aanpak gebruikt om specifieke mutaties. Het protocol is gebaseerd op twee verschillende strategieën van de PCR: een 2-step of een 3-stap-PCR. De 2-staps-PCR is van toepassing als de gewenste mutatie dicht bij de 5' eindigt of het einde 3' van het DNA van belang ligt (< 200 basenparen (bp) vanaf het einde) en de 3-staps PCR geldt in alle gevallen.

In de benadering van de PCR 2-step 3 primers zijn ontworpen, waarin een reeks inleidingen is ontworpen om de DNA van belang (inleidingen 1 en 3, vooruit en achteruit, respectievelijk) te vergroten en een enkele primer is ontworpen om op te nemen van de mutatie. De invoering van de primer (primer 2) mutatie moet een omgekeerde oriëntatie als de mutatie dicht bij het 5'-eind en een voorwaartse richting ligt als de mutatie dicht bij de 3'-eind ligt. In de eerste stap van de PCR versterkt primer 1 + 2 of 2 + 3 een klein fragment dicht bij de 5' end of 3' end, respectievelijk. Het resulterende PCR product wordt dan gebruikt als een primer in stap twee met primer 1 of 3, dus wat resulteert in een PCR-product met een mutatie in het DNA van belang (figuur 1A).

In de 3-staps PCR, 4 primers zijn ontworpen, waarin een reeks inleidingen is ontworpen om de DNA van belang (inleidingen 1 en 4, vooruit en achteruit, respectievelijk) te vergroten en een reeks inleidingen is ontworpen voor het opnemen van specifieke mutaties met overlappende complementariteit (inleidingen 2 en 3, reverse en doorstuurt, respectievelijk). In stap één en twee, inleidingen 1 + 2- en 3 + 4 versterken het einde 5' en 3'. In stap drie, de resulterende PCR producten uit stap 1 en 2 worden gebruikt als sjablonen en versterkt met inleidingen 1 + 4. Het resulterende PCR product is dus het DNA van belang met de gewenste Mutatie (figuur 1B).

Terwijl de gemuteerde DNA kan worden gebruikt voor elke stroomafwaartse toepassing, wordt dit protocol beschreven hoe opnieuw het combineren van het DNA in een klonen vector. Het gebruik van klonen van vectoren heeft verschillende voordelen zoals gebruiksgemak klonen en specifieke experimentele toepassingen afhankelijk van de eigenschappen van de vector. Deze functie wordt vaak gebruikt voor RNA interactie studies. Een andere techniek voor RNA interactie studies is structurele sonderen van het RNA in complex met een andere RNA1,2 of eiwit3,4. Echter, structurele indringende wordt alleen uitgevoerd in vitro overwegende dat plaats-geleide mutagenese en latere klonen toestaan voor interactie studies in vivo.

Plaats-geleide mutagenese is uitgebreid gebruikt voor RNA interactie studies zoals hier gepresenteerd. Echter de belangrijkste met betrekking tot 2 - of 3-staps PCR-methode is van toepassing op elk stuk van DNA, en dus niet alleen beperkt tot RNA-interactie studies.

Om te illustreren de techniek en het mogelijke gebruik ervan, wordt karakterisering van regio's belangrijk voor verordening van de post-transcriptional van het mRNA, csgD, van Escherichia coli (E. coli) gebruikt. In E. coli, csgD wordt gericht door de kleine niet-coderende RNA, McaS, in samenwerking met een eiwit, Hfq, te onderdrukken van eiwit-expressie van CsgD2,4,5. De techniek wordt gebruikt voor het invoeren van mutaties voor de regio van base-paring tussen csgD en McaS, en op de site van de bindende Hfq van csgD. Het verkregen DNA wordt vervolgens gekloond in een vector geschikt voor latere experimenten. Downstream toepassingen van de techniek omvatten zowel in vivo en in vitro experimenten. Ter illustratie, voorbeeld 1 is gekenmerkt in vivo met behulp van een westelijke vlek assay en voorbeeld 2 in vitro met behulp van een kwantitatieve analyse van elektroforetische mobiliteit, shift (EMSA) wordt gekenmerkt. In beide gevallen is geïllustreerd hoe plaats-geleide mutagenese kan worden gebruikt in combinatie met andere technieken voor het maken van biologische conclusies over een gen van belang.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. vector selectie

  1. Kies een vector naar stroomafwaartse expermenteren uitvoeren. Elke vector is van toepassing voor deze 2 - en 3-staps PCR methode.
  2. Op basis van de keuze van vector, kies passende enzymen van de beperking voor het klonen.

2. primer ontwerp voor site gericht mutagenese

  1. Kiezen tussen ofwel de 2-step of 3-step PCR-strategie (2-step is alleen voor mutaties < 200 bp uiteinden van DNA van belang). Voor de 2-staps-PCR, gaat u naar stap 2.2 en ga naar stap 2.3 voor de 3-stap-PCR.
  2. Inleidingen voor PCR 2-step ontwerpen.
    1. Ontwerp primer 1 en 3 te vergroten van DNA van belang en met een 5' overhang die bevat 4 nucleotiden (bijvoorbeeld ATAT of AGCT) gevolgd door de relevante erkenning beperkingsplaats nodig te klonen in de gekozen vector.
    2. Ontwerp primer 2 in te voeren van mutation(s) op de gewenste site (s) en de flank van de mutatie met 10-15 complementaire nucleotiden aan beide zijden. Maak de primer omgekeerde als de mutatie wordt ingevoerd aan de 5'-eind vooruit of achteruit als de mutatie wordt ingevoerd aan de 3'-eind.
  3. Inleidingen voor PCR 3-staps ontwerpen.
    1. Ontwerp primer 1 en 4 te vergroten van DNA van belang en met een 5' overhang die bevat 4 nucleotiden (bijvoorbeeld ATAT of AGCT) gevolgd door de relevante erkenning beperkingsplaats nodig te klonen in de gekozen vector.
    2. Ontwerp primer 2 en 3 in te voeren van de mutation(s) op de gewenste site (s) en de mutatie flank door 10-15 complementaire nucleotiden aan beide zijden. Primer 2 en 3 zijn complementaire omkeren.

3. de PCR versterking van wild type DNA voor het klonen

Opmerking: Zie voor details over PCR,6.

  1. Het uitvoeren van PCR6 gebruikend inleidingen 1 + 2 (2-step PCR) of 1 + 4 (3-staps PCR) en wild type DNA gebruiken als sjabloon voor gebruik van PCR product I. de PCR-programma in tabel 1.
  2. PCR valideren door agarose gelelektroforese.
    1. Maak een agarose gel oplossing (2%) door toevoeging van 2 g agarose per 100 mL 1 x Tris-acetaat-ethyleendiamminetetra zuur (EDTA) (TAE) buffer. Los de agar door te koken in een magnetron. Toevoegen van de DNA-kleuring kleurstof ethidiumbromide (om een eindconcentratie van ~ 0,5 µg/mL) aan de agarose gel oplossing voor visualisatie.
    2. Gegoten agarose gel, plaats het in een eenheid van elektroforese en PCR monsters (gemengd met DNA laden kleurstof) en een DNA-ladder van bekende grootte laden. Voorbeelden uitvoeren op 75 W voor 45 min of totdat bands adequaat worden gescheiden, en visualiseren van bands aan een ultraviolet (UV) tafel of met een gel imaging systeem.
  3. Zuiveren van het PCR-product met een gel extractie kit (Tabel van materialen) en de concentratie van gezuiverde DNA meten met een spectrofotometer (Tabel van materialen).
  4. Het gezuiverde DNA bij-20 ° C (in Tris-EDTA (TE) buffer-lange termijn opslag) of 4 ° C (in dH2O-korte termijn opslag) bewaren tot gebruikte in stap 5.

4. de PCR om plaats-geleide mutaties in het DNA

  1. PCR voor 2-step PCR (zie stap 4.2 voor 3-staps PCR)
    1. Uitvoeren van PCR6 gebruikend inleidingen 1 + 2 of mutaties zijn uiteindelijk 5' 2 + 3 als de mutaties in de 3' beëindigen en wild type DNA PCR product II te verkrijgen als sjabloon te gebruiken (Zie tabel 1 voor PCR programma).
    2. PCR valideren door agarose de Elektroforese van het gel zoals in stap 3.2.1 en 3.2.2.
    3. Zuiveren van het PCR-product met een gel extractie kit (Tabel van materialen) en de concentratie van gezuiverde DNA meten met een spectrofotometer (Tabel van materialen).
    4. Winkel gezuiverd DNA bij-20 ° C (in TE de buffer) of 4 ° C (in dH2O) tot gebruikte in stap 5.
    5. Uitvoeren van PCR6 gebruik van PCR product II als de primer samen met primer 3 als mutaties in de 5' end of primer 1 als de mutaties in de 3'-eind en gebruik van wild type DNA als sjabloon PCR product III te verkrijgen (Zie tabel 1 voor PCR programma).
    6. PCR valideren door agarose de Elektroforese van het gel zoals in stap 3.2.1 en 3.2.2.
    7. Zuiveren van PCR product met een gel extractie kit (Tabel van materialen) en concentratie van gezuiverde DNA meten met een spectrofotometer (Tabel van materialen).
    8. Winkel gezuiverd DNA bij-20 ° C (in TE de buffer) of 4 ° C (in dH2O) tot en met stap 5.
  2. PCR voor 3-staps PCR
    1. Het uitvoeren van PCR6 gebruikend inleidingen 1 + 2- en 3 + 4 in aparte reacties en wild type DNA gebruiken als sjabloon voor PCR product II en III (Zie tabel 1 voor PCR programma).
    2. Agarose de Elektroforese van het gel zoals in stap 3.2.1 en 3.2.2 PCRs valideren.
    3. Zuiveren van PCR producten met een gel extractie kit (Tabel van materialen) en de concentratie van gezuiverde DNA meten met een spectrofotometer (Tabel van materialen).
    4. Winkel gezuiverd DNA bij-20 ° C (in TE de buffer) of 4 ° C (in dH2O).
    5. Het uitvoeren van PCR6 gebruikend inleidingen 1 + 4 en 2-5 ng van beide PCR producten II en III te gebruiken als de sjablonen (in dezelfde reactie) te verkrijgen van PCR product IV (Zie tabel 1 voor PCR programma).
    6. PCR valideren door agarose de Elektroforese van het gel zoals in stap 3.2.1 en 3.2.2.
      Opmerking: Het is niet ongebruikelijk om verschillende onjuiste bands (kan soms worden verminderd door met minder sjabloon). De onjuiste PCR producten kunnen echter worden genegeerd als de correct formaat band is weggesneden en gel-geëxtraheerde.
    7. Als dit correct zuiveren van PCR product met een gel extractie kit (Tabel van materialen) en concentratie van gezuiverde DNA meten met een spectrofotometer (Tabel van materialen).
    8. Winkel gezuiverd DNA bij-20 ° C (in TE de buffer) of 4 ° C (in dH2O) tot en met stap 5.

5. recombinatie van wild type en mutant versie (s) van DNA in de gekozen vector

Opmerking: Voor meer informatie over het als volgt, Zie7.

  1. Digest gezuiverd PCR producten I en III (uit 2-step PCR) en/of IV (vanaf 3-staps PCR) met behulp van de desbetreffende enzymen van de beperking.
    1. In 20 µL 1 x spijsvertering buffer met 1 µL van elke restrictie-enzym, digest 200 ng van PCR product bij 37 ° C gedurende 30-60 min.
  2. Zuiveren van verteerd PCR-product door gel-extractie met behulp van een gel extractie kit (Tabel of Materials), meten van de concentratie van de DNA van gezuiverde DNA met een spectrofotometer (Tabel van materialen) en opslaan bij-20 ° C (in TE de buffer) of 4 ° C (in dH2 O) totdat gebruikt voor stap 5.6.
  3. Gezuiverde vector met relevante restrictie-enzymen verteren en behandelen met alkalische fosfatase afnemen van vector opnieuw afbinding gebeurtenissen. PCR producten met alkalische fosfatase niet behandelen.
    1. In 30 µL 1 x spijsvertering buffer met 1 µL van elke restrictie-enzym en 1 µL van alkalische fosfatase, digest 1000 ng van de vector bij 37 ° C gedurende 30-60 min.
  4. Aparte verteerd vector uit afval DNA (bijvoorbeeld Onbesneden vector en cut-out met DNA) met behulp van agarose de Elektroforese van het gel zoals in stap 3.2.1 en 3.2.2.
  5. Zuiveren van verteerd vector door gel-extractie met behulp van een gel extractie kit (Tabel of Materials), DNA concentratie van gezuiverde DNA meten met een spectrofotometer (Tabel van materialen) en opslaan bij-20 ° C (in TE de buffer) of 4 ° C (in dH2O) totdat gebruikt voor stap 5.6.
  6. Afbinden verteerd PCR producten in verteerd vector met de reacties die in tabel 2aangegeven.
  7. Incubeer bij kamertemperatuur voor 2 h of 's nachts bij 16 ° C.
  8. Tover het ontvangende stam (bijvoorbeeld E. coli K12) met afbinding reacties.
    1. Stam groeien tot OD600= 0.3-0.5 en overdracht een 1 mL cultuur zoveel 1,5 mL buizen als ligase reacties.
    2. Draai bij 3500 x g gedurende 5 min en weggeworpen.
    3. Resuspendeer de cellen in 200 μL van transformatie buffer (10 mL lysogenie Bouillon (LB) met 0,1 g/mL polyethyleenglycol 3350, 5% dimethyl-sulfaat en 20 mM MgCl2).
    4. Afbinding reactie toevoegen, en plaats de buizen op ijs gedurende 30 minuten.
    5. Warmte-schok voor 2 min op 42 ° C.
    6. Voeg 1 mL LB de 1,5 mL buizen, en toestaan van fenotypische expressie van antibiotische weerstand gedurende ten minste 45 minuten bij 37 ° C.
    7. Draai de cellen bij 3500 x g gedurende 5 min, werp 1 mL van het supernatans en resuspendeer de cellen in het resterende supernatant.
    8. Plaat van de cellen op platen met de juiste antibiotica en na een nacht bebroeden bij 37 ° C.
  9. Het identificeren van transformants vectoren met succesvolle integratie van DNA invoegen (bijvoorbeeld door PCR met behulp van vector - en insert-specifieke primers) herbergen.
  10. Valideren van de opeenvolging van DNA door sanger sequencing.
    Let op: Gebruik niet de dezelfde inleidingen voor het rangschikken zoals gebruikt voor stap 5,9.

6. gebruik gebouwde vectoren voor in vitro of in vivo experimenten

  1. In vivo experiment
    Opmerking: Dit is een voorbeeld van het gebruik van een vector uitspreken wild type/gemuteerd RNA te karakteriseren post-transcriptional verordening. Zie voor meer informatie over het westelijke bevlekken,8.
    1. E. coli stammen van de K12 met geconstrueerde vectoren in geschikte voedingsbodem groeien en veroorzaken expressie indien nodig. De monsters van de oogst door centrifugeren.
    2. Natrium dodecyl sulfaat-polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) monsters voorbereiden door ontbinding van cel pellets in 1 x SDS monster buffer (62,5 mM Tris-HCl pH 6.8, 2,5% SDS, 0.002% bromophenol blauw, β-mercaptoethanol 5%, 10% glycerol) en kook bij 95 ° C gedurende 5 min.
      Opmerking: Het is mogelijk te werpen van een gel of een commercieel beschikbare geprefabriceerd gel te gebruiken. De laatste werd gebruikt in de resultaten gepresenteerd in Figuur 3 (Tabel van materialen).
    3. Laden van 107 cellen van elk monster in aparte wells (inclusief de ladder van een eiwit), en stel gel bij 200 V tot eiwitten zijn gescheiden (ongeveer 45 min).
    4. Vlek van de eiwitten op een cellulose-membraan door semi-droge overdracht bij 80 mA gedurende 1 uur.
    5. Het blokkeren van het membraan met een mengsel van eiwitten (bijvoorbeeld 5% melk-poeder opgelost in 1 x Tween 20-Tris-gebufferde zoutoplossing (TTBS) buffer).
    6. Voeg primair antilichaam (opgelost in 1 x TTBS buffer) die zijn bestemd voor de proteïne van belang (bijvoorbeeld GFP-, vlag- of HIS-gelabeld eiwit) en incubeer gedurende 1 h met zachte agitatie.
    7. Wassen membraan in 1 x TTBS voor 10 min voor het verwijderen van niet-afhankelijke antistoffen. Herhaal tweemaal meer.
    8. Toevoegen van secundair antilichaam (opgelost in 1 x TTBS buffer) die zich richt op de primaire antilichamen en voldoende zijn voor detectie (bijvoorbeeld horseradish peroxidase (HRP)-geconjugeerd secundaire antilichamen. Incubeer gedurende 1 h met zachte agitatie.
    9. Wassen het membraan in 1 x TTBS voor 10 min voor het verwijderen van niet-afhankelijke antistoffen. Herhaal tweemaal meer.
    10. Visualiseer het membraan met een techniek die compatibel is met de secundaire antilichamen (bijvoorbeeld door imaging na incubatie met een luminol afkomstige Chemoluminescentie, als een secundair antilichaam met HRP-geconjugeerde werd gebruikt).
  2. In vitro experiment
    Opmerking: Dit is een voorbeeld van het gebruik van de vector als een sjabloon voor in vitro transcriptie van RNA te karakteriseren van RNA-eiwit interacties. Zie voor verdere details over de EMSA,9.
    1. In vitro afschriften met behulp van een T7 in vitro transcriptie kit (Tabel van materialen) en vectoren uit stap 5 als sjablonen maken
    2. Scheiden van RNA transcripties door pagina op een 4,5% 7 M ureum denaturering van gel, en RNA rechtstreeks extraheren uit de gel door electro elutie met dialyse buizen (Tabel van materialen).
    3. Label RNA (bijv, radiolabeling met γ -32P-ATP met behulp van T4-polynucleotide kinase (Tabel van materialen) en weer te zuiveren met kolommen (Tabel van materialen).
      Let op: Voordat u gaat werken met radioactief materiaal, overleggen met de veiligheidsbeambte van de lokale straling.
    4. Meng geëtiketteerd-RNA met toenemende concentraties van eiwitten in aparte reacties in een 1 x bindende buffer (20 mM Tris, pH 8, 100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol (DTT)).
      Opmerking: In de gepresenteerde resultaten (Figuur 4), 2 nM radiolabeled csgD mRNA werd gemengd met een helling van 0 tot en met 2 µM Hfq eiwit (monomeer concentratie).
    5. Het toestaan van eiwitten en RNA vóór het laden van hybridisatie mix op een niet-denaturering polyacrylamidegel te vermengen en uitvoeren van de gel voor 1,5 h bij 200 V.
    6. Visualiseer de gel met een techniek die compatibel zijn met het labelen van stap 6.1.3. (bijvoorbeeld door phosphoimaging als radiolabeling werd toegepast).
    7. Kwantificeren van de relatieve intensiteit van de verschoven bands met een beeldvorming verwerking programma en passen een kromme (sigmoïdale) de gegevens met behulp van een grafiek en de software van de analyse van de gegevens (Tabel van materialen). Op basis van de ingerichte curve, kunnen dissociatie constante (Kd) waarden worden automatisch bepaald met de software.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Te onderzoeken van RNA interacties met betrekking tot post-transcriptional regulering van csgD, een dubbele vector setup werd gekozen: één aan de csgD express mRNA en andere kleine niet-coderende RNA, McaS uitspreken. csgD in pBAD33, oftewel een arabinose afleidbare-medium-kopie plasmide met chlooramfenicol weerstand werd gekloond en McaS werd gekloond in mini R1 pNDM220, oftewel een plasmide isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) afleidbare laag kopie met...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Plaats-geleide mutagenese heeft een breed scala van verschillende toepassingen, en hier, representatieve resultaten van een in vivo en in vitro experiment werden opgenomen als voorbeelden van hoe te maken van biologische conclusies met behulp van de techniek. Plaats-geleide mutagenese geweest voor lang de gouden standaard voor RNA interactie studies. De sterkte van de techniek ligt in de combinatie van de invoering van de relevante mutaties met stroomafwaartse tests en experimenten (bijv. westelijke vlek of EMSA) conclus...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Dankbetuigingen

De auteurs bedank Universiteit van Zuid-Denemarken open access beleid subsidies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Anti-GroEL antibody produced in rabbitMerckG6532Primair antilichaam
Azure c200AzureNAGelbeeldvorming werkstation
Custom DNA oligoMerckVC00021
DeNovix DS-11DeNovixNASpectrofotometer voor nucleïnezuurmetingen
DNA Gel Loading Dye (6X)Thermo ScientificR0611
Ethidium bromide oplossing 1 %Carl Roth2218.1
GeneJET Gel Extractie KitThermo ScientificK0691
GeneRuler DNA Ladder MixFermentasSM0333
Gerard GeBAflex-buis MidiGerard BiotechTO12Dialysebuizen voor elektro-elutie
MEGAscript T7 Transcriptie KitInvitrogenAM1334
Mini-Sub Cell GT CellBio-Rad1704406Horizontaal elektroforese systeem
Monoclonal ANTI-FLAG M2 antilichaam geproduceerd in muisMerckF3165Primair antilichaam
Muis ImmunoglobulinenDako CytomationP0447HRP geconjugeerde secundair antilichaam
NucleoSpin miRNAMacherey Nagel740971RNA-zuivering
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Eiwit GelsThermo ScientificNP0323BOXBis-Tris gels voor eiwitscheiding
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix met HF BufferNew England BiolabsM0531SDNA polymerase
PowerPac HC HoogstroomvoedingBio-Rad1645052
Konijn ImmunoglobulinenDako CytomationP0448HRP geconjugeerde secundair antilichaam
SeaKem LE AgaroseLonza50004
SigmaPlotSystat Software IncNAGrafiek- en dataanalyse softwaretool
T100 Thermische CyclerBio-Rad1861096PCR machine
T4 DNA ligaseNew England BiolabsM0202Ligase
T4 Polynucleotide KinaseNew England BiolabsM0201S
TAE Buffer (Tris-acetaat-EDTA) (50X)Thermo ScientificB49

Referenties

  1. Bouvier, M., et al. Small RNA binding to 5' mRNA coding region inhibits translational initiation. Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).
  2. Jorgensen, M. G., et al. Small regulatory RNAs control the multi-cellular adhesive lifestyle of Escherichia coli. Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).
  3. Antal, M., et al. A small bacterial RNA regulates a putative ABC transporter. The Journal of Biological Chemistry. 280 (9), 7901-7908 (2005).
  4. Andreassen, P. R., et al. sRNA-dependent control of curli biosynthesis in Escherichia coli: McaS directs endonucleolytic cleavage of csgD mRNA. Nucleic Acids Research. , (2018).
  5. Thomason, M. K., et al. A small RNA that regulates motility and biofilm formation in response to changes in nutrient availability in Escherichia coli. Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).
  6. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).
  7. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
  8. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
  9. JoVE Science Education Database. Biochemistry. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA). Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
  10. Kunkel, T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (2), 488-492 (1985).
  11. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
  12. Wells, J. A., Vasser, M., Powers, D. B. Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites. Gene. 34 (2-3), 315-323 (1985).
  13. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  14. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

PCR amplificatiegelelektroforeseWestern blottingEMSA analyseDNA kloneringprimerontwerpopslag in TE bufferagarosegel
Plaats-geleide mutagenese voor In Vitro en In Vivo experimenten wordt geïllustreerd met RNA interacties in Escherichia Coli
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.