Methodenartikel

Een verbeterde en hoge doorvoer respiratoir syncytieel Virus (RSV) Micro-neutralisatie Assay

10.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59025

⸱

26 januari 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Murdoch Children's Research Institute, 2Department of Paediatrics, University of Melbourne, 3School of Chemistry and Molecular Bioscience, University of Queensland, 4London School of Hygiene and Tropical Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie beschrijft een hoog debiet, imaging gebaseerde micro-neutralisatie test om te bepalen van de titer van neutraliserende antilichamen specifiek voor respiratoir syncytieel virus (RSV). Deze bepaling-indeling is getest op verschillende monster typen.

Samenvatting

Respiratoir syncytieel virus-specifieke neutraliserende antilichamen (RSV NAbs) zijn een belangrijke markering van bescherming tegen RSV. Een aantal verschillende assay formaten zijn momenteel in gebruik wereldwijd dus er is een behoefte aan een nauwkeurige en high-throughput methode voor het meten van RSV NAbs. Hier beschrijven we een imaging gebaseerde micro-neutralisatie bepaling die is getest op RSV deelgroep A en kan ook worden aangepast voor RSV deelgroep B en verschillende monster typen. Deze methode is zeer reproduceerbaar is, met inter assay variaties voor de referentie-antiserum wordt minder dan 10%. Wij geloven dat deze bepaling kan worden gemakkelijk vast te stellen in veel laboratoria wereldwijd tegen relatief lage kosten. Ontwikkeling van een verbeterde, hoge-doorvoer bepaling dat maatregelen van RSV NAbs vormt een belangrijke stap voorwaarts voor de normalisatie van deze methode internationaal evenals kritisch voor de beoordeling van nieuwe RSV vaccin kandidaten in de toekomst.

Inleiding

Respiratoir syncytieel virus (RSV) is de belangrijkste oorzaak van infecties van de lagere luchtwegen in de pediatrische bevolking wereldwijd1. Ondanks haar hoge last is er nog geen vaccin of behandeling beschikbaar. Sinds 2013, heeft de World Health Organization (WHO) verklaard RSV vaccinontwikkeling prioritair grote onderzoeksprogramma, met jaarlijkse WHO overleg vergaderingen2,3. De WHO is overeengekomen over het gebruik van RSV neutraliserende antilichamen (NAb) meting volgen vaccin immunogeniciteit, zoals dit is erkend als belangrijke serologische markering van bescherming4. SurePress Touchscreen nAbs is aangetoond dat ze beschermen tegen ernstige RSV-infectie in een aantal studies alsook de klinische proeven van de anti-RSV monoklonaal antilichaam palivizumab, momenteel de alleen preventieve strategie beschikbaar4.

Er zijn meerdere NAb assay formaten gebruikt door laboratoria wereldwijd, met inbegrip van cel- en moleculaire gebaseerde testen, die hebben ingespannen normalisatie uitdagende5,6,7,8. De conventionele plaque-reductie neutralisatie (PRN) bepaling die meet het aantal verminderde plaque vorming van eenheden (PFU) door de aanwezigheid van een RSV-specifieke antilichaam blijft echter nog steeds de gouden standaard9. Wij rapporteren hier, een betere, vereenvoudigde en high-throughput PRN-protocol dat worden op talrijke cellijnen, voor verschillende RSV stammen en met verhoogde assay debiet gebruikt kan. Dit protocol is getest met behulp van klinische monsters uit verschillende instellingen alsmede op monsters uit dierlijk model experimenten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Opmerking: Alle stappen moeten worden uitgevoerd in een BSL2 kap, tenzij anders vermeld. Virale titratie is vereist voorafgaand aan een PRN-test om te bepalen van de optimale RSV-concentratie in de PRN-bepaling gebruikt. Het is aanbevolen om aliquot de virusvoorraden in een klein volume die zal worden eenmaal ontdooid en gebruikt voor elke NAb assay. Gebruik van de dezelfde virale voorraad voor alle NAb tests uitgevoerd voor alle monsters uit een studie is ook aanbevolen. Zorg ervoor dat cultuurmedia en -fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij 37 ° C is opgewarmd voordat u toevoegt aan cel platen.

1. RSV virale titratie

Opmerking: Afhankelijk van het aantal virusvoorraden en het aantal duplicaten, kan worden ingesteld in de plaat assay volgens Figuur 1. Elke virus voorraad moet worden getitreerd in drievoud naar beneden de assay plaat, beginnend bij de hoogste virale concentratie (dat wil zeggen, 1:10). Seriële titraties kunnen meestal 1:10. De cultuur van de cel van de A549 en onderhoud, alsmede RSV cultuur procedure zijn gedaan met behulp van standaardprocedures en zijn niet opgenomen in dit protocol.

  1. Zaaien van platen (dag 1)
    1. Resuspendeer de cellen van de A549 in de Dulbecco bewerkt Eagles medium (DMEM) + 10% foetaal kalfsserum (FCS) + 1000 IU penicilline/streptomycine (pen/strep) op de 4 x 105/mL. Zaad 96-Wells flat-onder steriele platen met 100 μl per putje met 4 x 104 A459 cellen.
    2. Incubeer de platen 's nachts bij 37 ° C, 5% CO2 (cellen zal zijn in de groei van de log-fase).
      Opmerking: Gebruik nieuwe A549 cel injectieflacon na 23 passages. Het is aanbevolen om niet start de experimenten, wanneer een nieuwe cel flacon bevindt zich nog in de eerste drie passages.
  2. Virusinfectie (dag 2)
    1. Voorbereiding van virus seriële verdunning
      1. Snel ontdooien een enkele bevroren Injectieflacon van RSV in een waterbad 37 ° C tot bijna volledig ontdooid en onmiddellijk van kracht worden op het ijs. Bereiden 3 wordt gerepliceerd op elke RSV virus voorraad worden bepaald, gebruik van een eerste virus voorraad verdunning 1:10 met 100 μl van verdunde virus per putje en reserveren van ten minste één kolom voor de negatieve controle.
        Opmerking: Figuur 1 toont negatieve controle in triplicates.
      2. Voeg 100 μl van elke verdunde virus op 1:10 in drievoud van rij A van een 96-Wells U-onder steriele plaat. 90 μl per putje van DMEM + 1000 IU pen/strep zonder FCS toevoegen aan rijen B aan H.
      3. Uitvoeren van seriële 1:10 verdunningen beneden de plaat door de overdracht van 10 μL van rij A rij B. Mix oplossing door pipetting inhoud op en neer 5 keer en blijven het tienvoudige verdunningen tot rij H. Discard de laatste 10 μL zodat het eindvolume in elk goed 90 μL.
        Opmerking: Het is belangrijk om het gebruik van nieuwe tips voor elke verdunning.
    2. Virus inoculatie naar A549 cellen
      1. A549 cell plate(s) voorbereid op de vorige dag ophalen. Zorg ervoor dat A549 cel monolayers in de 96-wells-platen ~ 80% heuvels. Media verwijderen door zachtjes plaat omkeren en licht bevlekken op steriel absorberend papier handdoek.
      2. Was alle putjes met 100 μl van PBS tweemaal, ontdoen van overtollige PBS door voorzichtig omkeren plaat en licht bevlekken op steriel absorberend papier handdoek na elke wasbeurt. Laat geen platen om te drogen.
      3. De verdunningen van het virus van de virale titratie plaat (Figuur 1) overbrengen aan overeenkomstige putjes op de plaat van de cel A549. Incubeer de plaat gedurende 1 uur bij 37 ° C, 5% CO2. Na een incubatieperiode van 1 h, decanteren supernatant met behulp van een precisiepipet (kruis om verontreiniging te voorkomen). Nemen 90 μl per putje.
      4. Voeg 100 μl van 1 x medium 199 (M199, zie tabel van materialen) + natriumzout van 1,5% carboxymethylcellulose (CMC) lage viscositeit + 2% FCS met pen/strep aan elk putje.
        Opmerking: 2 x M199 + 4% FCS + pen/strep 2% en 3% CMC oplossingen moeten worden voorbereid en opgeslagen bij 4 ° C voor toekomstig gebruik. Zorg ervoor dat de oplossing voordat u toevoegt aan de platen bij 37 ° C is opgewarmd.
        1. Bereiden van 2 x M199 oplossing: 1 zakje/500 mL gedistilleerd water + 20 mL FCS + 10 mL pen/strep (om 2 x MI99). Filtreer de oplossing met behulp van een 0,22 μm filter eenheid.
        2. Voorbereiding van 3% CMC, voeg 15 g CMC langzaam in 500 mL gedestilleerd water. Los de CMC in water met behulp van metallisch roerder kachel bij 50 ° C, waarin ongeveer 1 h van voorbereiding. Mix goed op 3% CMC en autoclaaf de oplossing.
          Opmerking: De CMC solide moet worden toegevoegd aan het water om te worden ontbonden; water toe te voegen aan de droge vaste stof produceert een "klomp" van het lichaam dat is heel moeilijk te ontbinden.
        3. 1 x M199 + 1,5% CMC lage viscositeit bereiden + 2% FCS pen/strep door het mengen van 1:1 met de 2 x M199 en 3% CMC bereid in stap 1.2.2.4.2.
      5. Incubeer de plaat gedurende 3 dagen bij 37 ° C, 5% CO2.
  3. Ontwikkeling van assay plaat en analyse (dag 5)
    1. Fixatie en ontwikkelende assay plaat
      1. Gooi CMC, M199 + 2% FCS met pen/strep door zachtjes het omkeren van de plaat. Voeg langzaam (om te voorkomen dat de cellaag verstoren) 200 μL van fixatie buffer (80% aceton, 20% PBS, opgeslagen bij-20 ° C) cellen vast te stellen. Incubeer bij-20 ° C gedurende 20 minuten.
      2. Negeren van de fixatie buffer en zachtjes vlek op absorberend papier handdoek. Laat de plaat gezicht neer aan droge gedurende 10 minuten.
        Opmerking: Vanaf deze stap, kan test worden uitgevoerd buiten de BSL2 kap.
      3. Bereiden van 5% melk verdunningsmiddel blokkerende oplossing in gefilterde PBS met 0,05% Polysorbaat 20 (PBS-polysorbaat, Zie Tabel van materialen). Voor één plaat, het berekenen van het volume die nodig is voor blokkeren op basis van 200/110 en wells: 200/goed x 110 wells = 22 mL (1.1 mL geconcentreerde melk in 20.9 mL verdunningsmiddel gefilterd PBS-polysorbaat). In dit stadium ook voldoende blokkerende oplossing voor primaire en secundaire antilichamen make-up. Voor één plaat, het berekenen van het volume die nodig zijn voor elke antilichaam-oplossing op basis van 50/goed en 110 wells: 50/goed x 110 wells = 5,5 mL. Daarom is de totale hoeveelheid melk verdunningsmiddel blokkeren oplossing nodig voor een enkele plaat assay 33 mL.
      4. Voeg toe 200 berichten van blokkerende oplossing. Incubeer plaat bij kamertemperatuur (RT) gedurende 30 min. negeren de oplossing door zachtjes de plaat omkeren en vlek op absorberend papier handdoek.
      5. Voorbereiden 1:500 geit X RSV antilichaam (mAb-primair antilichaam) verdund in het blokkeren van de oplossing. Voeg 50 berichten van de mAb-oplossing toe en Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 h. Wash plaat 3 keer met gefilterde PBS-polysorbaat.
      6. Voorbereiden 1:5,000 Alexa-Fluor ezel anti-geit IgG (secundair antilichaam) verdund in het blokkeren van de oplossing. Voeg 50 berichten voor de oplossing van secundair antilichaam en Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 h. Wash plaat 5 keer met gefilterde PBS-polysorbaat.
      7. Plaat op een lezer van de geautomatiseerde vlekken met behulp van het fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-kanaal lezen en tellen van instellingen zoals afgebeeld in Figuur 2. Plaat in folie wikkelen en bewaren bij 4 ° C. Kalibreren van het instrument met behulp van een cultuur van ongebruikte 96-wells-plaat en invoeren van graaf instellingen vóór assay.
        Opmerking: Opnieuw scannen binnen een paar dagen is mogelijk indien nodig. De kalibratie en de graaf instelling kunnen worden opgeslagen en gebruikt voor het toekomstige scannen als de bepaling maakt gebruik van hetzelfde type plaat gebruikt voor de kalibratie.
      8. Controleer de beelden van putten voor artefact plaques of verstoord cel monolayers (Figuur 3). Putjes met verstoorde cel monolayers uitsluiten.
        Opmerking: Afhankelijk van de grootte van de plaques artefact, handmatige graven moet worden uitgevoerd voor deze putten of die putten wellicht moeten worden afgevoerd van data-analyse. Criteria voor een geldig resultaat omvatten geen verstoord cel enkelgelaagde of artefact plaques gedetecteerd in meer dan één repliceren goed en geen PFU gedetecteerd in negatieve wells (wells zonder toegevoegde virus).
    2. Virale concentraties bepalen
      1. Kies de laatste twee verdunningen waar vlekken duidelijk kunnen worden geteld. Bereken het gemiddelde aantal plekken uit repliceren putten bij de dezelfde verdunning. Bereken de virale titer (PFU per mL) van de voorraad monster met behulp van de onderstaande formule:
        PFU/mL = gemiddelde aantal plaques / (verdunning factor × Volume van de verdunde virus toegevoegd aan het putje)
        Opmerking: De concentratie van de virus bepaald voor elk aandeel RSV kan nu worden gebruikt in de PRN-test (stap 2).

2. RSV neutralisatie Assay

  1. Zaaien van platen (dag 1)
    1. Resuspendeer de cellen van de A549 in DMEM + 10% FCS + 1000 IU pen/strep op 4 x 10,5/mL. Zaad 96-Wells flat-onder steriele platen met 100 μl per putje met 4 x 104 A459 cellen en incubeer platen 's nachts bij 37 ° C, 5% CO2 (cellen zal zijn in de groei van de log-fase).
      Opmerking: Gebruik nieuwe A549 cel injectieflacon na 23 passages. Het is niet aanbevolen om het gebruik van A549 cellen voor passage nummer 3.
  2. Virus en serum voorbereiding (dag 2)
    Opmerking: Afhankelijk van het type van de steekproef zijn er stappen die zijn vereist voor voorbewerkend monsters vóór de bepaling van de NAb. Het is aanbevolen om gebruik van de RSV internationale standaard sera die nu beschikbaar is op verzoek van het Nationaal Instituut voor biologische normen en controles (NIBSC).
    1. Voorbereiding van de serumverdunning
      1. Ontdooi de menselijke RSV referentie-antiserum (referentieserum, REF) en serum testopnames in serummonsters RT. warmte-inactivering en verwijst naar antiserum in een waterbad bij 56 ° C gedurende 30 minuten vóór gebruik. Maak verdunningen volgens de plaat sjabloon (Figuur 4).
      2. Maak 1:100 verdunning van de REF. voorbereiden een minimum van 110 μL van REF verdund in DMEM + pen/strep zonder FCS per assay plaat (b.v., 1,5 μL van REF in een totaal volume van 150 μl). Voeg 110 μL van 1:100 verdund REF in goed A12 van een 96-Wells U-onder steriele plaat.
      3. Voeg 55 l DMEM + pen/strep zonder FCS putjes B12 aan H12 in kolom 12. Uitvoeren serie 1:2 verdunnen naar beneden de plaat door overdracht van 55 μL van rij A naar rij B, oplossing mengen door pipetting inhoud op en neer 5 keer en verder tot rij H. Discard de definitieve 55 μL van media zodat het eindvolume in elk goed 55 μL. Het gebruik van nieuwe tips voor elke verdunning.
      4. Maak 1:100 verdunning van het serum monsters. Zoals alle serummonsters worden vehiculumcontrolegroep in drievoud, bereiden een minimumhoeveelheid 110 μl per putje x 3 = 330 μL per test serummonster.
      5. Toevoegen van 110 μL van elk monster verdunde serum (1:100; S1 = serum 1, S2 = serum 2, enz.) overeenkomstige putjes A1 A9 en ook E1 naar E9 van de steriele 96-wells-plaat overeenkomstig Figuur 4.
      6. Voeg 55 l DMEM + pen/strep zonder FCS aan alle putjes geëtiketteerd X. uitvoeren seriële 1:2 verdunnen volgens stap 2.2.1.3 tot rij D (voor monsters 1, 2 en 3). Gooi de definitieve 55 μL van media zodat het eindvolume in elk putje 55 μL is. Ook het uitvoeren van de seriële verdunningen 1:2 voor monsters 4, 5 en 6 voor rijen E aan H.
        Opmerking: Het is belangrijk om het gebruik van nieuwe tips voor elke verdunning.
      7. Voeg 55 l DMEM + pen/strep zonder FCS putjes in de kolommen 10 en 11.
    2. Voorbereiding van virus
      1. Snel ontdooien een enkele bevroren Injectieflacon van RSV in een waterbad 37 ° C tot bijna volledig ontdooid en onmiddellijk van kracht worden op het ijs.
      2. Verdun virus in DMEM + pen/strep zonder FCS op basis van de concentratie van het monster van de RSV in stap 1.3.2 vastgesteld. Toepassing van een verdunning die ongeveer 200 PFU per putje geeft. Voorbereiden op een totaal volume van 5,5 mL (100 wells).
    3. Voorbereiding van virus-serum mengsel
      1. 55 van het verdunde virus toevoegen aan alle putjes van de kolommen 1-9 en putjes van rijen E-H van kolommen 10 en 11 (positieve controle) volgens de plaat sjabloon (Figuur 4).
      2. 55 van DMEM + pen/strep zonder FCS toevoegen aan alle putjes van rijen A-D van kolommen 10 en 11 (negatieve controle). Incubeer de plaat gedurende 1 uur bij 37 ° C, 5% CO2.
    4. Virus inoculatie naar A549 cellen
      1. Voorafgaand aan de voltooiing van de incubatietijd, ophalen A549 cell plate(s) bereid in stap 2.1.1. Zorg ervoor dat A549 cel monolayers in de 96-wells-platen ~ 80% heuvels.
      2. Media verwijderen door zachtjes plaat omkeren en licht bevlekken op steriel absorberend papier handdoek. Was alle putjes met 100 μl van PBS tweemaal, ontdoen van overtollige PBS door voorzichtig omkeren plaat en licht bevlekken op steriel absorberend papier handdoek na elke wasbeurt. Laat geen platen om te drogen.
      3. 100 berichten van het virus-serum mengsel overbrengen in de overeenkomstige putjes op de A549 cel plaat na de plaat sjabloon Incubate de plaat gedurende 1 uur bij 37 ° C, 5% CO2.
      4. Na 1 uur, met behulp van een precisiepipet, 90/goed nemen en voeg voorverwarmde 100 van 1 x M199 + 1,5% CMC + 2% FCS + pen/strep. Incubeer de plaat gedurende 3 dagen bij 37 ° C, 5% CO2.
        Opmerking: Zorg ervoor dat de oplossing voordat u toevoegt aan de platen bij 37 ° C is opgewarmd.
  3. Ontwikkeling van assay plaat en analyse (dag 5)
    1. Fixatie en assay plaat als volgt 1.3.1.1 om 1.3.1.8 te ontwikkelen.
    2. Bepalen van de titer van de neutralisatie 50%
      1. Bepaal dat de titer neutralisatie 50% door de berekening van de proportionele afstand tussen de wederzijdse serum verdunningen hierboven en minder dan 50% van de ' geen ' controleserum wells (positieve virus control - kolom 10, rijen E-H).
      2. Tel het aantal PFU (d.w.z., plaques) die voortvloeien uit individuele virale infecties in serum wells en geen serum-controleputjes. Berekenen van het gemiddelde aantal PFU van de geen serum-controleputjes en bepalen van de waarde van 50%.
      3. Identificeren van verdunningen van het serum met graven die onmiddellijk boven en onder de 50%-waarde van de geen serum-controleputjes. Met behulp van een semi-logaritmisch grafiek of werkblad sjabloon, plot het aantal PFU op de x-as (lineaire schaal) en de wederzijdse serumverdunning op de y-as (10 logschaal). Een lijn tekenen tussen de twee punten en lees de 50% neutralisatie titers van detest serummonsters van deze lijn.
        Opmerking: Het RSV PRN assay werkblad (Aanvullende werkblad) wordt gebruikt voor het bepalen van de titer van de neutralisatie 50%.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De titratie van een virus voorraad werd uitgevoerd van 1:10 tot en met 1:10 verdunning van de8 om te bepalen van de concentratie virus voorraad voorafgaand aan de PRN-assay (representatieve resultaten afgebeeld in Figuur 5). Uit Figuur 5, PFU kan worden geteld op betrouwbare wijze in verdunningen van 1:104 en 1:10-5. Het gemiddelde aantal PFU uit drievoudige putten bij de dezelfde verdunning werd ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Wij hebben ontwikkeld en geoptimaliseerd voor een eenvoudige en efficiënte RSV micro-neutralisatie assay die gemakkelijk kan worden aangepast in de meeste laboratoria. Deze test kan meten van vermogen van virale infectie, evenals het meten van de remming van de virale infectie door NAb op cellulair niveau met behulp van geautomatiseerde afbeelding scannen. Het gebruik van een imaging-gebaseerd platform en specifieke antilichaam gebaseerde systemen is toegenomen de specificiteit en de gevoeligheid voor spot detection in v...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs danken alle betrokken deelnemers. Wij erkennen de Victoriaanse regering operationele infrastructuur Support Program. PVL is een NHMRC carrière ontwikkeling Fellowship-ontvanger.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Cell line
A549ATCCCCL-185provided by Dr Keith Chappell, University of Queensland
Viral strains
RSV A2ATCCVR-1540lot number 60430286
Reagents
AcetoneMerck1000142511
Alexa-Fluor donkey anti-goat IgG (stored at 4 °C)Life TechnologiesA11055
CMC sodium salt powderSigma-AldrichC5678-500G
DMEM (no serum, 3.7 g/L NaHC, P/S) (stored at 4 °C)Scientific Services – Tissue CultureMCRI in house supply
Foetal calf Serum (stored in 50 mL aliquots at -20 °C)InterpathSFBS-F
Goat X RSV antibodyMerckAB1128
human polyclonal antiserum to respiratory syncytial virus (RSV) (stored in 45 µL aliquots at -20 °C)BEI ResourcesNR-4022Free order through BEI Resources upon registration. This serum belong to a panel of human antiserum and immune globulin to RSV (NR-32832)
M199 powderLife Technologies31100035
Milk diluent blocking solution (stored at 4 °C)Australian Biosearch50-82-01
Penicillin/Streptomycin (stored in 6mL aliquots at -20 °C)Life Technologies15140122
s.d.H2O from Milli-Q dispenserMerckIn-house dispensation
Sterile 1x PBS for culture (stored at 4 °C)Scientific Services – Tissue CultureMCRI in house supply
Tween 20 polysorbateSigma-Aldrich9005-64-5
General Consumables
Conical Falcon tubes (50 mL)Invitro TechnologiesFAL352070
Filter unit 0.22 μm (500 mL)Thermo FisherNAL5660020
Sterile Eppendorf tubes (1.5 mL)Australia PLAM12400
Sterile flat-bottom plates (96-well with lid)Interpath655180
Sterile U-bottom plates (96-well with lid)Interpath650180
5 mL serological pipetteSigma-AldrichCLS4487-200EA
10 mL serological pipetteInterpath607180
25 mL serological pipetteSigma-AldrichCLS4251-200EA
Tip Pipette 1-200 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960Fisher BiotecTF-200-L-R-S
Tip Pipette 5-20 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960Fisher BiotecTF-20-L-R-S
Tip Pipette 100-1,000 µLClear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1000Fisher BiotecTF-1000-L-R-S
Tip Pipette 1-10 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001Fisher BiotecTXLF-10-L-R-S
Equipments and softwares
ELISpot reader systemAID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany
AID ELISpot software version 5.0AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany
Microsoft Excel 2007

Referenties

  1. Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
  2. Modjarrad, K., et al. WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus Vaccine Development Report from a World Health Organization Meeting held on 23-24 March 2015. Vaccine. 34 (2), 190-197 (2016).
  3. Giersing, B. K., Karron, R. A., Vekemans, J., Kaslow, D. C., Moorthy, V. S. Meeting report: WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus (RSV) vaccine development, Geneva, 25-26 April 2016. Vaccine. , (2017).
  4. Mazur, N. I., et al. The respiratory syncytial virus vaccine landscape: lessons from the graveyard and promising candidates. Lancet Infect Diseases. 18 (10), e295-e311 (2018).
  5. Hosken, N., et al. A multi-laboratory study of diverse RSV neutralization assays indicates feasibility for harmonization with an international standard. Vaccine. 35 (23), 3082-3088 (2017).
  6. Zielinska, E., et al. Development of an improved microneutralization assay for respiratory syncytial virus by automated plaque counting using imaging analysis. Virology Journal. 2, 84(2005).
  7. van Remmerden, Y., et al. An improved respiratory syncytial virus neutralization assay based on the detection of green fluorescent protein expression and automated plaque counting. Virology Journal. 9, 253(2012).
  8. Varada, J. C., et al. A neutralization assay for respiratory syncytial virus using a quantitative PCR-based endpoint assessment. Virology Journal. 10, 195(2013).
  9. Tripp, R. A., Jorquera, P. A. Human respiratory syncytial virus: methods and protocols. , Humana Press. (2016).
  10. Suara, R. O., et al. Prevalence of neutralizing antibody to respiratory syncytial virus in sera from mothers and newborns residing in the Gambia and in The United States. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 3 (4), 477-479 (1996).
  11. McDonald, J. U., Rigsby, P., Dougall, T., Engelhardt, O. Report on the WHO collaborative study to establish the 1st International Standard for antiserum to Respiratory Syncytial Virus. , Available from: http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/260488/WHO-BS-2017.2318-eng.pdf?sequence=1&isAllowed=y (2017).
  12. Wang, J. W., et al. Measurement of neutralizing serum antibodies of patients vaccinated with human papillomavirus L1 or L2-based immunogens using furin-cleaved HPV Pseudovirions. PLoS One. 9 (7), e101576(2014).
  13. Magnus, C., Reh, L., Trkola, A. HIV-1 resistance to neutralizing antibodies: Determination of antibody concentrations leading to escape mutant evolution. Virus Research. 218, 57-70 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

RSV neutralisatieassaybeeldvormingsassayRSV subgroep ARSV subgroep Bserumverdunningbereiding van virusvoorraadplaque reductieassaygeautomatiseerde spotreadersemi logaritmische grafiekanalyse

Gerelateerde artikelen