Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Cel fractionering van U937 cellen in het ontbreken van snelle centrifugeren

13.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59022

⸱

18 januari 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om te isoleren van het plasmamembraan, cytoplasma en mitochondria van U937 cellen zonder het gebruik van high-speed centrifugeren. Deze techniek kan worden gebruikt voor het zuiveren van subcellular breuken voor latere onderzoek van eiwit lokalisatie via immunoblotting.

Samenvatting

In dit protocol detail wij een werkwijze te halen subcellular breuken van U937 cellen zonder het gebruik van ultracentrifugatie of willekeurige detergentia. Deze methode maakt gebruik van hypotone buffers, digitonin, mechanische lysis en differentiële centrifugeren te isoleren van het cytoplasma, de mitochondriën en het plasma membraan. Het proces kan worden aangepast om te voldoen aan de behoeften van de onderzoekers, is goedkoop en eenvoudig. Deze methode zal toelaten onderzoekers om te bepalen van de lokalisatie van de eiwitten in cellen zonder gespecialiseerde centrifuges en zonder het gebruik van commerciële kits, die beide onbetaalbaar worden kunnen. We hebben met succes gebruikt deze methode om te scheiden cytosolische, plasmamembraan en eiwitten mitochondriaal in de menselijke monocyt cellijn U937.

Inleiding

Betrouwbare identificatie van eiwit lokalisatie is vaak noodzakelijk, bij het onderzoek van moleculaire pathways in eukaryote cellen. Methoden om te verkrijgen subcellular breuken worden gebruikt door onderzoekers nauwer onderzoeken cellulaire componenten van belang.

Het merendeel van de bestaande cel fractionering methoden in het algemeen vallen in twee brede categorieën, wasmiddel gebaseerde,1,2 en ultracentrifugatie gebaseerde,3,4,5, die kunnen worden onderscheiden zich door snelheid, precisie en kosten. Wasmiddel gebaseerde protocollen, is afhankelijk van het gebruik van buffers met toenemende wasmiddel kracht om te solubilize van de verschillende onderdelen van de cel. Dit kan is een snelle en handige methode voor het verwerken van monsters en kosteneffectief als het aantal en de grootte van de monsters klein zijn. Wasmiddel-gebaseerde kits kunnen worden gekocht om te isoleren cytoplasmatische membraan/organel (gemengde fractie) en nucleaire breuken uit cellen. Echter, verschillende nadelen verbonden aan deze kits beperken hun nut voor de onderzoekers. Ze zijn ontworpen om te isoleren gemakkelijk een of twee onderdelen van de cel, maar zijn niet in staat om alle breuken uit een steekproef gelijktijdig te isoleren. Het gebruik van detergentia betekent dat het plasmamembraan en membraan-omsloten organellen even zal worden solubilized en dus niet van elkaar worden gescheiden. Een extra complicatie ontstaat uit de eigen componenten in deze kits die verhindert dat onderzoekers wijziging van de voorwaarden voor specifieke toepassingen. Tot slot, ze zijn beperkt in aantal toepassingen en kunnen worden onbetaalbaar voor grotere schaal experimenten. Non-wasmiddel gebaseerde kits bestaan voor de isolatie van mitochondriën, echter ze zijn niet ontworpen om te isoleren plasmamembraan en de opbrengst van het monster is aanzienlijk minder dan die van dichtheid centrifugeren op basis van isolatie protocollen6,7 .

Methoden die gebruikmaken van ultracentrifugatie voor breuken zijn meer tijdrovend, maar vaak resulteren in zuiverder breuken dan wasmiddel-gebaseerde kits. Zij worden door een niet-wasmiddel-methode die gevolgd wordt door een scheiding van cellulaire componenten via differentiële lysed moeten plasma membranen van cellen isoleren zonder eerste solubilizing hen (wat resulteert in verontreiniging met membraan organellen) centrifugeren — met plasmamembraan isolatie vereisen snelheden van 100.000 × g te bereiken. In veel gevallen moet de differentiële centrifugeren worden gevolgd door isopycnic dichtheid kleurovergang centrifugeren voor verdere scheiding van cellulaire breuken of verwijdering van verontreinigende stoffen. Terwijl deze methoden grondige en aanpasbaar zijn, zijn nadelen kosten, tijd consumptie en de noodzaak van een ultracentrifuge voor scheiding van breuken en verdere zuivering via dichtheid kleurovergang centrifugeren. Meeste high-speed centrifuges zijn tegen een kostprijs die is onbetaalbaar voor individuele onderzoekers en zijn vaak gedeeld, core apparatuur op academische instellingen. Zo wordt de ultracentrifuge beschikbaarheid onbetaalbaar is in deze situaties.

In dit protocol fractionering tonen wij de isolatie van subcellular breuken zonder het gebruik van solubilizing van detergentia en zonder hoge snelheid centrifugeren. Deze methode zal toelaten onderzoekers te isoleren van het plasmamembraan, de mitochondriën en de cytoplasmatische onderdelen van een eukaryote cel met minimale besmetting tussen breuken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Prepareer Buffers en reagentia

Opmerking: Zie tabel 1.

  1. Bereid oplossingen van buffer A, lysis-buffermengsel B, monster buffer en digitonin.
    1. Bereiden buffer A door toe te voegen 8.77 g NaCl en 50 mL HEPES (1 M, pH 7.4) tot 900 mL gedeïoniseerd water, aanpassen eindvolume tot 1 L met gedeïoniseerd water.
      Opmerking: Eindconcentraties zijn 150 mM NaCl en 50 mM HEPES.
    2. Bereiden van lysis-buffermengsel B door toevoegen van 20 mL HEPES (1 M, pH 7.4), 0,75 g van KCl, 0,19 g MgCl2, 2 mL ethyleendiamminetetra zuur (EDTA 0.5 M), 2 mL ethyleen glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-Dinatriumethyleendiaminetetra-azijnzuuroplossing (0.5 M EGTA) , 38.26 g van mannitol en 23.96 g van sacharose tot 900 mL gedeïoniseerd water, aanpassen eindvolume tot 1 L met gedeïoniseerd water.
      Opmerking: Eindconcentraties zijn 20 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, mannitol 210 mM en 70 mM sacharose.
    3. Voorbereiden op monster buffer door toevoeging van 0,01 g natrium dodecyl sulfaat (SDS) tot 10 mL tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) een eindconcentratie van 0,1% SDS.
    4. Bereid een stockoplossing van digitonin door 25 mg digitonin toe te voegen aan 100 mL gedeïoniseerd water (eindconcentratie is 250 µg/mL).
    5. Sla alle bufferoplossingen bij 4 ° C en digitonin bij-20 ° C tot de start van het experiment.
  2. Bereiden van verse oplossingen van protease en phosphatase inhibitors aan bufferoplossingen vóór toevoeging aan cellen worden toegevoegd.
    1. Bereiden van een stamoplossing van phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) door 17.4 mg PMSF toe te voegen tot 1 mL ethanol 100% (eindconcentratie is 100 mM).
      Let op: Draag geschikte beschermende uitrusting en oefening voorzichtigheid bij hantering van de PMSF. PMSF is gevaarlijk indien ingeslikt en nauwelijks gevaarlijk in geval van contact met de huid (irriterend), contact met de ogen (irriterend) of inhalatie; het is corrosief voor de ogen en huid.
    2. Bereiden van een commercieel beschikbare protease inhibitor cocktail (100 ×) volgens instructies van de fabrikant (Zie de Tabel van de materialen).
    3. Voorbereiden van een stamoplossing van natrium orthovanadate (SOV) door toevoeging van 92 mg SOV aan 1 mL gedeïoniseerd water (eindconcentratie is 500 mM).
      Let op: Draag geschikte beschermende uitrusting en wees voorzichtig bij het hanteren. SOV is gevaarlijk in geval van contact met de ogen (irriterend), ingestie of inhalatie. Ernstige overmatige blootstelling kan resulteren in de dood.

2. PBS Wash

  1. Concentreer je en wassen van cellen in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) vóór fractionering.
    1. Centrifuge celsuspensie op een juiste snelheid maken een pellet. Bijvoorbeeld centrifugeren een suspensie van U937 cellen bij 400 × g gedurende 10 minuten.
    2. Verwijder het supernatant, resuspendeer cel pellet in kamertemperatuur PBS op een eindconcentratie van 4 × 10-6 cellen/mL en pipet zachtjes te breken van de bosjes.
    3. Centrifugeer de celsuspensie bij 400 × g gedurende 10 minuten naar pellet cellen.
    4. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet cel in ijskoude buffer A op een eindconcentratie van 2 × 107 cellen/mL.
      Opmerking: Alle volgende stappen moeten worden uitgevoerd bij 4 ° C of op ijs en alle buffers moet vooraf gekoeld.

3. cytosolische eiwit isolatie

  1. Uittreksel cytosolische eiwitten door incubatie met het wasmiddel digitonin.
    1. Onmiddellijk voorafgaand aan resuspensie van cellen (stap 3.1.3) Voeg 10 µL van voorraad PMSF (100 mM), 10 µL van protease Inhibitor (100 ×), 2 µL van voorraad SOV (500 mM) en 100 µL van stock digitonin (250 µg/mL) met 878 µL van buffer A (eindconcentraties zijn 1 mM PMSF , 1 × proteaseinhibitor, 1 mM SOV en 25 µg Mo/mL digitonin; aanpassen van het eindvolume volgens het aantal cellen wordt gebruikt). Bewaar deze oplossing op ijs tot toevoeging aan cel pellet.
    2. Centrifugeer de celsuspensie bij 400 × g gedurende 10 minuten en verwijder de bovendrijvende substantie.
    3. Resuspendeer de pellet cel in A Bufferoplossing met remmers en digitonin (bereid in stap 3.1.1) op een eindconcentratie van 2 × 107 cellen/mL pipet zachtjes te breken van de bosjes.
    4. Incubeer de celsuspensie op een eind over rotator bij 4 ° C gedurende 20 minuten.
    5. Centrifugeer de celsuspensie bij 400 × g gedurende 10 min. verzamelen het supernatant en breng dit in een schone centrifugebuis.
    6. Centrifugeer het verzamelde supernatant bij 18.000 × g gedurende 20 min naar pellet cellulaire puin.
    7. Het supernatant overbrengen in een schone centrifugebuis.
    8. Herhaal de stappen 3.1.5 en 3.1.6 om geen pellet wordt verkregen na centrifugeren.
    9. Het supernatant de cytosolische eiwitten bevattende diervoeders te verzamelen en op te slaan bij 4 ° C (korte termijn) of -20 ° C (lange termijn).
  2. Verwijder overtollige digitonin en cytosolische eiwitten door middel van centrifugeren.
    1. Resuspendeer de pellet digitonin-permeabel cel (uit stap 3.1.5) in A buffer op een eindconcentratie van 4 × 10-6 cellen/mL en pipet zachtjes te breken van de bosjes.
    2. Centrifugeer de digitonin-permeabel celsuspensie bij 400 × g gedurende 10 minuten en verwijder de bovendrijvende substantie.
      Opmerking: Herhaalde wast in buffer A kunnen worden uitgevoerd om te verwijderen van de overtollige cytosolische contaminanten.

4. de homogenisering van de cel

  1. Incubeer de cellen op het ijs in lysis-buffermengsel B en lyse hen door mechanische middelen.
    1. Onmiddellijk voorafgaand aan resuspensie van cellen (stap 4.1.2) 10 µL van voorraad PMSF (100 mM) en 2 µL van voorraad SOV (500 mM) toevoegen aan 988 µL van lysis buffer B (eindconcentraties zijn van 1 PMSF en 1 mM SOV; aanpassen eindvolume zodat aantal wordt lysed cellen) en houden solu tion op ijs tot toevoeging aan cel pellet.
    2. Resuspendeer de pellet van de cel (uit stap 3.2.2) in ijskoude lysis buffer B oplossing met PMSF en SOV (bereid in stap 4.1.1) op een eindconcentratie van 4 × 106 cellen/mL.
    3. Incubeer de celsuspensie op ijs gedurende 30 minuten.
    4. De celsuspensie overbrengen in een vooraf gekoeld Dounce homogenizer (met een strakke B stamper) op ijs en 40 passen uit te voeren met de stamper van de homogenizer met behulp van traag, zelfs lijnen.
      Opmerking: Als alternatief gebruik maken van andere middelen van lysis van de cel van de mechanische zoals beschreven in de sectie discussie.
    5. Het homogenaat verzamelen en overbrengen naar een schone centrifugebuis.
    6. Wassen van de stamper van de homogenizer en de buis met een kleine hoeveelheid (1 tot 2 mL) lysis-buffermengsel B en toevoegen aan het homogenaat.
    7. Centrifugeer het homogenaat op 400 × g (of de minimale snelheid vereist voor de pellet ongebroken cellen) gedurende 10 minuten.
    8. Het supernatant overbrengen in een schone centrifugebuis.
      Opmerking: Als een belangrijke pellet Herhaal stap 4.1.4 via 4.1.6 blijft te verhogen van het rendement van breuken als beschreven in de sectie discussie. Het protocol kan hier worden onderbroken, en het homogenaat opgeslagen bij 4 ° C voor korte termijn (24 h).

5. differentiële centrifugeren

  1. Centrifugeer het homogenaat op het verhogen van de snelheden cellulaire puin, isoleren mitochondriën en membraan breuken te verwijderen.
    1. Centrifugeer het supernatant (uit stap 4.1.8) bij 500 × g gedurende 10 min. overdracht supernatant aan een schone centrifugebuis, en gooi een pellet.
    2. Centrifugeer supernatant (uit stap 5.1.1) bij 1000 × g voor 10 min. overdracht de bovendrijvende substantie aan een schone centrifugebuis, en gooi een pellet.
    3. Centrifugeer het supernatant (uit stap 5.1.2) bij 2.000 × g gedurende 10 min. de bovendrijvende vloeistof overdracht aan een schone centrifugebuis, en gooi een pellet.
    4. Centrifugeer het supernatant (uit stap 5.1.3) bij 4.000 × g gedurende 15 min. overdracht supernatant aan een schone centrifugebuis houden pellet met mitochondriën.
    5. Resuspendeer de pellet mitochondriën in een klein volume (0.5\u20121 mL) van lysis-buffermengsel B.
    6. Centrifugeer de gesuspendeerde pellet bij 4.000 × g gedurende 15 min. verwijderen het supernatant en resuspendeer de mitochondriale pellet in het gewenste eindvolume van monster buffer (bijv., 250 tot 500 µL, afhankelijk van de grootte van de pellet en gewenst concentratie).
    7. Centrifugeer het supernatant (uit stap 5.1.4) bij 4.000 × g gedurende 15 min. het supernatant overbrengen in een schone centrifugebuis. Herhaal deze stap totdat geen pellet wordt verkregen na centrifugeren.
    8. Draai het supernatant bij 18.000 × g gedurende 3u.
    9. Verwijder het supernatant en houden van de pellet met membraaneiwitten. Resuspendeer de pellet membraan in een klein volume (0,5 – 1 mL) van lysis buffer B.
    10. Centrifugeer de gesuspendeerde pellet op 18.000 × g gedurende 1 uur.
    11. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet membraan in de gewenste eindvolume van monster buffer (250 à 500 µL, afhankelijk van de grootte van de pellet en de gewenste concentratie).
  2. Bewerk de voorbeeld-pellets voor 3 ultrasone trillingen ten s in een ijsbad bij een instelling van het vermogen van 5 (50% van de 125 W maximumvermogen op 20 kHz, Zie De tabel van materialen).
  3. Opslaan van de monsters bij 4 ° C (korte termijn) of -20 ° C (lange termijn).
  4. De monsters voor de zuiverheid van fractionering onderzoeken door het uitvoeren van een westelijke vlek met behulp van antilichamen tegen het eiwit markeringen gevonden in het cytoplasma, mitochondriën en membraan compartimenten van de cel (Raadpleeg de sectie representatieve resultaten).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Succesvolle fractionering ongedifferentieerde U9378 cellen gekweekt in suspensie werd bereikt met behulp van het protocol hierboven is uiteengezet en geïllustreerd in Figuur 1. De monsters die met deze methode verkregen werden onderworpen aan westelijke bevlekkende9 gebruik te maken van een NAT overzetmethode naar een membraan Polyvinylideenfluoride (PVDF) fluoride. Het membraan was vervolgens gesondeerd met ant...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De ontwikkeling van dit protocol is ontstaan uit een onvermogen om te scheiden van mitochondriale en membraan monsters, met behulp van commercieel beschikbare kits, p.a. van eiwit lokalisatie tijdens necroptosis14. De primaire beperkingen van premade kits zijn hun onvermogen om te worden aangepast aan de behoeften van individuele onderzoekers, hun kosten per monster en beperkt aantal monsters kan worden verwerkt. De methode die hier gepresenteerd kan worden uitgevoerd zonder het gebruik van dure r...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflict

Dankbetuigingen

Het werk werd ondersteund door de NIH-1R15HL135675-01 tot en met Timothy J. LaRocca

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
DigitoninTCI ChemicalsD0540Voor Cytoplasma Extractie
D-MannitolSigma-AldrichM4125Voor Lysis buffer B
Dounce homogenisatorVWR22877-282Voor Homogenisatie
end-over-end rotatorBarnsteadN/AVoor Cytoplasma Extractie
ethyleen glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraazijnzuur (EGTA)Alfa AesarJ61721Voor Lysis buffer B
Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)Sigma-AldrichE7889Voor Lysis buffer B
GAPDH (14C10)Cell Signalling Technologies2118Voor detectie van cytoplasmatische fracties op western blot, verdunning: 1:10000
HEPESVWRJ848Voor Lysis buffers A en B
KClSigma-AldrichP9541Voor Lysis buffer B
MgCl2Alfa Aesar12315Voor Lysis buffer B
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)Cell Signalling Technologies23565Voor detectie van plasmamembraan fracties op western blot, verdunning: 1:1000
NaClSigma-Aldrich793566Voor Lysis buffer A
fenylmethanesulfonylfluoride (PMSF)VWRM145Voor Cytoplasma Extractie en Homogenisatie Buffer
probe sonicatorQsonicaQ125-110Voor Definitieve Monsters
Protease Inhibitor Cocktail, Algemeen GebruikVWRM221-1MLVoor Cytoplasma Extractie
gekoelde centrifugeBeckman-CoulterN/A
Natriumdodecylsulfaat (SDS)VWR227Voor Sample buffer
natriumorthovanadate (SOV)Sigma-Aldrich450243Voor Lysis buffers A en B
SucroseSigma-AldrichS0389Voor Lysis buffer B
Tris-gebufferde Saline (TBS)VWR788Voor Sample buffer
VDAC (D73D12)Cell Signalling Technologies4661Voor detectie van mitochondriale fracties op western blot, verdunning: 1:1000

Referenties

  1. Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, e440-e445 (2015).
  2. Hwang, S. II, Han, D. K. Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility. Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).
  3. Song, Y., Hao, Y., et al. Sample preparation project for the subcellular proteome of mouse liver. Proteomics. 6 (19), 5269-5277 (2006).
  4. Lenstra, J. A., Bloemendal, H. Topography of the total protein population from cultured cells upon fractionation by chemical extractions. European Journal of Biochemistry. 135 (3), 413-423 (1983).
  5. Michelsen, U., von Hagen, J. Chapter 19 Isolation of Subcellular Organelles and Structures. Methods in Enzymology. 463 (C), 305-328 (2009).
  6. Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses). Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).
  7. Williamson, C. D., Wong, D. S., Bozidis, P., Zhang, A., Colberg-Poley, A. M. Isolation of Endoplasmic Reticulum, Mitochondria, and Mitochondria-Associated Membrane and Detergent Resistant Membrane Fractions from Transfected Cells and from Human Cytomegalovirus-Infected Primary Fibroblasts. Current protocols in cell biology. 68, 3.27.1-3.27.33 (2015).
  8. Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
  9. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  10. Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).
  11. Hodge, T., Colombini, M. Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels. Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).
  12. Therien, aG., Blostein, R. Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology. Cell physiology. 279 (3), C541-C566 (2000).
  13. Devarajan, P., Stabach, P. R., De Matteis, M. A., Morrow, J. S. Na,K-ATPase transport from endoplasmic reticulum to Golgi requires the Golgi spectrin-ankyrin G119 skeleton in Madin Darby canine kidney cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 10711-10716 (1997).
  14. McCaig, W. D., Patel, P. S., et al. Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis. Cell Death Discovery. 4, 55(2018).
  15. Simpson, R. J. Homogenization of Mammalian Tissue. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Hypotone bufferdigitonine lysedifferenti le centrifugatieisolatie van het cytoplasmaisolatie van mitochondriaisolatie van het plasmamembraaneiwitlokalisatiesubcellulaire fracties
Cel fractionering van U937 cellen in het ontbreken van snelle centrifugeren
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.