Menselijk Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G detectie van cel-gebaseerde Assay

Samenvatting

Cel-gebaseerde bepaling is een veel gebruikte methode om te detecteren serum anti-aquaporin-4 immunoglobulin G. Deze methode kan worden toegepast op de klinische diagnose en wetenschappelijk onderzoek van neuromyelitis optisch spectrum stoornissen.

Samenvatting

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobuline G (IgG) is de kern van diagnostische biomerker voor neuromyelitis optica spectrum stoornissen (NMOSD). De cel-gebaseerde bepaling (CBA) is een veel gebruikte methode om anti-AQP4 IgG detecteren in menselijk serum met hoge gevoeligheid en specificiteit. Kort, serum anti-AQP4 IgG is gevangen genomen door AQP4-transfected cellen die gefixeerd op de biochip wordt gedetecteerd door een fluoresceïne-gelabeld secundair antilichaam. Fluorescentie microscopie is gebruikt om de fluorescentie te visualiseren, en de intensiteit van de fluorescentie is beoordeeld door ten minste twee ervaren clinici. Een definitieve diagnose van NMOSD kan worden gemaakt op basis van de combinatie van anti-AQP4 IgG detectie resultaten, Klinische manifestaties en neuroradiologische bevindingen. Volgens eerdere studies, CBA is gevoeliger en specifieke dan andere anti-AQP4 IgG detectiemethoden en het kan worden toegepast op zowel de klinische diagnose en de studies van NMOSD. De methode kent beperkingen; bijvoorbeeld, ontbreekt een internationale schaal te evalueren van serum anti-AQP4 IgG titers nog. Hier, wordt een gedetailleerd protocol voor menselijk serum anti-AQP4 IgG detectie met behulp van CBA beschreven.

Inleiding

Serum AQP4 IgG is een kern van diagnostische biomerker voor neuromyelitis optica spectrum stoornissen (NMOSD)¹. De cel-gebaseerde bepaling (CBA) is een veel gebruikte anti-AQP4 IgG detectiemethode met hoge gevoeligheid en specificiteit. Hier, wordt een gedetailleerd protocol voor CBA ingevoerd.

AQP4, een water kanaal eiwit, heeft zes membraan-spanning eenheden en twee spiraalvormige domeinen rondom een waterige poriën². Anti-AQP4 IgG is betrokken bij de pathogenese van NMOSD door middel van binding aan haar doelstelling van AQP4, die vooral op de endfeet van astrocyten^{3 ligt}. Het is aangetoond dat anti-AQP4 IgG positief in ongeveer tweederde van de NMOSD patiënten⁴is. In de meest recente internationale diagnostische criteria voor NMOSD, anti-AQP4 IgG wordt beschouwd als een kern diagnostische biomerker⁵. Het is in dit verband van cruciaal belang om een betrouwbaar protocol voor het detecteren van menselijk serum anti-AQP4 IgG en vergemakkelijken klinische diagnose van NMOSD.

Momenteel zijn de verschillende anti-AQP4 IgG detectiemethoden beschikbaar, zoals CBA, weefsel gebaseerde assay, enzym-verbonden immunosorbent analyse en stroom cytometry^6,7. CBA maakt gebruik van EU90 cellen, die zijn transfected met menselijke AQP4, om vast te leggen van de anti-AQP4 IgG. De vastgelegde anti-AQP4-IgG is ontdekt door fluorescente secundaire antilichamen en vervolgens gevisualiseerd door microscopie. Het vergaren van bewijsmateriaal blijkt dat CBA gevoeliger en specifieke dan andere anti-AQP4 IgG detectie methoden^6,7. Volgens een meta-analyse, de gevoeligheid en specificiteit van CBA bleken te zijn 76% en 99%, die hoger dan het weefsel gebaseerde waren en enzyme-linked immunosorbent testen⁶. Bovendien was een multicenter vergelijking van diagnostische tests van anti-AQP4 IgG transiënte⁷. Een totaal van 193 studie onderwerpen uit 15 Europese diagnostische centra werden ingeschreven⁷. Vier verschillende methoden werden gebruikt om het detecteren van serum anti-AQP4 IgG⁷. Het bleek dat CBA gevoeliger en specifieke dan de andere methoden^{7 was}. Als AQP4 wordt uitgedrukt in twee grote isoforms (AQP4-M1 en AQP4-M23), is anti-AQP4 IgG vangen cel met AQP4-M1 of AQP4-M23 transfected. Welk type van capture cel is echter beter blijft controversieel. Een onderzoek heeft steun verleend aan AQP4-M1 gebaseerde CBA⁸, terwijl anderen hebben aangegeven dat AQP4-M23 gebaseerd CBA is beter^7,9,10. AQP4 M23-gebaseerde CBA kan echter vals-positieve resultaten als gevolg van aspecifieke IgG bindende⁸opleveren. Jarius et al.. ¹¹ gemeld dat er geen significant verschil in anti-AQP4 IgG opsporingstarieven tussen AQP4-M1 en AQP4 M23-gebaseerde CBAs was.

In samenvatting, serum anti-AQP4 IgG is een kern biomerker voor NMOSD. CBA heeft een hogere gevoeligheid dan andere anti-AQP4 IgG detectiemethoden en specificiteit. Het blijft controversieel of AQP4-M1 - of AQP4-M23-gebaseerde CBA beter is. In dit artikel wordt wordt een gedetailleerd protocol voor AQP4-M1 gebaseerde CBA beschreven, die u op de klinische diagnose en onderzoek van NMOSD toepassen kunt.

Protocol

Deze procedure werd goedgekeurd door de ethische commissie van de eerste ziekenhuis van Jilin Universiteit en werd uitgevoerd op ongeveer 1.500 onderwerpen.

1. de patiënt inschrijving en bloed monster collectie

1. De laboratorium-detectie van serum die anti-AQP4 IgG aan patiënten van de kliniek met de belangrijkste klachten en symptomen onderstaande van toepassing. Verricht lichamelijke onderzoeken ook.
   
   Optische neuritis: patiënten lijden met visuele tekorten, zoals verlies van visual velden en vermindering van de gezichtsscherpte.
   Acute myelitis: patiënten kunnen presenteren met verlamming, zintuiglijke tekorten en autonome dysfunctie.
   Gebied postrema syndroom: patiënten symptomen van onverklaarbare hik, misselijkheid of braken kunnen hebben.
   Acute hersenstam syndroom: hersenstam letsels kunnen leiden tot verschillende symptomen en lichamelijke tekens afhankelijk van de locatie van de laesies.
   Symptomatische narcolepsie of acuut diencephalic klinisch syndroom met NMOSD-typische diencephalic MRI laesies.
   Symptomatische cerebrale syndroom met NMOSD-typische laesies van de hersenen.
   
   Opmerking: Volgens de internationale consensus diagnostische criteria voor NMOSD⁵, een diagnose van NMOSD kan worden gemaakt indien de patiënt serum anti-AQP4 IgG-positief en heeft ten minste één van de core klinische kenmerken hierboven vermeld. We raden echter niet testen van anti-AQP4 IgG bij patiënten met optische neuritis alleen.
2. Bloed monster collectie
   Opmerking: patiënten hoeven niet te worden vasten.
   1. 2-3 mL veneuze bloed trekken in een tube 4 mL vacuüm bloed collectie.
   2. Het toestaan van het serum stollen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT).
      Opmerking: Langdurige stolling kan verhogen serum als gevolg van het laten weglekken van bloedplaatjes.
   3. Centrifugeer bij 2100 x g gedurende 5 min. zorgvuldig overbrengen in het serum een nieuwe buis.
   4. Analyseren van de serum onmiddellijk of aliquot en bewaren bij -20 of -80 ° C.
      Opmerking: Opslag bij-20 ° C is voor opslag van maanden, terwijl-80 ° C voor de opslag van het jaar is.

2. anti-AQP4 antistofdetectie

Let op: Patiënt monsters en gebruikte kit reagentia moeten besmettelijke materialen te worden beschouwd. Natrium azide-bevattende reagentia in de kit zijn giftig. Een stroomschema van het protocol wordt gegeven in Figuur 1.

1. Voorbereiding
   1. Breng de kit aan RT vóór gebruik.
      Opmerking: Winkel de kit bij 2-8 ° C.
   2. Bereiden van ten minste 200 mL PBS was buffer met 0,2% tween-20. Giet 100 mL was buffer in een bekerglas van 500 mL.
   3. Verdund serum monsters 10 x met was buffer. De positieve en negatieve controles volgens de instructies van de distributeur voor te bereiden.
2. Monster incubatie
   1. Voeg 30 µL van het vooraf verdunde monsters, positieve controle of negatieve controle op de velden van de reactie van de reagens lade (Figuur 2).
      Opmerking: Vermijd luchtbellen.
   2. Verwijder de beschermende cover op de biochip dia's.
      Opmerking: Raak niet de biochips om te voorkomen dat de onthechting en besmetting van vaste cellen. Houd de dia side-by-side voordat het verwijderen van de afdekking.
   3. De biochip dia toepassen in het reagens lade (Figuur 2). Start een incubatieperiode van 30 min bij RT.
      Opmerking: Elk monster moet een individuele druppel verbonden met de bijbehorende biochip zonder mengen met andere druppels.
   4. Spoel zachtjes de biochip dia eens met was buffer. Dompel de biochip dia in de 500 mL-bekerglas gevuld met 100 mL was buffer voor ten minste 5 min. plaats het bekerglas op een shaker indien mogelijk.
   5. Haal de biochip dia uit de buffer wassen. Zorgvuldig veeg weg de residuele was buffer buiten de reactie velden met een papieren handdoek. Bloot de biochip dia in open lucht voor 1-2 min te verdampen de residuele was buffer op het reactie-veld.
      Opmerking: Niet de reactie velden uitdrogen. Raak niet de biochips met papieren handdoek.
3. Incubatie van secundair antilichaam
   1. Bereid de secundair antilichaam oplossing volgens de instructies van de distributeur.
   2. 25 µL van fluorescerende secundair antilichaam aan de reactie velden voor een schone reagens tray toevoegen.
   3. Toepassing de biochip dia aan het Dienblad van de reagens geladen met secundair antilichaam. Incubeer gedurende 30 min op RT.
4. Montage
   1. De gebruikte was buffer uitstorten en voeg 100 mL vers was buffer af in het bekerglas. Herhaal het wassen zoals beschreven in stappen 2.2.4 en 2.2.5 gelden.
   2. Voeg voorzichtig insluiten medium naar de velden van de reactie op een biochip dia (1 druppel per reactie veld). Verzegel de biochip dia met één stuk cover glas. Vermijd luchtbellen.
5. Fluorescentie detectie
   1. De TL-lamp van Microscoop en pre warmte voor 15 min. Kies een 488 nm-filter inschakelen.
   2. Open foto software. Neem foto's van zowel transfected en untransfected gebieden van alle reactie velden met verschillende vergrotingen. Eerst neem een foto met 4 x vergroting voor een overzicht, waarna meer foto's nemen met 10 x en 20 x vergrotingen.
      Opmerking: Het gedetailleerd protocol wordt weergegeven in tabel 1. Interpretatie van de resultaten wordt besproken in de sectie representatieve resultaten.

3. diagnose van patiënten

1. Indien de patiënt serum anti-AQP4 IgG-positief en toont ten minste één kern klinische kenmerk van NMOSD (zie sectie discussie), de patiënt met NMSOD⁵te diagnosticeren. Echter, indien de patiënt anti-AQP4 IgG-negatief, een diagnose van NMOSD niet mogen worden uitgesloten.

Resultaten

Gebruik de procedure hier, is specifieke anti-AQP4 IgG in het serum aantoonbaar. Tijdens de procedure werden vooraf verdunde monsters, een positieve controle en een negatieve controle toegevoegd aan de reactie velden, waarin transfected en untransfected gebieden (Figuur 2). Fluorescentie van de negatieve controle op een transfected gebied aangegeven vooral de aspecifieke binding van secundair antilichaam transfected cellen op biochips (Fi...

Discussie

Wij hebben een breed toegankelijke methode voor het detecteren van anti-AQP4 IgG in menselijk serum beschreven. Anti-AQP4 IgG is nauw verwant aan NMOSD, en tot vaststelling van een betrouwbare anti-AQP4 IgG detectiemethode is cruciaal voor de klinische diagnose van NMOSD. Ten eerste, anti-AQP4 IgG is specifiek voor de NMOSD. Multiple sclerose is ook een immuun-gemedieerde ziekte van het centrale zenuwstelsel en deelt veel overeenkomsten met NMOSD¹². Anti-AQP4 IgG is echter alleen positieve in NMOS...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Anti-aquaporine-4 IIFT	Euroimmun	FA 1128-2005-50	Bevat biochip-slides bedekt met AQP4-M1 getransfecteerde en niet-getransfecteerde EU 90 cellen, fluoresceïne-gelabeld anti-human IgG, anti-AQP4 antilichaam als positieve controle, antilichaam negatief monster, zout voor PBS pH 7.2, Tween 20 en inbeddingsmedium.
CellSens Dimension	OLYMPUS	N/A	fotografiesoftware
Gel & stolselactivatorbuis	Improve medical	623040202	Van een lokale Chinese onderneming