Immobilisatie van levende Caenorhabditis elegans personen een Ultra-thin Polydimethylsiloxaan Microfluidic Chip met waterretentie

Samenvatting

Een reeks van immobilisatie methoden is vastgesteld dat de gerichte bestraling van levende Caenorhabditis elegans individuen met behulp van een onlangs ontwikkelde ultradunne Polydimethylsiloxaan microfluidic chip met waterretentie. Deze roman op de chip immobilisatie is ook geschikt voor imaging opmerkingen. De gedetailleerde behandeling en toepassingsvoorbeelden van de chip worden toegelicht.

Samenvatting

Straling wordt veel gebruikt voor biologische toepassingen en voor de ion-beam fokkerij, en onder deze methoden, microbeam bestraling vertegenwoordigt een krachtig instrument om radiosensitive sites in levende organismen te identificeren. Dit witboek beschrijft een aantal op-Spaander immobilisatie methoden ontwikkeld voor de gerichte microbeam doorstraling van levende individuen van Caenorhabditis elegans. Met name de behandeling van de Polydimethylsiloxaan (PDMS) microfluidic chips die we eerder ontwikkeld om te immobiliseren C. elegans individuen zonder de noodzaak voor verdoving wordt uitgelegd in detail. Deze chip, een worm blad, hierna is veerkrachtig om de kanalen van de microfluidic worden uitgebreid en de elasticiteit laat dieren voorzichtig worden gehuld. Ook, als gevolg van de capaciteit van de zelfstandige adsorptie van het PDMS, dieren kunnen worden afgesloten in de kanalen door die betrekking hebben op het oppervlak van de worm blad met een dunne dekking-film, waarin dieren niet in de kanalen voor behuizing duwde zijn. Door draaien de cover film over, kunnen we gemakkelijk de dieren verzamelen. Bovendien, het blad van de worm toont waterretentie en kan C. elegans personen onderworpen aan microscopische observatie gedurende lange perioden live omstandigheden. Bovendien, is het blad slechts 300 µm dik, waardoor zware ionen zoals koolstof ionen aan het passeren van het blad bijvoeging van de dieren, waardoor de ion deeltjes worden gedetecteerd en de toegepaste stralingsdosis te nauwkeurig worden gemeten. Omdat de selectie van de dekking films gebruikt voor bijvoeging van de dieren is erg belangrijk voor een succesvolle langdurige immobilisatie, we uitgevoerd van de selectie van de geschikte dekking films en toonde een aanbevolen één onder sommige films. Als een voorbeeld van de toepassing van de chip introduceerden we imaging observatie van gespierde activiteiten van dieren bijvoeging van het kanaal van de microfluidic van het blad van de worm, evenals dedoorstraling van microbeam. Deze voorbeelden geven aan dat de worm bladen hebben breidde de mogelijkheden voor biologische experimenten.

Inleiding

Straling, met inbegrip van x-stralen, gamma stralen en zware-ion beam, wordt veel gebruikt voor biologische toepassingen zoals in diagnose en behandeling, en voor de ion-beam fokkerij. Talloze studies en technische ontwikkelingen zijn momenteel gericht op de gevolgen van straling^1,2,3. Bestraling van de Microbeam is een krachtig instrument van identificatie van de radiosensitive sites in levende organismen⁴. De Takasaki geavanceerde straling Instituut voor nationale onderzoeksinstituten voor Quantum en radiologische wetenschap en technologie (QST-Takas....

Protocol

1. de stammen en onderhoud

1. Selecteer een geschikte stam van C. elegans en Escherichia coli (voedsel) afhankelijk van het doel van het experiment.
   Opmerking: In het huidige document, wild-type N2¹⁰C. elegans (Figuur 2)wordt in het algemeen, en HBR4:goeIs3 [pmyo-3::GCamP3.35::unc-54 - 3' utr, unc-119(+)] V¹¹ wordt alleen gebruikt voor imaging-assay. E. coli OP50 werd gebruikt als voedsel voor C. elegans. Sommige mutanten met abnormale lichaamsvorm, zoals de unc-119(e2498) III -mutant met een opgerolde ....

Resultaten

Actieve C. elegans individuen kunnen worden geïmmobiliseerd met succes met behulp van een ultra-dunne, bevochtigbaar PDMS, microfluidic chip (worm vel). We onderzochten de geschiktheid van verschillende cover films voor het afdichten van de worm blad, zoals beschreven in sectie 3 protocol. Om de afdichting effecten van de cover-films, wij vastbesloten de motiliteit van dieren 3 h na op-Spaander immobilisatie gebruik cover glas (dikte: 130-170 µm), PET-film (dikte: 125 µm), en PS .......

Discussie

Op de chip immobilisatie van C. elegans live omstandigheden met behulp van een bevochtigbaar PDMS microfluidic chip kunt efficiënt gerichte microbeam dedoorstraling van meerdere dieren. Het gemak van behandeling en functies om te voorkomen dat het drogen maken dit systeem geschikt voor toepassingen in microbeam bestraling, maar ook in verschillende gedrags testen. Deze worm bladen hebben al zijn gecommercialiseerd en kunnen gemakkelijk worden verkregen. Conventionele microfluidic chips, zoals olfactorische chips.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
C. elegans wild-type strain	Caenorhabditis Genetics Center (CGC), Minnesota, USA	N2	Wild-type C. elegans strain generally used in this study
C. elegans unc-119(e2498) III mutant strain	Caenorhabditis Genetics Center (CGC), Minnesota, USA	CB4845	C. elegans strain only employed as an example of mutants with abnormal body shape
C. elegans transgenic strain HBR4	Caenorhabditis Genetics Center (CGC), Minnesota, USA	HBR4	The genotype of this transgenic C. elegans strain is HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35:: unc-54–3’utr, unc-119(+)]V. This strain was only employed for imaging observation.
E. coli strain	Caenorhabditis Genetics Center (CGC), Minnesota, USA	OP50	E. coli strain used as food for C. elegans
Worm Sheet IR (50/60)	Biocosm, Inc., Hyogo, Japan	BCM17-0001	Microfluidic chip with 25 straight 50/60-µm width channels used in all experiments and observation in this paper
Worm Sheet 60	Biocosm, Inc., Hyogo, Japan	BCM18-0001	Microfluidic chip with 20 straight 60 µm-width channels. This is sitable for adults 3-5 days after hatching at 20°C.
Worm Sheet 50	Biocosm, Inc., Hyogo, Japan	BCM18-0002	Microfluidic chip with 20 straight 50 µm-width channels. This is sitable for youg adults ~3 days after hatching at 20°C.
MICRO COVER GLASS	MATSUNAMI GLASS IND. LTD.	C030401	Cover glass (thickness: 130-170 µm) used in locomotion assays in Protocol 3
Polystyrene Film	Biocosm, Inc., Hyogo, Japan	BCM18-0001/ BCM18-0002	Bundled items of Worm Sheets. PS filim (thickness: ~130 µm) used in locomotion assays in Protocol 3.
Polyester Film Lumirror	TORAY INDUSTRIES, INC., Tokyo, Japan	Lumirror T60 (t 125 µm)	PET filim (thickness: 125 µm) used in locomotion assays in Protocol 3
IWAKI 60 mm/non-treated dish	AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan).	1010-060	Non-treated dish used in incuvation of C. elegans in Protocol 1
IWAKI 35 mm/non-treated dish	AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan).	1010-035	Non-treated dish used in locomotion assays in Protocol 3
Milli-Q	Merck, France		Ultrapure water
Kimwipe S-200	Nippon Paper Crecia Co., Ltd., Tokyo, Japan	62020	120 mm x 215 mm; 200 sheets/ box
WormStuff Worm Pick	Genesee Scientific Corporation, CA, USA)	59-AWP	Platina picker specilized for picking up C. elegans
Research Stereo Microscope System	OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan	SZX16	Micriscope used in all experiments and observation in this paper
Motorized Focus Stand for SZX16	OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan	SZX2-ILLB	This was used for bright field observation in Protocol 3-8.
Objective Lens (×1)	OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan	SDFPLAPO1×PF	NA: 0.15; W.D.: 60 mm. This lends was used for bright field observation in Protocol 3-8.
Objective Lens (×2)	OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan	SDFPLAPO2XPFC	NA: 0.3; W.D.: 20 mm. This  lends was used for imaging observations.
Mercury Light Source	OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan	U-LH100HG	The broad emission spectrum enables a range of fluorescence imaging experiments to be conducted using all common fluorophores.
SZX16 Fluorescent filter unit (High performance for YFP)	OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan	SZX2-FYFPHQ	Ex: 490-500 nm; Em: 510-560. This was used for imaging observation of HBR4 strain.
Digital Camera High Speed EXILIM	CASIO COMPUTER Co., Ltd, Tokyo, Japan		EX-F1 Figure 1B, 1E, 1F, Figure 2A-C, and Video 1 were obtained by using this digital camera.
Office 2013	Microsoft Co. Ltd, Redmond, WA, USA		EXCEL Software used for statistical analyses