Methodenartikel

Met behulp van In Vitro en In cel vorm te onderzoeken klein molecuul veroorzaakte structurele veranderingen van de Pre-mRNA

DOI:

10.3791/59021

⸱

30 januari 2019

 ,  , 
1Calibr, The Scripps Research Institute, 2Department of Integrative Structural and Computational Biology, The Scripps Research Institute

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er zijn gedetailleerde protocollen voor beide in vitro en in cel selectieve 2'-hydroxyl acylering geanalyseerd door primer extensie (SHAPE) experimenten om de secundaire structuur van pre-mRNA opeenvolgingen van belang in de aanwezigheid van een kleine molecule van RNA-targeting in dit artikel wordt gepresenteerd.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In het proces van de ontwikkeling van de drug van kleine moleculen RNA-targeting, is ophelderen van de structurele veranderingen op hun interacties met doel RNA-sequenties gewenst. Wij leveren hierin een gedetailleerde in vitro en in cel selectieve 2'-hydroxyl acylering geanalyseerd door primer extensie (SHAPE) protocol om te bestuderen van de structurele veranderingen van RNA in het bijzijn van een experimentele drug voor spinale musculaire atrofie (SMA), voortbestaan van motor neuron (SMN)-C2, inzonderheid exon 7 van de pre-mRNA van het gen SMN2. In in vitro vorm, is een RNA-volgorde van 140 nucleotiden met SMN2 exon 7 getranscribeerd door T7 RNA polymerase, gevouwen in aanwezigheid van SMN-C2 en vervolgens bewerkt door een milde 2'-OH acylering reagens, 2-methylnicotinic acid imidazolide (NAI). Deze 2'-OH-INR adduct is verder peilden door een 32P-geëtiketteerden primer extensie en opgelost door polyacrylamide gelelektroforese (pagina). Omgekeerd, 2'-OH acylering in in cel vorm plaatsvindt in situ met SMN-C2 gebonden cellulaire RNA in levende cellen. De volgorde van de pre-mRNA van exon 7 in het SMN2-gen, samen met SHAPE-geïnduceerde mutaties in de primer-extensie, werd vervolgens versterkt door PCR en onder voorbehoud van de volgende generatie sequencing. Vergelijken van de twee methoden, in vitro vorm is van een meer voordelige methode en vereist geen rekenkracht te visualiseren van de resultaten. De in vitro model van de SHAPE afkomstige RNA wijkt echter soms af van de secundaire structuur in een cellulaire context, waarschijnlijk als gevolg van het verlies van alle interacties met RNA-bindende proteïnen. In cel vorm hoeft niet een radioactief materiaal werkplek en levert een nauwkeuriger RNA secundaire structuur in de cellulaire context. Bovendien, in cel vorm meestal geldt voor een groter bereik van RNA-sequenties (~ 1000 nucleotiden) door gebruik te maken van volgende-generatie sequencing, in vergelijking met in vitro vorm (~ 200 nucleotiden) die gewoonlijk is gebaseerd op pagina-analyse. In het geval van exon 7 in SMN2 pre-mRNA, de vorm van in vitro en in cel afgeleid zijn RNA modellen op elkaar lijken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Selectieve 2'-hydroxyl acylering geanalyseerd door primer extensie (SHAPE) is een methode voor het meten van de kinetiek van elk nucleotide in een opeenvolging van RNA van belang en het ophelderen van de secundaire structuur op single-nucleotide oplossing1. SHAPE methodologieën, zowel in in vitro voorwaarden2,3,4 (gezuiverde RNA in een gedefinieerde buffersysteem) en in levende cellen van zoogdieren5,6, hebben ontwikkeld om te onderzoeken van de secundaire structuur van halflang RNA-sequenties (meestal < 1000 nucleotiden in cel vorm en < 200 nucleotiden voor in vitro vorm). Het is met name handig om structurele veranderingen in de receptor RNA bij binding met RNA-interactie klein molecuul metabolieten2,4,7,8 en te bestuderen of mechanistische acties van RNA-targeting moleculen tijdens9,10van de ontwikkeling van de drug.

RNA-targeting drugontdekking heeft onlangs aandacht in academische laboratoria en de farmaceutische industrie11,12 getrokken via verschillende benaderingen en strategieën13,14,15 ,16. Recente voorbeelden van kleine moleculen RNA-targeting voor klinisch gebruik twee structureel verschillende experimentele drugs, LMI-07017 en RG-791618,19, voor spinale musculaire atrofie (SMA), waaruit veelbelovend blijkt resultaten in fase II klinische proeven20. Beide moleculen werden aangetoond voor doel voortbestaan van motor neuron (SMN) 2 pre-mRNA en reguleren de splicing proces van de SMN2 gen6,17,21. Wij eerder blijk gegeven van de toepassing van in vitro en in cel vorm in een onderzoek naar de structurele veranderingen van de target RNA in het bijzijn van een analoge van RG-7916 SMN-C26genoemd.

In principe meet vorm de 2'-OH acylering snelheid van elk nucleotide van een opeenvolging van RNA in aanwezigheid van overtollige hoeveelheden een zelf blussen acylering reagens op onpartijdige wijze. Het reagens acylering is niet stabiel in water, met een korte halfwaardetijd van (bv T1/2 = 17 s voor 1-methyl-7-nitroisatoic zwavelzuuranhydride; of 1 M 7, ~ 20 min. voor het 2-methylnicotinic zuur imidazolide, of INR)22 en ongevoeligheid voor de identiteit van de honken kwamen23. Dit resulteert in een gunstiger acylering van de 2'-OH-groepen van flexibele grondslagen, die kunnen worden omgezet in een nauwkeurige beoordeling van de dynamiek van elk nucleotide. Specifiek, is een nucleotide in een base-paar meestal minder reactief dan een ongepaard die een 2'-OH wijzigen reagens, zoals NAI en 1 M 7.

Als we kijken naar de bron van de RNA-sjabloon en waar 2'-OH acylering plaatsvindt, kan vorm over het algemeen worden onderverdeeld in in vitro en in cel vorm. In vitro vorm gebruik gezuiverde T7 Getranscribeerd RNA en mist een cellulaire context in experimentele designs. In cel vorm plaatsvinden zowel het RNA sjabloon transcriptie en 2'-OH acylering in levende cellen; de resultaten kunnen daarom het structurele model van RNA in een cellulaire context recapituleren. In cel vorm heeft voorgelegd aan zoals in vivo vorm voor de vorm in levende cellen in de literatuur24vervoerd. Aangezien dit experiment wordt niet uitgevoerd in een dier, wij dit experiment genoemd als in cel vorm voor nauwkeurigheid.

De strategieën voor de fase van de uitbreiding primer van in vitro en in cel vorm zijn ook verschillend. In de vorm van het in vitro stopt omgekeerde transcriptie op de 2'-OH acylering positie in aanwezigheid van Mg2 +. Extensie primer 32P-labelled daarom verschijnt als een band in polyacrylamide gelelektroforese (pagina), en de intensiteit van de band is evenredig aan de acylering tarief1. In cel vorm, omgekeerde transcriptie genereert willekeurige mutaties op de 2'-OH adduct positie in aanwezigheid van Mn2 +. Het vogelgriepvirus tarief van elk nucleotide kan worden onderschept door in het rangschikken van de volgende generatie van diepte en de reactiviteit van de SHAPE op single-nucleotide resolutie kan vervolgens worden berekend.

Een potentieel probleem voor in cel vorm is de lage signal-to-noise verhouding (dat wil zeggen, een meerderheid van de fracties 2'-OH is ongewijzigd, terwijl de ongewijzigde sequenties allermeest naar de lezen in de volgende-generatie sequencing bezetten). Onlangs, een methode om te verrijken de 2'-OH gemodificeerde RNA, bedoelde zoals in vivo klikt u op SHAPE (icSHAPE), werd ontwikkeld door de Chang laboratorium25. Deze verrijking methode kan nuttig zijn bij het bestuderen van zwakke kleine molecules zoals RNA interacties, vooral in een transcriptome bestrijkende ondervraging.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. in Vitro vorm

Opmerking: Het protocol is uit de gepubliceerde protocol1gewijzigd.

  1. Voorbereiding van de RNA-sjabloon
    Opmerking: De sjabloon voor de Transcriptie T7 verstaat als een synthetische double-stranded DNA (dsDNA) en versterkt door beide opneming in een vector van E. coli die een uniek paar EcoRI/BamHI beperking endonuclease sites, zoals pET28a, of door PCR draagt. Het protocol voor PCR versterking is hieronder geïllustreerd.
    1. Meng het volgende materiaal: 50 μl van PCR meester mix (Zie Tabel van materialen), 2 μL voor elke primer in 10 μM (Zie tabel 1 voor sequenties), 200 ng voor dsDNA template in 2 μL en 3 μL van dimethylsulfoxide (DMSO) en 41 μL van H2O. Aliquot in twee PCR buizen (elke buis bevat 50 μl van reactiemengsel).
    2. De thermische cycler als volgt instellen: etappe 1) 95 ° C gedurende 30 s; fase 2) 95 ° C gedurende 20 s; etappe 3) 56 ° C gedurende 20 s; 4e etappe) 72 ° C gedurende 20 s; fase 5) lus terug naar fase 2 voor 30 cycli; fase 6) 72 ° C gedurende 3 minuten; en 7e etappe) oneindige houden bij 4 ° C tot en met de volgende stap.
    3. De PCR-amplicon zuiveren door extractie van de segmenten van de gel (Zie Tabel van materialen en gebruik van de fabrikant-protocol). Elueer het product DNA met 35 μL van Tris-EDTA (TE) buffer, met 10 mM Tris (pH 8.0) en 1 mM EDTA, aan opbrengst een 0,1-0,5 μg/μL sjabloon. Normaliseren de gezuiverde DNA-sjabloon in 0.10 μg/μL.
      Opmerking: De kwaliteit van de sjabloon kan eventueel worden geanalyseerd op een 1,8% agarose gelelektroforese met 0,10 μg van DNA. Een enkele band van gewenste sjabloon DNA wordt verwacht op de gel.
    4. De reactie Transcriptie T7 (totale volume 40 μL) instellen door de volgende materialen toe te voegen in een PCR-buis: 4 μL van 10 x reactie buffer, 4 μL van ATP, 4 μL van CTP, 4 μL van GTP, 4 μL van UTP, 4 μL van T7 enzym (Zie Tabel van materialen) , 4 μL van gezuiverde PCR amplicon uit stap 1.1.3 (0,4 μg) en 12 μL van diethyl-pyrocarbonate (DEPC)-behandeld water. Meng door pipetteren op en neer 4 x. Incubeer bij 37 ° C gedurende 4 – 16 h in een thermische cycler of in een 37 ° C incubator.
      Opmerking: Start stap 1.1.6 instellen, terwijl de reactie in stap 1.1.4 gewerkt wordt.
    5. Voeg 2 l DNase, Meng door pipetteren op en neer 4 x en Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 min. Mix met gelijke volume van 2 x Tris-boraat-EDTA (FSME)-ureum monster buffer (Zie Tabel van materialen). Bij 70 ° C gedurende 3 minuten naar de inactivering van warmte.
    6. Meng in een RNase-vrije fles, 75 mL van 40% acrylamide/bisacrylamide-oplossing (29:1, Zie Tabel of Materials), 180.2 g ureum, en 50 mL 10 x TBE buffer (RNase-vrij, Zie Tabel van materialen). Zet de fles op een roteerschudapparaat (250 rpm) totdat alle kristallen van ureum worden opgelost (maximaal 2 uur kan duren). Regel het volume met DEPC behandelde water tot 500 mL. Filtreer de oplossing met een membraan van 0,2 micrometer (Zie Tabel van materialen).
      Opmerking: In dit proces te voorkomen met behulp van spiegelende en roer-bar RNase verontreiniging te voorkomen. De oplossing kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor maximaal 1 jaar.
    7. Twee glasplaten van de Elektroforese van een juiste grootte (16,5 x 24 cm) met gedeïoniseerd water en 70% reinigen EtOH met behulp van een stukje papier afvegen. Uitlijnen van de platen met een paar 2.0 mm afstandhouders (de plaat met een gesiliconiseerd oppervlak kampt naar binnen) en verzegel de rand van de platen met tape. De hoek van de plaat om te voorkomen dat lekkende dubbel-band.
    8. In een bekerglas, meng 200 mL van acrylamide oplossing uit stap 1.1.6, 2,0 mL 10% ammoniumnitraat persulfate oplossing en 100 μl van tetramethylethylenediamine (TEMED) met een pipet RNase-vrije uiteinde door roeren snel 30 s. Tilt de platen op een stuk van benchtop dekking en giet de oplossing van de kloof van de platen. Tik op de plaat om te heffen bubbels en leg de plaat plat op de benchtop-cover. Onmiddellijk plaats van de kam en laat de gel gedurende ten minste 1 uur te polymeriseren.
      Opmerking: Als de gel is binnen de volgende dag moet worden gebruikt, bedekken de bovenkant van de gel met een stuk van natte papieren handdoek en wrap met een groter stuk plasticfolie. Plaats deze liggen vlak bij 4 ° C.
    9. Verwijder de tape en de Klemplaat in een stand van elektroforese. Verwijder de kam en voldoende 1 x TBE buffer toevoegen aan de boven- en onderin het reservoir. Stel vooraf de gel gedurende 30 minuten op 20 W.
      Opmerking: Optioneel, als de inhoud van de gewenste RNA ~ 90% of meer is, een mini gel kan gebruikt worden ter vervanging van een voorbereidende gel.
    10. Was de putjes laden door op en neer pipetteren tweemaal met de vloeistof in het reservoir. Voeg ruwe RNA van stap 1.1.5 in de putjes. De gel op 20 W uitvoeren tot de kleurstof cyanol FF xyleen (lichtblauw) ongeveer tweederde van de lengte van de gel (~ 60 min gaat).
      Opmerking: Zorgen voor het laden van niet meer dan eenderde van de hoogte van de put (gebruik meerdere wells indien nodig).
    11. Dompel de gel in 1 x TBE buffer met 1:10,000 verdunning van de kluis kleurstof (Zie Tabel van materialen) in een container groot genoeg voor de gel. Zet de container op een roteerschudapparaat gedurende 5 minuten bij 80 omwentelingen per minuut.
    12. Onder UV-licht, de gewenste RNA band identificeren en snel een dunne band van de gel met behulp van een schone scheermesje te snijden. 1 – 2 gel segmenten in een 1,7 mL-buis te plaatsen.
    13. Herstelt de RNA van het gel-segment door passieve elutie. Voldoende elutie/neerslag mix (~0.3 mL per segment) toevoegen aan elke buis: 0.3 M NaOAc (pH 5.2), 2,5 M LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% natrium dodecyl sulfaat (SDS) in DEPC-behandeld water. Draai de buis van Eustachius de gel splice(s) bij 4 ° C voor 16 h bevat.
      Opmerking: ~ 75% in deze stap werd een typische terugbezorgd. Het vergroten van de opbrengst, verwijderen en het eluent verzamelen en toevoegen van dezelfde hoeveelheid elutie buffer, dan Herhaal deze stap.
    14. Combineer het eluent in een nieuwe 1,7 mL-buis. 2.5 x ijskoude EtOH toevoegen, omkeren van de buizen zesmaal te mengen van de vloeistof en de buizen te plaatsen bij-80 ° C gedurende ten minste 1 uur.
    15. Centrifugeer gedurende 10 min op 10.000 x g - en 4 ° C. Verwijder voorzichtig het supernatant door pipetteren. Wassen van de RNA-pellet door toevoeging van 80% EtOH (1 mL per buis), vortex voor 15 s, en Centrifugeer gedurende 10 min op 10.000 x g - en 4 ° C.
    16. Verwijder het supernatant en drogen van de RNA-pellet voor 5 min. Voeg 50 μL van RNase-gratis water en meng door pipetteren op en neer 10 keer. Normaliseren van de RNA-concentratie tot 0,10 μg/μL. Winkel de gezuiverde RNA bij-80 ° C.
      Opmerking: Niet overdreven drogen de RNA-pellet.
    17. Optioneel, voor het analyseren van de kwaliteit van het RNA, verdund 1 μL (100 ng) van RNA van stap 1.1.16 in 5 μL van water toe en meng met 5 μL van 2 x TBE-ureum monster buffer. Vervolgens warmte bij 70 ° C gedurende 3 min en belasting op een 6% TBE-ureum mini gel.
      1. Stel de gel bij 180 V voor 1 h. uitvoeren de kleuring zoals gedaan in stap 1.1.11. Visualiseer de gel met UV in een imaging systeem. Een enkele band wordt verwacht op de gewenste lengte.
  2. Voorbereiding van de 32P-geëtiketteerden primer
    1. De reactie instellen door het mengen van de volgende materialen: 10 μL van de γ -32P-ATP (~1.5 mCi, ~ 25 μM, Zie Tabel van materialen), 2 μL van omgekeerde transcriptie (RT) primer (100 μm, bestemd voor volgorde Zie tabel 1), 2 μL van 10 x T4 polynucleotide kinase (PNK) reactie buffer, 1 μL van T4 PNK (Zie Tabel of Materials), en 5 μL van RNase-gratis water. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur.
      Let op: Goede bescherming is stappen 1,2-1,5 in een erkende werkplaats voor radioactieve materialen nodig.
    2. Warmte-inactivering gedurende 20 minuten bij 65 ° C. De monsters op een demineralisatie kolom en centrifuge op 1.000 x g toevoegen voor 1 min. Mix de elutievloeistof met 25 μL van 2 x TBE-ureum monster buffer. .
      Opmerking: De gelabelde ruwe product bij-20 ° C worden opgeslagen als het niet onmiddellijk worden gezuiverd.
    3. Een 10% acrylamide gel op 20 W voor 1 h uitvoeren.
      Let op: De 32P-geëtiketteerden primer uit stap 1.2.1 op het gel laadt en voorkomen bloeden van de radioactiviteit in het bovenste reservoir. Laad niet meer dan eenderde van de hoogte van de put om een dunne band op de gel (gebruik meerdere wells indien nodig). De vloeistof in het reservoir onder kunnen hoogradioactief.
    4. Verwijder de glasplaten van de gel cassette en leg de gel op een stuk plasticfolie. Vouw het plastic wrap ter dekking van de bovenkant van de gel Maak een luchtdichte sandwich. Plaats de gel sandwich op een calcium-wolframaat fosfor-scherm en bloot met een imaging instrument. Het imago van de gel weer met regelmatige licht om te weten waar de randen van de gel.
    5. Gebruik een beeld processing software om overlay de twee afbeeldingen. Hiermee lijnt u de gel op de afgedrukte afbeelding. Gebruik een verse scheermesje te snijden van de gewenste bands uit de gel. Plaats 1 tot 2 gel segmenten in een tube van 1,7 mL.
      Opmerking: Zorg ervoor dat de afgedrukte afbeelding hetzelfde formaat als de werkelijke gel. Controleer de uitlijning door de overgebleven gel imaging weer na uitsnijden van het gel-segment.
    6. De 32P-geëtiketteerden primer herstellen door stap 1.1.13 te 1.1.16. 1.0 μL van oplossing rekening een tube 0.4 mL en Verdun de primer met 1 x TE buffer te verkrijgen van de radioactiviteit van 1,0 μl op ~ 100.000 cpm. Bewaar de gezuiverde 32P-geëtiketteerden primer op-80 ° C tot RNA 2'-OH wijziging reactie, maar niet langer dan 4 weken.
  3. Klein molecuul bindende en RNA 2'-OH wijziging
    1. Toevoegen om te bereiden vier monsters, 8 pmol RNA in 32 μL van 0,5 x TE buffer tot een 1,7 mL koker, warmte bij 80 ° C gedurende 2 min en module-cool in de ijskast voor minstens 1 min.
      Opmerking: De volgende vergelijking gebruiken voor het berekenen van de geschatte molecuulgewicht van RNA: MW = (# van bases) x 340 Da.
    2. Voeg 8 l 5 x vouwen mix met 500 mM HEPES (pH 8,0), 20 mM MgCl2en 500 mM NaCl. Aliquot 9 μl van het mengsel van RNA in elk van de vier PCR buizen en label ze #1-#4. Voeg 1 μl van 10% DMSO in de #1 buis, 1 μL van geconcentreerde klein molecuul oplossing (10% DMSO) in #2, 1 μL van verdunde klein molecuul oplossing (10% DMSO) in #3, en 1 μL van water in #4.
    3. Incubeer de PCR-buizen bij 37 ° C in een thermische cycler gedurende 30 minuten.
    4. Vlak voor de 2'-OH wijziging reactie, verdund 1 μL van NAI stockoplossing (2 M) met 3 μL van DEPC-behandeld water een 0.5 M werkende oplossing opleveren. Onverwijld, 1 μL van NAI werkoplossing in buizen #3, #1 en #2 en 1 μL van 25% DMSO in #4 toevoegen. Incubeer bij 37 ° C in een thermische cycler gedurende 15 minuten.
    5. Voeg 100 μl van elutie/neerslag mix (zie stap 1.1.13 voor recept), 2 μL van glycogeen (15 mg/mL) en Pipetteer al vloeistof in elke PCR buis in een tube van 1,7 mL. Voeg 0,34 mL ijskoud 200-proof EtOH (3 x volume) in elke buis. Meng door de vortexing voor 5 s en plaats de buizen in een vriezer-80 ° C gedurende ten minste 1 uur.
      Opmerking: Tijdens deze periode, start instellen de sequencing-gel te gebruiken in stap 1.5.1.
    6. Centrifugeer gedurende 15 min op 14.000 x g - en 4 ° C. Verwijder de bovendrijvende vloeistof zonder verstoring van de RNA-pellet. Wassen van de RNA-pellet door toevoeging van 80% EtOH (0,5 mL per buis), vortex voor 15 s, en Centrifugeer gedurende 15 min op 20.000 x g - en 4 ° C. Verwijder het supernatant opnieuw.
      Opmerking: Gebruik eventueel een geigerteller om ervoor te zorgen de radioactieve pellet behoud in de buis.
    7. Drogen van de RNA-pellet voor 5 min. Voeg 9 μL van RNase-gratis water en meng door pipetteren op en neer 10 keer.
      Opmerking: Niet overdreven drogen de RNA-pellet. Alle neerslag wordt verwacht aan het eind van deze stap worden ontbonden.
  4. Marker voorbereiding en primer extensie
    1. Breng de gemodificeerde RNA in 4 nieuwe PCR-buizen en label ze #1-#4 zoals voorheen. 2 pmol besturingselement RNA in 7 μL van DEPC-behandeld water toevoegen 4 extra PCR buizen en labelen hen #5 – #8. Voeg 2 μL van radiolabeled primer (stap 1.2.6) in alle acht buizen. Warmte om te gloeien bij 65 ° C gedurende 5 minuten, dan onmiddellijk afkoelen tot 4 ° C in de thermische cycler.
    2. Voeg 4 l 5 x RT buffer (Zie Tabel of Materials), 1 μL van dithiothreitol (DTT, 0,1 M), en 1 μL van dNTP mix (elke 10 mM) aan elk van de acht PCR-buizen.
    3. Voeg 2 l DEPC-behandelde H2O buizen #1 – #4. Voeg 4 μL van ddATP (5 mM), 4 μL van ddTTP (5 mM) en 4 μL van ddCTP (5 mM) in buizen #5 – #7, respectievelijk. 1 μL van ddGTP (5 mM) en 3 μL van DEPC-behandeld water toevoegen aan buis #8. Pipetteer viermaal te mengen.
    4. Verwarm op 52 ° C gedurende 1 min. in de thermische cycler. Voeg 1 μl van reverse-transcriptase (Zie Tabel of Materials), Meng door pipetteren op en neer viermaal. Incubeer de reactie bij 52 ° C gedurende 20 min.
    5. Voeg 1 μL van 5 M NaOH in elk van de buizen te hydrolyseren van RNA. Verwarm de buizen bij 95 ° C gedurende 5 min.
    6. 5 μL van 1 M HCl toevoegen en herhaalt u de ethanol neerslag (stappen 1.3.5 en 1.3.6), behalve de glycogeen en vloeibare overdracht weglaat.
      Opmerking: Weglaten van stap 1.4.6 resultaten in een vervagende regio in het midden van de gel bekend als het "zout front".
    7. Drogen van de DNA-pellet voor 5 min. Voeg 10 μL van H2O en 10 μL van 2 x TBE-ureum proef laden buffer en Pipetteer op en neer 10 keer naar Los opnieuw op. Warmte bij 70 ° C gedurende 5 min. plaats de buizen op ijs vóór het laden op de gel.
  5. PAGINA analyse
    1. Ter voorbereiding van een 8% polyacrylamidegel sequencing, stappen 1.1.6 tot 1.1.10 met de volgende wijzigingen: gebruik 100 mL van 40% acrylamide/bisacrylamide-oplossing (29:1) om te bereiden van een oplossing van 8% acrylamide, en sequencing gel glasplaten (bijvoorbeeld46 x 57 cm) met een 0,4 mm spacer.
    2. Laden 10 μL van het monster uit stap 1.4.7. Stel de gel op 65 W gedurende 2 uur of totdat de onderkant kleurstof 3/4 van de gel bereikt.
      Opmerking: Bewaar de rest van de monsters bij-80 ° C voor het herhalen indien nodig.
    3. Verwijder de bovenste gesiliconiseerd glasplaat door verwijderen van de spacer en een spatel voorzichtig te voegen. Plaats een stuk grote filtreerpapier ter dekking van de gel en druk zachtjes op dat de gel zich te houden aan het koffiefilter. Vanaf de onderkant, til het koffiefilter en verwijderen van de gel uit de glasplaat samen.
    4. Plaats de gel samen met het filtreerpapier op een stuk plasticfolie die groot genoeg is voor de hele gel (filtreerpapier naar boven). Het filtreerpapier/gel/plastic wrap broodje overbrengen in een drogere gel met het filtreerpapier kant naar beneden.
      Let op: Radioactief materiaal om besmetting te voorkomen, gebruik van 3 tot en met 4 meer stukken van grote filtreerpapier tussen de gel sandwich en drogere gel.
    5. Droog de gel bij 70 ° C gedurende 1 uur met een vacuüm. Breng de gel sandwich op een foto-gebleekt fosfor opslag scherm cassette. Bloot de radioactiviteit van de gel op het scherm voor 4-16 h.
    6. Plaats het fosfor opslag scherm op een imaging-apparaat en scannen met medium resolutie (~ 30 min).
      Opmerking: Als een glimlach-achtige artefact aanwezig op de afbeelding van de gel is, corrigeren software (b.v., SAFA) gebruiken voor het verwerken van het beeld tot een publiceerbare kwaliteit. Houd er rekening mee dat de standaard marker lane 1 nucleotide langer dan de 2'-OH wijziging rijstroken is.

2. in-cel vorm

  1. Primer ontwerp
    Opmerking: In tegenstelling tot de vorm van het in vitro hoeft in cel vorm niet te ontwerpen een expressie cassette. Echter een optimale primer set moet worden gebruikt en moeten worden geëvalueerd vóór vorm experimenteren.
    1. Het genereren van ten minste drie unieke primerparen door een BLAST gebaseerde primer design tool (bijvoorbeeldPrimer-BLAST). Studeren pre-mRNA in menselijke cellen, selecteert u het menselijk genoom (niet transcriptome) als een referentiedatabank in Primer paar specificiteit controle Parameters. Kies de grootte van de amplicon in de range van 200-1000-basenpaar (bp).
    2. Extract van de genomic DNA van ~ 106 cellen van belang met een spin kolom gebaseerde methode met de behandeling van RNase A en protease K (Zie Tabel van materialen en gebruik van de fabrikant-protocol). Normaliseren van het gezuiverde genomic DNA in 0.1 μg/μL TE buffer.
    3. Test PCR met het protocol uitgevoerd in stappen 1.1.1 en 1.1.2.
      Opmerking: De gewenste primer set moet een enkele band op een 1,8% agarose gel opleveren.
  2. Cel opstelling en wijziging van de 2'-OH
    Opmerking: Het vergroten van de overvloed van de pre-mRNA van belang, is een minigene met de juiste volgorde onder cytomegalovirus (CMV) promotor voor constitutieve expressie transfected in de cellen van de gastheer.
    1. Vooraf warm het kweekmedium dat 10% foetale runderserum (FBS) en 1 x antibiotica mengsel in de Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) bij 37 ° C. Zaad 293T cellen op 50% confluentie 24 h vóór de transfectie kweekmedium. Veranderen van het medium in 2% FBS in DMEM zonder antibiotica ~ 1 h vóór de transfectie.
    2. Voeg 10 μg minigene plasmide in 100 μl van verminderde serum media (Zie Tabel van materialen) in 1 goed van een 96-wells-plaat. Pipetteer de oplossing op en neer viermaal te mengen.
    3. Voeg 40 l transfectiereagens (Zie Tabel van materialen) in 100 μl van verminderde serum media in een ander putje van de plaat. Pipetteer omhoog en omlaag viermaal te mengen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
    4. Voeg de volledige plasmide-oplossing tot de transfectie reagens schorsing. Pipetteer omhoog en omlaag viermaal te mengen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
    5. Toevoegen van het hele DNA / transfectie reagens mengsel dropwise op het oppervlak van het medium in de schotel. Incubeer bij 37 ° C gedurende 6 – 12 uur.
    6. Het medium gecombineerd en zachtjes eens wassen met 5 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7.4, zonder CaCl2 en MgCl2, Zie Tabel van materialen). Trypsinize van de cellen met 3 mL trypsine oplossing. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
    7. Klop de schotel voorzichtig te distantiëren van de cellen vanaf de onderkant van de schotel. Neutraliseer trypsine met 6 mL gestolde voedingsbodem. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 4 minuten en verwijder het medium.
    8. Resuspendeer de cellen6 ~ 10 voor elk monster in 199 μL van reactie medium (1% FBS in DMEM) en breng de celsuspensie in een 96-wells-plaat. Incubeer de cellen met 1 μL van samengestelde werkoplossing of 1 μL van DMSO in alle drie besturingselementen gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
      Opmerking: Drie controlemonsters moeten worden opgenomen: DMSO controle met NAI, gedenatureerde RNA met NAI en NAI negatieve controle.
    9. 10 μL van 2 M NAI toevoegen aan elk monster, behalve het denatureren controle (DC) RNA en NAI negatieve controles. Pipetteer omhoog en omlaag viermaal te mengen. Incubeer bij 37 ° C voor 15 min. zachtjes schudden de platen aan resuspendeer de cellen om 5 min.
    10. Breng de cellen in de 1.7 mL tubes en centrifugeer bij 400 x g gedurende 2 min zonder vertraging. Verwijder de bovendrijvende vloeistof zonder verstoring van de cel-pellet.
    11. Voeg 0.4 mL guanidinium kaliumthiocyanaatoplossing (Zie Tabel van materialen). Vortex voor 15 s te homogeniseren. Incubeer de monsters bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
      Opmerking: De monsters kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C tot u verdergaat met de volgende stap.
  3. RNA extractie
    1. 0,2 mL chloroform toevoegen aan elk van de monsters guanidinium kaliumthiocyanaat gehomogeniseerd. Vortex voor 15 s. Incubate bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten.
    2. Centrifugeer gedurende 5 min van 12.000 x g - en 4 ° C. De bovenste kleurloze waterige laag bevat RNA. Pipetteer ~ 380 μL van waterige oplossing in een nieuwe 1,7 mL-buis.
      Let op: Niet storen de interfase om besmetting te voorkomen.
    3. Voeg 1,5 x hoeveelheid EtOH toe (~ 570 μL). Vortex voor 15 s te mengen.
    4. Breng 600 μL van RNA mengsel in een RNA isolatie spin-kolom (Zie Tabel van materialen). Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 15 s. negeren de elutievloeistof. Herhaal deze stap passeren alle vloeistof in dezelfde kolom spin.
    5. Was de kolom met 0.35 mL RW1 buffer (Zie Tabel van materialen) door spinnen voor 15 s. toevoegen 80 μL van RNase-vrije DNase ik in RDD buffer (Zie Tabel van materialen). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
      Opmerking: Het is cruciaal voor het verwijderen van alle DNA-besmetting.
    6. Vervolgens was de kolom met 0.35 mL RW1 buffer en 0,6 mL 2 x RPE buffer (Zie Tabel van materialen) door spinnen voor 15 s bij elke stap. Droog de kolom door het centrifugeren van de spin-kolom met een lege collectie buis bij 12.000 x g gedurende 1 minuut.
    7. Voeg 32 l RNase-gratis water naar het midden van de kolom. Incubeer gedurende 1 min. Centrifuge bij 12.000 x g gedurende 30 s ~ 30 μL van gezuiverde RNA oplossing te verkrijgen. Zet de monsters bij-20 ° C tijdens het verwerken van het gedenatureerde monster.
  4. Gedenatureerde RNA controle voorbereiding
    1. Plaats 30 µL RNA monster voor DC in een 1,7 mL plastic buis op ijs. Voeg 50 μl van formamide en 15 μL van DC buffer met 300 mM HEPES (pH 8.0) en 25 mM EDTA in de buis.
    2. Warmte te denatureren RNA bij 95 ° C gedurende 1 min. snel toevoegen 5 μL van NAI stockoplossing (2 M), dan flick tweemaal te mengen en zetten de buis terug op het blok van de verwarming. Incubeer bij 95 ° C gedurende een extra 1 min en vervolgens onmiddellijk de buis op ijs te zetten.
    3. Voeg 0.4 mL kaliumthiocyanaat guanidinium. Herhaal stappen 2.3.1–2.3.4.
    4. Was de kolom met 2 x RPE buffer 0,6 mL (Zie Tabel van materialen) door spinnen voor 15 s bij elke stap. Droog de kolom door het centrifugeren van de spin-kolom met een lege collectie buis bij 12.000 x g gedurende 1 minuut.
    5. Voeg 32 l RNase-gratis water naar het midden van de kolom. Incubeer gedurende 1 min. Centrifuge bij 12.000 x g gedurende 30 s ~ 30 μL van herstelde DC RNA oplossing te verkrijgen.
  5. Primer extensie
    1. Normaliseren de RNA-oplossing van 2.3.7 en 2.4.5 in 0.5 μg/μL met RNase-gratis water. Vers bereiden 30 mM MnCl2 oplossing van MnCl2∙4H2O poeder.
    2. Pipetteer 9 μL van RNA oplossing voor elk monster in een PCR-strip. Voeg 1 μl van 10 mM dNTP en 1 μL van 2 μM gen-specifieke primer (SAP) in elke buis. Pipetteer omhoog en omlaag viermaal te mengen. Incubeer bij 65 ° C gedurende 5 minuten in een thermische cycler en zetten ijs voor > 1 min.
      Opmerking: U kunt ook kan 1 μL van een willekeurige nonamer worden gebruikt ter vervanging van SAP.
    3. In elke buis van PCR, voeg een mengsel van 2 μL van 10 x RT buffer (Zie Tabel of Materials), 4 μL van 30 mM MnCl2en 2 μL van 100 mM DTT. Pipetteer op en neer 4 x te mengen. Incubeer bij 42 ° C gedurende 2 minuten.
    4. Voeg 1 μl van reverse-transcriptase (Zie Tabel van materialen). Pipetteer op en neer 4 x te mengen. Incubeer bij 42 ° C in een thermische cycler gedurende 3 uur.
  6. Voorbereiding van de bibliotheek en de volgende generatie sequencing
    1. Instellen van een PCR reactie door toevoeging van 1 μL van de polymerase van DNA, 5 μl van 10 x de polymerase van DNA buffer (Zie Tabel van materialen), 2 μL van DMSO, 1.5 μL voor elk van de inleidingen (10 μM), 34 μL van H2O en 5 μL van cDNA uit stap 2.5.4.
    2. De thermische cycler als volgt instellen: etappe 1) 95 ° C gedurende 2 min; fase 2) 95 ° C gedurende 30 s; etappe 3) 60 ° C gedurende 30 s; 4e etappe) 68 ° C gedurende 30 s; fase 5) lus terug naar fase 2 voor 30 cycli; fase 6) 68 ° C gedurende 3 minuten; en 7e etappe) oneindige houden bij 4 ° C tot en met de volgende stap.
    3. De amplicon zuiveren met behulp van 1,8% agarose gel.
      Opmerking: De PCR-band moet worden weergegeven als een enkele band op de gel.
    4. Construeer de bibliotheek met behulp van standaard fragmentatie en Afbinding methoden vastgesteld in de literatuur6,26.
    5. Volgorde op een volgende-generatie sequencing-apparatuur met behulp van 1 x 75 single-end leest voor het genereren van ongeveer 10 miljoen leest per monster.
    6. Analyseren van de resultaten met behulp van ShapeMapper en SuperFold software pakketten ontwikkeld door de weken groep26.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij eerder bewezen dat een RNA splicing modulator, SMN-C2, samenwerkt met AGGAAG motief op exon 7 van het SMN2 gen van pre-mRNA en SHAPE gebruikt ter beoordeling van de structurele veranderingen van RNA in het bijzijn van SMN-C26. De bindende site van SMN-C2 is verschillend van de FDA-goedgekeurde antisense oligonucleotide (ASO) voor SMA, nusinersen, die bindt en blokkeert de intronic splicing silencer (ISS) op intron 727,

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In in vitro vorm is het cruciaal voor hoge kwaliteit homogene RNA sjabloon gebruiken. Transcriptie T7, levert echter vaak heterogene sequenties36. Vooral zijn sequenties met ±1 nucleotide in de 3'-terminus met niet te verwaarlozen opbrengsten36 meestal moeilijk te worden verwijderd door polyacrylamidegel zuivering. Heterogene RNA sjabloon kan resulteren in meer dan één set van het signaal in de sequencing gel profilering van de primer extensie product, waardoor het soms moe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd mogelijk gemaakt door de NIH R01 grant (NS094721, K.A.J.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
DNA oligonucleotideIDTgBlock for >200 bp DNA-synthese
Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master MixThermo FisherF566S
NucleoSpin gel and PCR clean-up kitTakara740609.50
MegaScript T7 transcription kitThermo FisherAM1333Bevat 10x reactiebuffer, T7-enzym, NTP en Turbo DNase
DEPC-behandeld waterThermo Fisher750023
2x TBE-uree monsterbufferThermo FisherLC6876
40% acrylamide/ bisacrylamide-oplossing (29:1)Bio-Rad1610146
10x TBE-bufferThermo Fisher15581044
Nalgene Rapid-Flow™ Filter UnitThermo Fisher166-0045
KimwipeKimberly-Clark34133
TEMEDThermo Fisher17919
SYBR-Safe kleurstofThermo FisherS33102
6% TBE-uree mini-gelThermo FisherEC6865BOX
ChemiDocBio-Rad
T4 PNKNEBM0201S
γ-32P-ATPPerkin ElmerNEG035C005MC
Hyperscreen™ Intensifying ScreenGE HealthcareRPN1669calcium tungstate fosfor screen
fosfor opslagschermMolecular DynamicsBAS-IP MS 3543 E
Amersham TyphoonGE Healthcare
NAI (2M)EMD Millipore03-310
GlycoBlueThermo FisherAM9515
SuperScript IV Reverse TranscriptaseThermo Fisher18090010Bevat 5x RT-buffer, SuperScript IV
dNTP-mix (10 mM)Thermo FisherR0192
ddNTP-set (5 mM)SigmaGE27-2045-01
groot filterpapierWhatman1001-917
GeldrogerHoeferGD 2000
QIAamp DNA Blood Mini KitQiagen51104Bevat ook RNase A en protease K
SMN2 minigene34Addgene72287
Heat inactivated FBSThermo Fisher10438026
Pen-StrepThermo Fisher15140122
Opti-MEM IThermo Fisher31985062
FuGene HDPromegaE2311
TrpLEThermo Fisher12605010
DPBS zonder Ca/MgThermo Fisher14190250
TRIzolThermo Fisher15596018
RNeasy mini kolomQiagen74104Bevat ook RW1, RPE-buffer
RNase-Free DNase SetQiagen79254Bevat DNase I en RDD-buffer
De-ioniseerde formamideThermo FisherAM9342
MnCl2•4H2OSigma-AldrichM3634
random nonamerSigma-AldrichR7647
SuperScript First-Strand Synthesis SystemThermo Fisher11904-018Bevat 10x RT-buffer, SuperScript II reverse transcriptase
AccuPrime pfx DNA polymeraseThermo Fisher12344024
NextSeq500Illumina
NucAway kolomThermo FisherAM10070voor ontzoutingsdoeleinden

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. Selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): Quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution. Nature Protocols. 1, 1610-1616 (2006).
  2. Trausch, J. J., et al. Structural basis for diversity in the SAM clan of riboswitches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 6624-6629 (2014).
  3. Souliere, M. F., et al. Tuning a riboswitch response through structural extension of a pseudoknot. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, E3256-E3264. , E3256-E3264 (2013).
  4. Rice, G. M., Busan, S., Karabiber, F., Favorov, O. V., Weeks, K. M. SHAPE Analysis of Small RNAs and Riboswitches. Methods in Enzymology. , 165-187 (2014).
  5. Spitale, R. C., et al. RNA SHAPE analysis in living cells. Nature Chemical Biology. 9, 18-20 (2013).
  6. Wang, J., Schultz, P. G., Johnson, K. A. Mechanistic studies of a small-molecule modulator of SMN2 splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, E4604-E4612 (2018).
  7. Price, I. R., Gaballa, A., Ding, F., Helmann, J. D., Ke, A. Mn 2+ -Sensing Mechanisms of yybP-ykoY Orphan Riboswitches. Molecular Cell. 57, 1110-1123 (2015).
  8. Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. Tertiary contacts control switching of the SAM-I riboswitch. Nucleic Acids Research. 39, 2416-2431 (2011).
  9. Abulwerdi, F. A., et al. Development of Small Molecules with a Noncanonical Binding Mode to HIV-1 Trans Activation Response (TAR) RNA. Journal of Medicinal Chemistry. 59, 11148-11160 (2016).
  10. Shortridge, M. D., et al. A Macrocyclic Peptide Ligand Binds the Oncogenic MicroRNA-21 Precursor and Suppresses Dicer Processing. ACS Chemical Biology. 12, 1611-1620 (2017).
  11. Warner, K. D., Hajdin, C. E., Weeks, K. M. Principles for targeting RNA with drug-like small molecules. Nature Reviews Drug Discovery. 17, 547-558 (2018).
  12. Mullard, A. Small molecules against RNA targets attract big backers. Nature Reviews Drug Discovery. 16, 813-815 (2017).
  13. Shortridge, M. D., Varani, G. Structure based approaches for targeting non-coding RNAs with small molecules. Current Opinion in Structural Biology. 30, 79-88 (2015).
  14. Gallego, J., Varani, G. Targeting RNA with Small-Molecule Drugs: Therapeutic Promise and Chemical Challenges. Accounts of Chemical Research. 34, 836-843 (2001).
  15. Rizvi, N. F., Smith, G. F. RNA as a small molecule druggable target. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 27, 5083-5088 (2017).
  16. Connelly, C. M., Moon, M. H., Schneekloth, J. S. The Emerging Role of RNA as a Therapeutic Target for Small Molecules. Cell Chemical Biology. 23, 1077-1090 (2016).
  17. Palacino, J., et al. SMN2 splice modulators enhance U1-pre-mRNA association and rescue SMA mice. Nature Chemical Biology. 11, 511-517 (2015).
  18. Ratni, H., et al. Discovery of Risdiplam, a Selective Survival of Motor Neuron-2 ( SMN2 ) Gene Splicing Modifier for the Treatment of Spinal Muscular Atrophy (SMA). Journal of Medicinal Chemistry. 61, 6501-6517 (2018).
  19. Naryshkin, N., et al. SMN2 splicing modifiers improve motor function and longevity in mice with spinal muscular atrophy. Science. 345, (2014).
  20. Chiriboga, C., et al. Preliminary Evidence for Pharmacodynamics Effects of RG7916 in JEWELFISH, a Study in Patients with Spinal Muscular Atrophy who Previously Participated in a Study with Another SMN2-Splicing Targeting Therapy (S46.003). Neurology. 90, (2018).
  21. Sivaramakrishnan, M., et al. Binding to SMN2 pre-mRNA-protein complex elicits specificity for small molecule splicing modifiers. Nature Communications. 8, (2017).
  22. Lee, B., et al. Comparison of SHAPE reagents for mapping RNA structures inside living cells. RNA. 23, 169-174 (2017).
  23. Weeks, K. M., Mauger, D. M. Exploring RNA Structural Codes with SHAPE Chemistry. Accounts of Chemical Research. 44, 1280-1291 (2011).
  24. Smola, M. J., et al. SHAPE reveals transcript-wide interactions , complex structural domains , and protein interactions across the Xist lncRNA in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 10322-10327 (2016).
  25. Flynn, R. A., et al. Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE. Nature Protocols. 11, 273-290 (2016).
  26. Smola, M. J., Rice, G. M., Busan, S., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. Selective 2 ′ -hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct , versatile and accurate RNA structure analysis. Nature Protocols. 10, 1643-1669 (2015).
  27. Hua, Y., et al. Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model. Genes & Development. 24, 1634-1644 (2010).
  28. Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478, 123-126 (2011).
  29. Wee, C. D., Havens, M. A., Jodelka, F. M., Hastings, M. L. Targeting SR proteins improves SMN expression in spinal muscular atrophy cells. PloS One. 9, e115205(2014).
  30. Hammond, J. A., Rambo, R. P., Filbin, M. E., Kieft, J. S. Comparison and functional implications of the 3D architectures of viral tRNA-like structures. RNA. 15, 294-307 (2009).
  31. Singh, N. N., Singh, R. N., Androphy, E. J. Modulating role of RNA structure in alternative splicing of a critical exon in the spinal muscular atrophy genes. Nucleic Acids Research. 35, 371-389 (2007).
  32. Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. Accurate SHAPE-directed RNA structure determination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 97-102 (2009).
  33. Qi, H., et al. Preparation of pyridopyrimidine derivatives and related compounds for treating spinal muscular atrophy. , (2013).
  34. Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6307-6311 (1999).
  35. Siegfried, N. A., Busan, S., Rice, G. M., Nelson, J. A. E., Weeks, K. M. RNA motif discovery by SHAPE and mutational profiling (SHAPE-MaP). Nature Methods. 11, 959(2014).
  36. Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
  37. Nilsen, T. W. RNase Footprinting to Map Sites of RNA-Protein Interactions. Cold Spring Harbor Protocols. , (2014).
  38. Velagapudi, S. P., et al. Design of a small molecule against an oncogenic noncoding RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 5898-5903 (2016).
  39. Barnwal, R. P., Yang, F., Varani, G. Applications of NMR to structure determination of RNAs large and small. Archives of Biochemistry and Biophysics. 628, 42-56 (2017).
  40. Scott, L. G., Hennig, M. RNA structure determination by NMR. Methods in Molecular Biology. 452, 29-61 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

In vitro SHAPERNA structureanalysebinding van kleine moleculenSMN2 exon 7primerextensiepolyacrylamidegelelektroforesenext generation sequencingRNA vouwingNAI modificatie

Gerelateerde artikelen