Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Longitudinale morfologische en fysiologische Monitoring van driedimensionale Tumor spheroïden met behulp van optische coherentie tomografie

7.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59020

⸱

9 februari 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Electrical and Computer Engineering, Lehigh University, 2Department of Mechanical Engineering, Lehigh University, 3Department of Biomedical Engineering, Southern University of Science and Technology, 4Department of Technology R&D, Nexcelom Bioscience LLC, 5Department of Bioengineering, Lehigh University, 6Center for Photonics and Nanoelectronics, Lehigh University

In dit artikel

Samenvatting

Optische coherentie tomografie (OCT), een driedimensionale imaging technologie, werd gebruikt om te controleren en te karakteriseren de kinetiek van de groei van meercellige tumor spheroïden. Precieze volumetrische kwantificering van tumor spheroïden met behulp van een voxel tellen aanpak, en label-vrije dood weefsel detectie in de spheroïden op basis van intrinsieke optische demping daarentegen werden gedemonstreerd.

Samenvatting

Tumor spheroïden zijn ontwikkeld als een driedimensionale (3D) cel cultuur model in kanker onderzoek en anti-kanker drugontdekking. Echter, high-throughput imaging modaliteiten met behulp van lichte veld of fluorescentie detectie, momenteel niet in staat om op te lossen de algemene 3D-structuur van de tumor sferoïde als gevolg van de beperkte licht penetratie, verspreiding van fluorescente kleurstoffen en diepte-resolvability. Onlangs, ons lab aangetoond het gebruik van optische coherentie tomografie (OCT), een label-vrije en niet-destructieve 3D imaging modaliteit, longitudinale karakterisering van meercellige tumor spheroïden om in te voeren een 96-wells-plaat. OCT kon verkrijgen van 3D morfologische en fysiologische informatie van tumor spheroïden groeit tot ongeveer 600 µm in hoogte. In dit artikel tonen we een high-throughput okt (HT-okt) imaging systeem dat de hele multi goed plaat scant en verkrijgt 3D OCT gegevens van tumor spheroïden automatisch. Beschrijven we de details van de HT-OCT systeem en bouw de richtsnoeren in het protocol. Uit de 3D-gegevens van de OCT, een kunt visualiseren de algehele structuur van de sferoïde met 3D gesmolten en orthogonale segmenten, karakteriseren de longitudinale groeikromme van de tumor sferoïde gebaseerd op morfologische informatie van grootte en volume, en controleren van de groei van de dode cellen regio's in de tumor sferoïde gebaseerd op optische intrinsieke demping contrast. We laten zien dat HT-OCT kan worden gebruikt als een high-throughput imaging modaliteit voor drug screening, alsmede het karakteriseren van biofabricated monsters.

Inleiding

Kanker is de tweede belangrijkste doodsoorzaak in de wereld1. Ontwikkeling van geneesmiddelen gericht op kanker is van cruciaal belang voor de patiënten. Geschat wordt echter dat meer dan 90% van de nieuwe anti-kanker medicijnen in de ontwikkelingsfase mislukken als gevolg van een gebrek aan efficiëntie en onverwachte toxiciteit in klinische proeven2. Deel van de reden kan worden toegeschreven aan het gebruik van eenvoudige tweedimensionale (2D) cel cultuur modellen voor samengestelde voorstelling die resultaten voorzien van beperkte voorspellende waarden van samengestelde werkzaamheid en toxiciteit voor de volgende fasen van de drug discovery2 , 3 , 4. onlangs, driedimensionale (3D) tumor sferoïde modellen zijn ontwikkeld voor het klinisch relevante fysiologische en farmacologische gegevens leveren voor anti-kanker drug discovery3,4,5 ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25. Aangezien deze spheroïden weefsel-specifieke eigenschappen van tumoren in vivo nabootsen kunnen, zoals voedingsstoffen en zuurstof kunt kleurovergang, hypoxische kern, alsmede drug weerstand19, het gebruik van deze modellen mogelijk verkorten drug discovery tijdlijnen, verminderen van de kosten van investeringen, en breng nieuwe geneesmiddelen aan patiënten effectiever. Een kritische benadering bij de evaluatie van de werkzaamheid van de samengestelde in 3D tumor sferoïde ontwikkeling is het monitoren van de groei van de sferoïde en herhaling onder behandelingen9,26. Om dit te doen, zijn kwantitatieve karakterisaties van de morfologie van de tumor, waarbij de diameter en het volume met de hoge resolutie beeldvormende modaliteiten, absoluut noodzakelijk.

Conventionele beeldvormende modaliteiten, zoals helder-veld, fase contrast7,9,22,24, en fluorescentie microscopie8,9,16, 18,22 kan zorgen voor een meting van de sferoïde diameter maar niet het oplossen van de algehele structuur van de sferoïde in 3D-ruimte. Vele factoren dragen bij aan deze beperkingen, met inbegrip van de penetratie van het indringende licht in de sferoïde; verspreiding van de fluorescente kleurstoffen in de sferoïde; emitterende fluorescerende signalen van opgewonden fluorescente kleurstoffen binnen of op het tegenovergestelde oppervlak van de sferoïde als gevolg van de sterke absorptie en verstrooiing; en diepte-resolvability van deze beeldvorming modaliteiten. Dit leidt vaak tot een onjuiste volumemeting. Ontwikkeling van de necrotisch kern in spheroïden bootst necrose in in vivo tumoren6,10,15,19,25. Deze pathologische functie is onwaarschijnlijk gereproduceerd in 2D cel culturen19,25,27,28. Met een sferoïde grootte groter dan 500 µm in diameter, een concentrische structuur van drie lagen, kan met inbegrip van een buitenste laag van de delende cellen, een middenlaag van zwakke cellen en een necrotische kern, worden waargenomen in de sferoïde6,10 ,15,19,25, wegens gebrek aan zuurstof en voedingsstoffen. Levende en dode cel fluorescentie beeldvorming is de standaardbenadering op het etiket van de grens van de necrotisch kern. Echter, nogmaals, doorboringen van zowel deze fluorescente kleurstoffen en zichtbaar licht belemmeren het potentieel om de sonde in de necrotische kern zijn ontwikkeling in de werkelijke vorm te volgen.

Een alternatieve 3D imaging modaliteit, is optische coherentie tomografie (OCT) ingevoerd om het karakteriseren van de spheroïden van de tumor. OCT is een biomedische beeldvormende techniek die is in staat tot het verwerven van label-vrije, niet-destructieve 3D-gegevens van 1-2 mm diepte in biologische weefsels29,30,31,32,33 ,34. OCT maakt gebruik van lage-coherence interferometrie te detecteren achterwaarts-verstrooid signalen van verschillende diepten van het monster en biedt gereconstrueerde diepte-resolved beelden met de ruimtelijke resoluties micron-niveau in zowel laterale en verticale richtingen. OCT is algemeen overgenomen in oogheelkunde35,36,,37 en angiografie38,39. Eerdere studies hebben OCT gebruikt te observeren de morfologie van in vitro tumor spheroïden in kelder membraan matrix (bijvoorbeeldMatrigel) en het evalueren van hun reacties op Fotodynamische therapie40,41. Onlangs, onze groep opgericht een high-throughput OCT imaging platform om systematisch controleren en kwantificeren van de groei-kinetiek van 3D tumor spheroïden in multi goed platen42. Precieze volumetrische kwantificering van 3D tumor spheroïden met behulp van een voxel tellen aanpak en detectie van de label-vrije necrotisch weefsel in de spheroïden op basis van intrinsieke optische demping contrast werden gedemonstreerd. Deze paper beschrijft de details van hoe de OCT imaging platform werd gebouwd en ingezet om te verkrijgen met een hoge resolutie 3D beelden van tumor spheroïden. De stapsgewijze kwantitatieve analyses van de kinetiek van de groei van 3D tumor spheroïden, met inbegrip van nauwkeurige metingen van sferoïde diameter en volumes, wordt beschreven. Ook wordt de methode van de niet-destructieve detectie van necrotisch weefsel regio's met behulp van de LGO, gebaseerd op de intrinsieke optische demping contrast gepresenteerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. bereiding van cellen

  1. Cellijnen verkrijgen door een gekwalificeerde leverancier.
    Opmerking: Controleer of cellen uit de cellijnen van belang sferoïde kunnen vormen in de cultuur-media of met de hulp van een substraat (kelder membraan matrix zoals Matrigel). Kijken naar de literatuur9 of een ronde van een pre-experiment voor een controle uitvoeren.
  2. Ontdooi de bevroren cellen na de specifieke procedure door de cellijn leverancier. Een algemene procedure kan worden gevonden elders43.
  3. Cultuur van de cellen voor 1-2 passages in 25 cm2 cultuur kolven. De cellen zijn dan klaar voor gebruik voor 3D-celkweek.
  4. Controleren van de gezondheidstoestand van de cellen dagelijks en onderhouden ze in een incubator onder standaardomstandigheden (5% CO2, 37 ° C, luchtvochtigheid van 95%). De media zo nodig vernieuwen.
    Opmerking: Het kweekmedium bestaat uit DMEM (4.5 g/L glucose), 1% antibioticum-antimycotic, 10% foetale runderserum. De cellen van de subcultuur voordat ze samenvloeiing in de kolf van cultuur bereiken. Volg de cel cultuur richtsnoer dat door de leverancier verstrekt. Een algemene procedure kan worden gevonden elsehwhere44.
  5. 3D-celkweek in multi goed platen op basis van de volgende algemeen protocol9uitvoeren.
    1. Verwijder het medium van de cultuur van de kolf cultuur en wassen met gesteriliseerde fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, verwarmd tot 37 ° C).
    2. Resuspendeer de cellen door toevoeging van 1 mL trypsine ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA, 0,5%) in de kolf gedurende 3 minuten. Dan, voeg voedingsbodems voor het verdunnen van de trypsine.
    3. Breng de celsuspensie in een tube van 15 mL centrifuge en Centrifugeer gedurende 5 min 500 x g en bij kamer temperatuur.
    4. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen met 4 mL voorverwarmde kweekmedium. Pipetteer een druppel van het monster op een hemocytometer voor het tellen van de cel om te bepalen van de concentratie van de cel. Verdun de cellen die moeten geschikte concentratie voor het zaaien (bijvoorbeeld3.000 cellen/mL).
      Opmerking: Optimaliseren van de concentratie van de eerste cel van de sferoïde voor elke cel-lijn en elk type multi goed plaat (96-Wells, 384-well of 1536-well).
    5. Zaad-cellen in een ultra-lage bijlage (ULA) Rondbodemkolf multi goed plaat. Voeg 200 µL van schorsing van de cellen in elk putje met de concentratie van 3.000 cellen/mL zodat elk goed ongeveer 600 cellen heeft.
    6. Centrifugeer bij RT, de gehele plaat met behulp van een adapter voor plafondplaten voor 7 min, direct na het zaaien, bij een snelheid van 350 x g of de laagste snelheid beschikbaar.
      Opmerking: De centrifuge helpt cellen naar het midden van de put om de vorming van een enkele, uniforme sferoïde verzamelen. De stap van de centrifuge is slechts eenmaal uitgevoerd aan het begin te vormen van de spheroïden van de tumor. Het zal niet worden herhaald wanneer de tumor spheroïden gaan groeien.
    7. De multi goed plaat bij 37 ° C en 5% CO2 in een cultuur incubator onderhouden en vernieuwen van de voedingsbodems om de 3 dagen.
      Opmerking: Groei tijd kan variëren voor verschillende 3D cultuuromstandigheden. In onze studie, wordt 3.000 cellen/mL gebruikt voor zowel U-87 MG en HCT 116 cellijnen in 96-wells-platen, zodat de sferoïde tot ~ 500 μm in 4\u20127 dagen voor HCT 116 cellen groeien kan. Overweeg media supplementen en groeifactoren voor verschillende sferoïde modellen, gebaseerd op de algemene 3D-cultuur-protocol.
    8. OCT beeldvorming van tumor spheroïden elk 3\u20124 dagen voor een longitudinale studie van hun groei uitvoeren.
      Opmerking: Aanbevolen tijdstippen voor OCT imaging zou dag 4, dag 7, dag 11, dag 14, 18 dag en dag 21.

2. high-throughput OCT Imaging Platform

Opmerking: Zie verwezen werk29,30,31,32,33,34 voor een grondige herziening van principes en toepassingen van LGO. Zie Figuur 1 en Huang et al. 42 voor details van de aangepaste LGO imaging systeem gebruikt in deze studie.

  1. Kies een geschikte breedband lichtbron voor het systeem van OCT voor tumor sferoïde imaging.
    Opmerking: Hier, een superluminescent diode (SLD, figuur 1A,B) met een centrale golflengte van ~ 1.320 nm en ~ 110 nm bandbreedte werd gebruikt als een breedband lichtbron.
  2. Construeer de verwijzing arm en monster arm van het systeem van de OCT na de schema's (Zie figuur 1A,B voor details). Zie de Tabel van materialen voor een lijst van optische componenten voor de bouw van het systeem van de OCT. Ervoor zorgen dat de optische weglengte van de referentie-arm en monster arm nauw worden afgestemd.
  3. Bouw van de spectrometer, met inbegrip van een collimator, een rooster, een F-thèta-lens en de camera van een lijn-scan (Zie Figuur 1 c voor setup34) voor details van spectrometer ontwerp van oktober of selecteer een commerciële spectrometer die overeenkomt met de de golflengte van het centrum van de lichtbron. Zorg ervoor dat de spectrometer ter dekking van de gehele laser bandbreedte, hoge foton collectie efficiëntie te bereiken en te bieden langzaam wash-out van het interferentiepatroon correct is uitgelijnd.
  4. Kenmerkend zijn de prestaties van de OCT-systeem, met inbegrip van de volgende statistieken zoals monster arm power, total imaging diepte, afhankelijk van de diepte gevoeligheid, axiale resolutie, diepte van de focus en laterale resolutie. Plaats een zwakke reflector (bijvoorbeeld, een spiegel met een filter met neutrale dichtheid) als een voorbeeld voor het meten van de gevoeligheid van de diepte-afhankelijke axiale resolutie en de diepte van de focus. Plaats een USAF resolutie test grafiek doel als het monster te controleren van de laterale resolutie.
    Opmerking: Zie referenties34,,45 voor definities van statistieken van OCT prestaties en protocollen te karakteriseren deze statistieken45. Zie tabel 1 voor een lijst met gemeten parameters voor de aangepaste OCT systeem gebruikt in onze studie.
  5. Selecteer een werkgebied van de gemotoriseerde vertaling te verstrekken van de horizontale beweging van de multi goed plaat aan afbeelding tumor spheroïden in verschillende wells (Zie figuur 1B). Gebruik een podium met een reizen bereik groter dan 108 x 72 mm om een volledige scannen van alle putjes van de plaat multi goed. Gebruik een 2D- of 3D-gemotoriseerde vertaling fase met softwarecontrole om de precieze locatie van elk putje en automatisering van het systeem van OCT voor high-throughput imaging.
  6. Gebruik een adapter voor plafondplaten of ontwerpen van een plaat houder (door 3D printen) te houden van de multi goed plaat in een vaste positie.
  7. Corrigeer de kantelen en rotatie van de multi goed plaat met behulp van een 2D kantelen en een fase van de rotatie gemonteerd het werkgebied translationeel (Zie Figuur 1 D), vóór het uitvoeren van een OCT imaging om te minimaliseren van de variatie van het vlak van de focus uit verschillende putten. Gebruik D2 met D11, B6, D6, G6 als de leidende putten bij het toezicht op hun relatieve positie in de OCT beelden (figuur 1A).
  8. Het aanpassen van de draaihoek van de plaat om ervoor te zorgen dat de randen van de plaat zijn parallel met de richting van de beweging van de fase, zodat de putjes op de dezelfde horizontale posities in de OCT beelden (figuur 1E blijft). Pas de kantelen van de plaat te zijn parallel aan de optische tabel zodat de putjes blijven op de dezelfde verticale locaties voor LGO imaging (figuur 1F).
    Opmerking: Aanpassing van de kantelbare hoek en focus helpen optimaliseren van de beeldkwaliteit van OCT voor alle de putjes. Echter kunnen variaties van de hoogte van voedingsbodems in verschillende putten wijzigingen in optische paden die leiden kunnen tot defocusing van de afbeelding sferoïde veroorzaken. Autofocus kan worden uitgevoerd om te bepalen van het brandvlak van OCT imaging om geoptimaliseerde beeldkwaliteit. De aanpassing niet is opgelost arme OCT beeldkwaliteit van de tumor sferoïde als gevolg van de volgende kwesties: de sferoïde decentreren als gevolg van de initiële seeding locatie; sferoïde hoogte wanneer ingesloten in biofabricated extracellulaire matrices; de kwaliteit van het arme plaat met grote variaties van de hoogte van goed bodems. Extra softwarecontrole met auto-focus of zelf uitlijning functies kan worden geïmplementeerd om de prestaties van de LGO imaging systeem te optimaliseren.
  9. Gebruik een aangepaste computerprogramma waarmee de OCT Beeldacquisitie en het verkeer van de fase om gegevens te verzamelen van elk goed opeenvolgend.

3. OCT scannen en verwerken van Tumor spheroïden

  1. Op de dag van de OCT beeldvorming van tumor spheroïden, neemt u de multi goed plaat uit de incubator. Overdracht van de multi goed plaat onder de LGO imaging systeem. Plaats het op de top van de adapter voor plafondplaten.
    Opmerking: OCT beeldvorming van tumor spheroïden kan worden uitgevoerd met de deksel van polystyreen plaat in- of uitschakelen. Echter kunnen de condensatie van het water op de deksel als gevolg van verdamping uit de putten lichttransmissie beïnvloeden en verstoren het licht weg, minder optimale OCT beelden oplevert van de spheroïden.
  2. Aanpassen van de hoogte van de plaat door bewegen langs de z-richting van de etappe van de vertaling. Handhaven van de positie van het scherptevlak bij ~ 100 – 200 μm onder de bovenkant van elke sferoïde, tot een minimum beperken van het effect van de niet-uniforme depth-wise focal profiel.
  3. Een reeks goede OCT scannen (bijvoorbeeld, 1 x 1 mm) in de aangepaste software ter dekking van de hele tumor sferoïde volgens haar ontwikkelingsstadia. Klik op Opslaan Parameters om het plaatsen te bewaren.
  4. Gebruiken de douanesoftware voor het verkrijgen van 3D-OCT beelden van tumor spheroïden één voor één voor alle putjes van de plaat met spheroïden. Klik op Afdrukvoorbeeld om te bekijken van de voorvertoning en klik op de knop ophaal verwerven de OCT beeld .
    Opmerking: Zorg ervoor dat de OCT sferoïde gegevens worden verzameld wanneer het werkgebied niet in beweging. De sferoïde bevindt zich gewoonlijk in het midden van de U-onderkant goed. Echter kan de sferoïde in de voedingsbodems worden verschoven wanneer het werkgebied wordt versnellen of vertragen als gevolg van de laksheid van de sferoïde in de cultuur-media.
  5. Proces 3D OCT datasets van tumor spheroïden voor het genereren van OCT structurele beelden met een aangepaste verwerking van C++-code. Zie figuur 2A voor een stroomdiagram voor post verwerking van OCT vaststelt.
    Opmerking: Zie figuur 4A voor de gegenereerde 3D-OCT structurele beelden.
    1. Zie hoofdstuk 5 van Drexler en Fujimoto34 en Jian et al. 46 voor detail beschrijvingen van nabewerking stappen van OCT gegevens. Kalibreren van de pixelgrootte in alle drie dimensies. Opnieuw schalen de OCT structurele beelden op gecorrigeerde schalen.
      Opmerking: De afstand in de axiale richting (z-richting) van OCT beelden is een maat voor de optische weglengte van verschil tussen de verwijzing arm en monster arm. Dus, de brekingsindex van de steekproef (n) moet rekening worden gehouden wanneer de pixelgrootte in de axiale richting voor het herschalen kalibreren. In onze studie, gebruiken we n = 1.37 als de brekingsindex van de tumor sferoïde42.
  6. De collage van sferoïde beelden met behulp van 2D OCT beelden in drie transversale XY-, XZ- en YZ vliegtuigen over het zwaartepunt van de sferoïde genereren. Zie Figuur 3 c-E voor de representatieve uitvoer van collages van sferoïde beelden. Beeldregistratie voor alle spheroïden, met behulp van de MATLAB functie dftregistration47, om ervoor te zorgen dat de centroids van alle de sferoïde zich ongeveer op dezelfde locatie bevinden uitvoeren.
  7. 3D rendering van de sferoïde met behulp van een commerciële of aangepaste software te verkrijgen.
    Opmerking: De volgende stappen laten zien hoe de 3D weergave van tumor spheroïden met behulp van een commerciële software verkrijgen.
    1. De 3D-OCT-gegevens laden in de software.
    2. Klik op het deelvenster Surpass . Klik vervolgens op Nieuw Volume toevoegen. Kies de Blend -modus te gebruiken voor 3D rendering.
    3. De kijkhoek aanpassen door de afbeelding met behulp van de muisaanwijzer te slepen.

4. morfologische kwantificering van 3D Tumor spheroïden

Opmerking: Een schriftelijke douanecode in MATLAB verwerkt deze kwantificering. Klik op de knop uitvoeren om het proces te starten. Zie figuur 2B voor het stroomdiagram van de stappen van morfologische kwantificering van spheroïden.

  1. Kwantificeren sferoïde diameter, hoogte en diameter gebaseerde volume.
    1. Selecteer 2D OCT afbeeldingen in drie transversale XY-, XZ- en YZ vliegtuigen die de grenzen van het zwaartepunt van de sferoïde.
    2. Meet de diameter en de hoogte van de sferoïde in XY-diagrammen en XZ vliegtuigen, respectievelijk.
    3. Berekenen diameter gebaseerde sferoïde volume gebruiken: figure-protocol-1 , met een vermoeden van de bolvorm van de tumor.
  2. Voxel gebaseerde sferoïde volume te kwantificeren.
    1. Een 3D gemiddeld filter toepassen op de OCT-Landeninformatie van sferoïde verwijderen van spikkels.
    2. Segment tumor spheroïden met behulp van de Canny rand detectie48 filter frame voor frame, met een goede drempel scheiden van de tumor sferoïde regio van het goed onder.
    3. Groep van bindweefsel voxels voor 3D-gegevens (Zie ingebouwde functie: bwconncomp).
    4. Berekenen van de gemiddelde afstand tussen elke bindweefsel voxel in de groep en het zwaartepunt van de sferoïde (handmatig gekozen), voor elke groep. De sferoïde regio als de groep identificeren met de minimale gemiddelde afstand.
    5. Tellen van het aantal voxels binnen de regio sferoïde en vervolgens vermenigvuldigt met de werkelijke omvang van een individuele voxel (volume/voxel), opbrengst van het totale volume van de sferoïde.

5. dood-cel regio detectie van 3D Tumor spheroïden

Opmerking: In een homogeen medium, OCT achterwaarts-verstrooid intensiteit gedetecteerd als een functie van de diepte (ik(z)) kan worden beschreven door de wet van Lambert-Beer49: figure-protocol-2 , waar z de diepte vertegenwoordigt, μ is de optische demping coëfficiënt, en ik0 is de incident intensiteit aan het monster. Vandaar de coëfficiënt afgeleide optische demping kan worden uitgedrukt als: figure-protocol-3 . Aangezien OCT beelden vaak op een logaritmische schaal uitgezet zijn, kan de helling van de OCT intensiteit profiel worden opgehaald om de optische demping-coëfficiënt afleiden. Zie figuur 2C voor een stroomdiagram van de generatie van de optische demping kaarten.

  1. Segmentatie om te verwijderen van ongewenste gebieden buiten de sferoïde uitvoeren 3D gemiddelde filter om te onderdrukken de spikkel ruis die inherent is aan OCT beelden uit te voeren.
  2. Pixel-wise verkrijgen optische demping coëfficiënten door lineaire montage de logschaal profiel voor de intensiteit van de OCT over een bepaalde Dieptebereik (bewegende venster), uittreksel van de helling, en vermenigvuldigt u de helling met -1/2.
    Opmerking: De coëfficiënt van de demping op elke voxel binnen de regio gesegmenteerde sferoïde is berekend op basis van de helling van OCT intensiteit profiel in een 10-voxel diepte venster (~ 40 μm in diepte), met de voxel gelegen in het midden van het venster.
  3. De methoden hierboven (stap 5.1 en 5.2) toepassen op elke axiale scan in een frame en elk frame in een 3D dataset met de gesegmenteerde sferoïde regio totdat optische demping coëfficiënten voor alle voxels van de gesegmenteerde sferoïde regio worden berekend.
  4. Het uitvoeren van de binaire drempelmethode nadruk wordt gelegd op de regio hoge-demping.
    Opmerking: Zie Huang et al. 42 voor de bepaling van de drempel van de regio van de hoge-demping met behulp van de analyse van het histogram.
  5. Markeer de binarized optische demping kaart op de oorspronkelijke afbeelding op het etiket van de regio van de dode cellen (mengen). Het genereren van de 3D-gerenderde afbeelding van de kaart van blended demping te visualiseren van de 3D-verdeling van de dode cellen-regio.

6. histologie en Immunohistochemistry

Opmerking: Histologie en immunohistochemistry (IHC) gekleurd beelden van tumor spheroïden om te correleren met de bijbehorende OCT-resultaten worden verkregen.

  1. Op geselecteerde tijdstippen, door 1-2 tumor spheroïden te selecteren in de multi goed plaat voor histologie en IHC kleuring. Gebruik een pipet met de 1 mL pipet tips om de sferoïde uit de put overbrengen in een centrifugebuis 1,5 mL.
    Opmerking: Knip het puntje 1 mL pipet voor overdracht om ervoor te zorgen dat de opening van het uiteinde groter dan de grootte van de tumor sferoïde is om te voorkomen beschadiging van de structuur van de sferoïde.
  2. Elke tumor sferoïde in een enkele 1,5 mL microcentrifuge buis gevuld met 10% formaldehyde en correctie voor 48 uur verzamelen.
  3. De histologie en IHC processen uitvoeren voor elke sferoïde, met behulp van standaard paraffine technieken te embedding.
    Opmerking: Vlek 5 μm dik secties van tumor spheroïden voor haematoxyline en eosine (H & E) en terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick einde labeling (TUNEL) apoptosis detectie. Een counterstaining van Haematoxyline wordt toegepast op TUNEL. Een digitale dia scanner werd gebruikt om te scannen het gebeitst monster en het verkrijgen van hoge resolutie histologische en IHC beelden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

High Throughput optische coherentie tomografie beeldvorming van spheroïden in een 96-wells-plaat

Figuur 3 toont het resultaat van de HT-OCT scan van een 96-wells-plaat met HCT 116 tumor spheroïden op dag 3. De sequentiële scan van de gehele plaat wordt gestart uit de onderst-juiste put (H12). Figuur 3B toont het stroomschema van de implementatie van de software van de HT-O...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Tumor activiteit is zeer relevant voor de morfologische structuur. Gelijkaardig aan het toezicht van karakteristieke groeikromme voor 2D celculturen, bijhouden van de groeikromme voor 3D tumor spheroïden is ook een conventionele benadering van karakteriseren van het lange termijn sferoïde groei gedrag voor verschillende cellijnen. Wij kunnen met name de reactie van de drug karakteriseren door het analyseren van de aantasting van de tumor of tumor hergroei direct tot uiting in de groeikromme. Kwantitatieve beoordeling van...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs vermelden geen concurrerende rente.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door de NSF verleent IDBR (DBI-1455613), PFI:AIR-TT (IIP-1640707), NIH grants R21EY026380, R15EB019704 en R01EB025209 en Lehigh University opstarten Fonds.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Custom Spectral Domain OCT imaging systemOntwikkeld in ons lab
Superluminescent Diode (SLD)ThorlabsSLD1325lichtbron
2×2 single mode fused fiber coupler, 50:50 splitting ratioAC PhotonicsWP13500202B201
Referentiearm
Lens TubeThorlabs
AdapterThorlabs
Collimerende lensThorlabsAC080-020-C
FocuslensThorlabs
Kinematische spiegelbeugelThorlabs
SpiegelThorlabs
1D translationele stageThorlabs
Continue neutrale dichtheidsfilterThorlabs
PedestaalThorlabs
KlemvorkThorlabs
Sample Arm
Lens TubeThorlabs
AdapterThorlabs
Collimerende lensThorlabsAC080-020-C
GalvanometerThorlabs
RelaislensThorlabsAC254-100-Ctwee relaislens om een telescoopopstelling te maken
Driehoekige spiegelbeugelThorlabs
SpiegelThorlabs
ObjectiefMitutoyo
PedestaalThorlabs
KlemvorkThorlabs
PolarisatiecontrollerThorlabs
30mm kooimontageThorlabs
Kooi staafThorlabs
Stage
3D gemotoriseerde translatiestageBeijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd.JTH360XY
2D kantelse stage
Rotatiestage
Platenhouder3D gedrukt
Spectrometer
Lens TubeThorlabs
AdapterThorlabs
Collimerende lensThorlabsAC080-020-C
GratingWasatchG = 1145 lpmm
F-theta lensThorlabsFTH-1064-100
InGaAs Line-scan CameraSensor UnlimitedSU1024-LDH2
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Celkweekcomponent
HCT 116 Cell lineATCCCCL-247
CelkweekkolfSPL Life Sciences70025
PipetFisherbrand14388100
PipettipsSorenson Bioscience10340
Gibco GlutaMax DMEMThermo Fisher Scientific10569044
Fetaal bovien serum, gecertificeerd, VS-origineelThermo Fisher Scientific16000044
Antibioticum-antimycoticum (100X)Thermo Fisher Scientific15240062
Corning 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment MicroplateCorning7007
Gibco PBS, pH 7.4Thermo Fisher Scientific10010023
Gibco Trypsin-EDTA (0.5%)Thermo Fisher Scientific15400054
Forma Series II 3110 Water-Jacketed CO2 IncubatorsThermo Fisher Scientific3120
HandschoenenVWR89428-750
ParafilmSigma-AldrichP7793
TransferpipettenGlobe Scientific138080
CentrifugeEppendorf5702 ROm de 15 mL buis te centrifugeren
CentrifugeNUAIREAWEL CF 48-ROm de 96-well plate te centrifugeren
MicroscoopOlympus
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Histologie & IHC
Digitale diascannerLeicaAperio AT2Verkrijg hoogwaardige histologische beelden
HistologieserviceHistowizVraag service aan voor histologische en immunohistologische kleuring van tumor sferoïd
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Lijst van commerciële OCT's
SD-OCT systeemThorlabsTelesto Series
SD-OCT systeemWasatch PhotonicsWP OCT 1300 nm
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Software voor gegevensanalyse
BasisbeeldanalyseNIHImageJFiji werkt ook.
3D-renderingThermo Fisher ScientificAmiraCommerciële software. Optie 1
3D-renderingBitplaneImarisCommerciële software. Optie 2. Gebruikt in het protocol
OCT-acquisitiesoftwareAangepast ontwikkeld in C++.
StagebesturingBeijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd.MRC_3Geïntegreerd in de aangepaste OCT-acquisitiecode
OCT-verwerkingssoftwareAangepast ontwikkeld in C++. Gebruik GPU. Geïntegreerd in de aangepaste OCT-acquisitiecode.
Morfologische en fysiologische analyseAangepast ontwikkeld in MATLAB

Referenties

  1. WHO. Cancer. , Available from: http://www.who.int/cancer/en/ (2018).
  2. Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates? Nature Reviews Drug Discovery. 3 (8), 711-716 (2004).
  3. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18, 240-249 (2013).
  4. Hickman, J. A., et al. Three-dimensional models of cancer for pharmacology and cancer cell biology: Capturing tumor complexity in vitro/ex vivo. Biotechnology Journal. 9 (9), 1115-1128 (2014).
  5. Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
  6. Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell cultures: from molecular mechanisms to clinical applications. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 273, C1109-C1123 (1997).
  7. Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nature Protocols. 4 (3), 309-324 (2009).
  8. Tung, Y. -C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. The Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
  9. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC biology. 10, 29(2012).
  10. LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 7, 819-830 (2012).
  11. Pampaloni, F., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. High-resolution deep imaging of live cellular spheroids with light-sheet-based fluorescence microscopy. Cell and Tissue Research. 352, 161-177 (2013).
  12. Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Miniaturized three-dimensional cancer model for drug evaluation. Assay and Drug Development Technologies. 11 (7), 435-448 (2013).
  13. Wenzel, C., et al. 3D high-content screening for the identification of compounds that target cells in dormant tumor spheroid regions. Experimental Cell Research. 323 (1), 131-143 (2014).
  14. Astashkina, A., Grainger, D. W. Critical analysis of 3-D organoid in vitro cell culture models for high-throughput drug candidate toxicity assessments. Innovative tissue models for drug discovery and development. 69, 1-18 (2014).
  15. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
  16. Gong, X., et al. Generation of multicellular tumor spheroids with microwell-based agarose scaffolds for drug testing. PLoS ONE. 10 (6), e0130348(2015).
  17. Hoffmann, O. I., et al. Impact of the spheroid model complexity on drug response. Journal of biotechnology. 205, 14-23 (2015).
  18. Martinez, N. J., Titus, S. A., Wagner, A. K., Simeonov, A. High-throughput fluorescence imaging approaches for drug discovery using in vitroand in vivothree-dimensional models. Expert Opinion on Drug Discovery. 10, 1347-1361 (2015).
  19. Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology, Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
  20. Li, L., Zhou, Q., Voss, T. C., Quick, K. L., LaBarbera, D. V. High-throughput imaging: Focusing in on drug discovery in 3D. Methods. 96, 97-102 (2016).
  21. Ham, S. L., Joshi, R., Thakuri, P. S., Tavana, H. Liquid-based three-dimensional tumor models for cancer research and drug discovery. Experimental Biology and Medicine. 241 (9), 939-954 (2016).
  22. Kessel, S., et al. High-Throughput 3D Tumor Spheroid Screening Method for Cancer Drug Discovery Using Celigo Image Cytometry. Journal of Laboratory Automation. , 2211068216652846(2016).
  23. Stock, K., et al. Capturing tumor complexity in vitro: Comparative analysis of 2D and 3D tumor models for drug discovery. Scientific Reports. 6, 28951(2016).
  24. Thakuri, P. S., Ham, S. L., Luker, G. D., Tavana, H. Multiparametric analysis of oncology drug screening with aqueous two-phase tumor spheroids. Molecular Pharmaceutics. 13 (11), 3724-3735 (2016).
  25. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
  26. Piccinini, F., Tesei, A., Arienti, C., Bevilacqua, A. Cancer multicellular spheroids: Volume assessment from a single 2D projection. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 118 (2), 95-106 (2015).
  27. Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103(2016).
  28. Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nature Reviews Cancer. 5 (9), 675-688 (2005).
  29. Huang, D., et al. Optical coherence tomography. Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).
  30. Drexler, W., et al. Optical coherence tomography today: speed, contrast, and multimodality. Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071412(2014).
  31. Fujimoto, J., Swanson, E. The development, commercialization, and impact of optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (9), OCT1-OCT13 (2016).
  32. Vakoc, B. J., Fukumura, D., Jain, R. K., Bouma, B. E. Cancer imaging by optical coherence tomography: preclinical progress and clinical potential. Nature Reviews Cancer. 12 (5), 363-368 (2012).
  33. Wojtkowski, M. High-speed optical coherence tomography: basics and applications. Applied optics. 49 (16), D30-D61 (2010).
  34. Drexler, W., Fujimoto, J. G. Optical coherence tomography: technology and applications. , Springer Science, Business Media. (2008).
  35. Geitzenauer, W., Hitzenberger, C. K., Schmidt-Erfurth, U. M. Retinal optical coherence tomography: past, present and future perspectives. British Journal of Ophthalmology. 95 (2), 171(2011).
  36. Sakata, L. M., DeLeon-Ortega, J., Sakata, V., Girkin, C. A. Optical coherence tomography of the retina and optic nerve - a review. Clinical, Experimental Ophthalmology. 37 (1), 90-99 (2009).
  37. van Velthoven, M. E. J., Faber, D. J., Verbraak, F. D., van Leeuwen, T. G., de Smet, M. D. Recent developments in optical coherence tomography for imaging the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 26 (1), 57-77 (2007).
  38. Kashani, A. H., et al. Optical coherence tomography angiography: A comprehensive review of current methods and clinical applications. Progress in Retinal and Eye Research. 60, 66-100 (2017).
  39. de Carlo, T. E., Romano, A., Waheed, N. K., Duker, J. S. A review of optical coherence tomography angiography (OCTA). International Journal of Retina and Vitreous. 1 (1), 5(2015).
  40. Sharma, M., Verma, Y., Rao, K. D., Nair, R., Gupta, P. K. Imaging growth dynamics of tumour spheroids using optical coherence tomography. Biotechnology Letters. 29 (2), 273-278 (2006).
  41. Jung, Y., Nichols, A. J., Klein, O. J., Roussakis, E., Evans, C. L. Label-Free, Longitudinal Visualization of PDT Response In Vitro with Optical Coherence Tomography. Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 728-744 (2012).
  42. Huang, Y., et al. Optical coherence tomography detects necrotic regions and volumetrically quantifies multicellular tumor spheroids. Cancer Research. 77 (21), 6011-6020 (2017).
  43. Spalteholz, W. Über das Durchsightigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten: nebst Anhang, Über Knochenfärbung. , Verlag von S. Hirzel. (1911).
  44. Dodt, H. -U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331(2007).
  45. Leitgeb, R., Hitzenberger, C., Fercher, A. F. Performance of fourier domain vs. time domain optical coherence tomography. Optics express. 11 (8), 889-894 (2003).
  46. Jian, Y., Wong, K., Sarunic, M. V. Optical Coherence Tomography and Coherence Domain Optical Methods in Biomedicine XVII. , International Society for Optics and Photonics. 85710Z(2013).
  47. Guizar-Sicairos, M., Thurman, S. T., Fienup, J. R. Efficient subpixel image registration algorithms. Optics Letters. 33 (2), 156-158 (2008).
  48. Canny, J. A computational approach to edge detection. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence. (6), 679-698 (1986).
  49. Vermeer, K. A., Mo, J., Weda, J. J. A., Lemij, H. G., de Boer, J. F. Depth-resolved model-based reconstruction of attenuation coefficients in optical coherence tomography. Biomedical Optics Express. 5 (1), 322-337 (2014).
  50. Klein, T., et al. Multi-MHz retinal OCT. Biomedical Optics Express. 4, 1890-1908 (2013).
  51. Klein, T., Huber, R. High-speed OCT light sources and systems [Invited]. Biomedical Optics Express. 8 (2), 828-859 (2017).
  52. Zhou, C., Alex, A., Rasakanthan, J., Ma, Y. Space-division multiplexing optical coherence tomography. Optics Express. 21, 19219-19227 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

3D beeldvorminghigh throughput OCTlongitudinale monitoringtumorgroeiregio s met dode cellen3D renderingorthogonale coupesdrugscreening
Longitudinale morfologische en fysiologische Monitoring van driedimensionale Tumor spheroïden met behulp van optische coherentie tomografie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.