Het meten van bot remodelleren en recreëren van de Tumor-Bone Microenvironment Met behulp van Calvaria Co-cultuur en Histomorphometrie

Samenvatting

De ex vivo cultuur van botexplants kan een waardevol instrument zijn voor de studie van de botfysiologie en de mogelijke evaluatie van geneesmiddelen bij botremodellering en botziekten. Het gepresenteerde protocol beschrijft de voorbereiding en cultuur van calvarias geïsoleerd van pasgeboren muizen schedels, evenals de toepassingen ervan.

Samenvatting

Bot is een bindweefsel gevormd uit osteoblasten, osteocyten, en osteoclasten en een gemineraliseerde extracellulaire matrix, die het zijn kracht en flexibiliteit geeft en het in staat stelt om zijn functies te vervullen. Bot wordt continu blootgesteld aan een verscheidenheid aan stimuli, die in pathologische omstandigheden botremodelleren kunnen dereguleren. Om botbiologie en ziekten te bestuderen en potentiële therapeutische middelen te evalueren, was het noodzakelijk om in vitro en in vivo modellen te ontwikkelen.

Dit manuscript beschrijft het dissectieproces en de kweekomstandigheden van calvaria's geïsoleerd van neonatale muizen om botvorming en de bottumormicroomgeving te bestuderen. In tegenstelling tot in vitro en in vivo modellen, dit ex vivo model maakt het behoud van de driedimensionale omgeving van het weefsel, evenals de cellulaire diversiteit van het bot, terwijl het kweken onder gedefinieerde omstandigheden om de gewenste micro-omgeving te simuleren. Daarom is het mogelijk om botremodellering en de mechanismen ervan te onderzoeken, evenals de interacties met andere celtypen, zoals de interacties tussen kankercellen en bot.

De testen hier gemeld gebruik calvarias van 5-7 dagen oude BALB / C muizen. De verkregen hemi-calvarias worden gekweekt in aanwezigheid van insuline, borstkankercellen (MDA-MB-231), of geconditioneerd medium uit borstkankercelculturen. Na analyse werd vastgesteld dat insuline nieuwe botvorming veroorzaakte, terwijl kankercellen en hun geconditioneerde medium geïnduceerde botresorptie. Het calvariële model is met succes gebruikt in fundamenteel en toegepast onderzoek om botontwikkeling en door kanker veroorzaakte botziekten te bestuderen. Kortom, het is een uitstekende optie voor een eenvoudige, informatieve en low-cost test.

Inleiding

Bot is een dynamisch bindweefsel dat verschillende functies heeft, waaronder het ondersteunen van de spieren, het beschermen van de inwendige organen en beenmerg, en het opslaan en vrijgeven van calcium en groeifactoren^1,2. Om zijn integriteit en de juiste functie te behouden, botweefsel is voortdurend onder het proces van remodelleren. In het algemeen kan een cyclus van botremodelleren worden onderverdeeld in botresorptie en botvorming¹. Een onbalans tussen deze twee fasen van botremodelleren kan leiden tot de ontwikkeling van botpathologieën. Ook ziekten zoals borstkanker beïnvloeden vaak de integriteit van het bot; ongeveer 70% van de patiënten in vergevorderde stadia hebben of zullen botmetastasen hebben. Wanneer borstkankercellen de botten binnenkomen, beïnvloeden ze het botmetabolisme, wat resulteert in overmatige resorptie (osteoclastische laesies) en/of vorming (osteoblastische laesies)³.

Om de biologie van botziekten te begrijpen en nieuwe behandelingen te ontwikkelen, is het noodzakelijk om de mechanismen te begrijpen die betrokken zijn bij botremodellering. In kankeronderzoek is het essentieel om het botmetastaseproces en de relatie tot de uitgezaaide micro-omgeving te onderzoeken. In 1889 veronderstelde Stephen Paget dat metastasen optreden wanneer er compatibiliteit is tussen de tumorcellen en het doelweefsel, en suggereerde dat de uitgezaaide site afhangt van de affiniteit van de tumor voor de micro-omgeving⁴. In 1997 introduceerden Mundy en Guise het concept van de "vicieuze cirkel van botmetastasen" om uit te leggen hoe tumorcellen de botmicroomgeving wijzigen om hun overleving en groei te bereiken, en hoe de botmicroomgeving hun groei bevordert door calcium- en groeifactoren^5,6,7te verstrekken .

Om de mechanismen te karakteriseren die betrokken zijn bij botremodelleren en botmetastase en om moleculen met mogelijk therapeutisch potentieel te evalueren, is het noodzakelijk geweest om in vitro en in vivo modellen te ontwikkelen. Deze modellen bieden momenteel echter vele beperkingen, zoals de vereenvoudigde weergave van de botmicroomgeving, en de kosten^8,9. De cultuur van botexplants ex vivo heeft het voordeel dat de driedimensionale organisatie en de diversiteit van botcellen behouden blijven. Bovendien kunnen de experimentele omstandigheden worden gecontroleerd. De explant modellen omvatten de cultuur van middenvoetsbeentje botten, dijbeenhoofden, calvarias, en mandibulaire of trabecular kernen¹⁰. De voordelen van de ex vivo modellen zijn aangetoond in diverse studies. In 2009 meldden Nordstrand en medewerkers de oprichting van een cocultuurmodel op basis van de interacties tussen bot- en prostaatkankercellen¹¹. Ook, in 2012, Curtin en medewerkers gemeld de ontwikkeling van een driedimensionaal model met behulp van ex vivo cocultures¹². Het doel van dergelijke ex vivo modellen is om de omstandigheden van de botmicroomgeving zo nauwkeurig mogelijk te recreëren om de mechanismen te kunnen karakteriseren die betrokken zijn bij normale of pathologische botremodelleren en de werkzaamheid van nieuwe therapeutische middelen te evalueren.

Het huidige protocol is gebaseerd op de procedures gepubliceerd door Garrett¹³ en Mohammad et al.¹⁴. Neonatale muis calvaria culturen zijn gebruikt als een experimenteel model, omdat ze de driedimensionale architectuur van het bot in ontwikkeling en botcellen behouden, met inbegrip van cellen in alle stadia van differentiatie (dat wil zeggen, osteoblasten, osteoclasten, osteocyten, stromalcellen) die leiden tot volwassen osteoclasten en osteoblasten, evenals de gemineraliseerde matrix¹⁴. Het ex vivo-model vertegenwoordigt niet volledig het pathologische proces van botziekten. Echter, effecten op bot remodelleren of kanker-geïnduceerde bot osteolyse kan nauwkeurig worden gemeten.

Kortom, dit protocol bestaat uit de volgende stappen: de dissectie van calvarias van 5-7 dagen oude muizen, calvaria precultuur, calvaria cultuur toepassingen (bijv. cultuur in aanwezigheid van insuline, kankercellen of geconditioneerd medium, en zelfs agenten met therapeutisch potentieel, volgens het doel van het onderzoek), botfixatie en calvaria ontkalking, weefselverwerking, histologische analyse en resultaatinterpretatie.

Protocol

Alle muizen die in deze testen werden gebruikt, werden verkregen uit BALB/c muizenstammen, waarbij mannelijke en vrouwelijke muizen lukraak werden gebruikt. Eerdere cultuurexperimenten zijn ook uitgevoerd met andere stammen, zoals FVB, Zwitserse muizen, CD-1 en CsA muizen^11,12,14. Alle muizen werden ondergebracht volgens de richtlijnen van het National Institutes of Health (NIH), Appendix Q. Procedures met betrekking tot proefpersonen zijn goedgekeurd door de Institutional Animals Care and Use Committee (IACUC) van het Center for Scientific Research and Higher Education in Ensenada (CICESE).

1. Calvarial dissectie

1. Sterilisatie dissectie-instrumenten (bijvoorbeeld 1 x 2 tandenweefseltangen, rechte chirurgische schaar, ontleden schaar, fijn getipte pincet, fijne gebogen tip ontleden tangen, ontleden tangen, scalpel). Steriel gedestilleerd water kan worden gebruikt om de chirurgische gereedschappen tussen elke dissectie schoon te maken, en steriele 1x PBS kan worden gebruikt voor het reinigen van elke hemi-calvaria.
2. Plaats de steriele dissectie-instrumenten, water, 1x PBS en benodigde materialen om de procedure uit te voeren (bijvoorbeeld micropipetten, neerslaande glazen, steriele petrischalen) in een laminaire stroomkap.
   OPMERKING: Voer de hele procedure uit onder steriele omstandigheden.
3. Voeg 12 mL steriele 1x PBS toe in twee 10 cm petrischaaltjes.
4. Selecteer de pups en plaats ze in de buurt van de kap.
   LET OP: Ontleed de calvarias van 5-7 dagen oude pups.
5. Kies en houd de muis voorzichtig met behulp van ontleden tangen.
6. Onthoofd de muis met behulp van ontleden schaar en plaats het hoofd in een petrischaaltje met PBS.
   LET OP: Onthoofding is niet geschikt voor oudere muizen. Als het experiment moet worden gedaan met oudere muizen, moet de methode van euthanasie worden aangepast volgens de regels voor dierproeven.
7. Houd het hoofd stevig bij het neusgebied met 1 x 2 tandenweefsel tangen en verwijder de huid over de schedel totdat de calvaria zichtbaar is.
8. Identificeer de hechtingen (d.w.z. sagittale, coronale en lambdoïde stoffen) van de schedel op de blootgestelde calvaria.
9. Doordringen met de punt van de microschaar ongeveer 2 mm achter de lambdoïde hechting en maak een rechte snede ernaast.
10. Plaats de punt van de microschaar aan de achterzijde van de schedel. Maak een rechte snede langs de distale kant van de lambdoïde hechting naar de coronale hechting. Ga zo ook met de andere lambdoïde hechting.
11. Maak nog een snede (onder een hoek van 45°) om het uiteinde van de snede gemaakt aan te sluiten met de snede van de voorste fontanel.
12. Herhaal stap 1.10 en 1.11 met de andere lambdoïdenhechting.
    OPMERKING: Het is belangrijk om de hechtingen te identificeren om passende bezuinigingen te maken en om adequate inbedding en data-analyse uit te voeren.
13. Gebruik fijnpunttangen om de calvaria te verwijderen en in een petrischaaltje te plaatsen. Met een scalpel, maak een rechte snede van de achterste fontanel langs de sagittale hechting door de coronale hechting en eindigend in de voorste fontanel om twee hemi-calvarias te verkrijgen.
14. Pak elk van de hemi-calvarias met de fijn-getipt ecet en plaats ze in een nieuwe Petri schotel met PBS.

2. Calvaria cultuur

1. Voeg 1 mL hoogglucose DMEM medium aangevuld met 0,1% runderserum albumine (BSA) en 1% antibioticum /antimycotisch (d.w.z. penicilline en streptomycine) in de putten van een 24 putplaat. Met fijne-tip tangen, pick-up elke hemi-calvaria en plaats het in een put.
   LET OP: Zet de hemi-calvarias concave kant naar beneden.
2. Incubeer de hemi-calvaria's voor 24 uur bij 37 °C met 5% CO₂.
3. Verwijder het kweekmedium uit elke put en voeg 1 mL verse media toe die de verbinding bevatten om media uit andere cellen te testen of geconditioneerd te worden.
   OPMERKING: Gebruik ten minste drie hemi-calvaria's voor elke behandelingsgroep en gebruik negatieve en positieve controles.
4. Incubeer de hemi-calvarias gedurende 7 dagen, het veranderen van de media om de 2-3 dagen.

3. Cultuur met kankercellen

1. Selecteer een petrischaaltje met kankercellen bij 80-90% samenvloeiing en trypsinize hen. Om te proberen, was de kankercellen 1x met BEHULP VAN PBS (5 mL per 75 cm² kolf), gevolgd door incubatie in een HBSS-oplossing met 0,05% trypsine en 0,53 mM EDTA (2 mL per 75 cm² kolf).
2. Breng de celvering over in een conische buis van 15 mL en centrifuge op 800 x g voor 5 min bij kamertemperatuur (RT).
3. Verwijder en gooi de supernatant weg.
4. Resuspend de pellet in 2 mL DMEM met 2% foetaal runderserum (FBS) en 1% antibioticum/antimycotisch. Tel levende cellen.
5. Wijs hemi-calvaria's toe aan elke studiegroep (d.w.z. de negatieve controle- en cocultuurgroep voor RNA- of histologieanalyse).
6. Verwijder de kweekmedia uit de hemi-calvarias en voeg 1 mL DMEM toe met 2% FBS en 1% antibioticum/antimycotisch aangevuld of niet aangevuld met kankercellen.
   OPMERKING: De hoeveelheid cellen die u wilt toevoegen, kan veranderen afhankelijk van de geteste cellijn. Met kankercellen zoals MDA-MB-231 of PC-3, werken 500.000 cellen per goed gepast.
7. Incubeer voor 24 uur bij 37 °C met 5% CO₂. Geef elke hemi-calvaria door aan een nieuwe bron om alleen kankercellen te behouden die zich aan het botweefsel hebben gehecht.
8. Incubeer gedurende 7 dagen bij 37 °C met 5% CO₂ en verander de media elke 2-3 dagen.

4. Fixatie

1. Snijd vierkantjes tissuepapier om de hemi-calvarias te wikkelen.
   OPMERKING: Biopsie schuimpads of stalen capsules voor kleine biopten kunnen ook worden gebruikt.
2. Gebruik rechte fijne-tip tangen op te halen elke hemi-calvaria uit de sagittale hechting, plaats op een tissue papier, en wrap.
3. Plaats de verpakte hemi-calvaria in een gelabelde inbeddingscassette.
4. Plaats de cassette in een container met 10% fosfaatgebufferde formaline.
5. Fix for 24 h bij 4 °C.

5. Ontkalking

1. Verwijder de formaline, voeg 1x PBS toe en roer de weefsels gedurende 30 min om de hemi-calvaria's te spoelen.
2. Verwijder de PBS en voeg 10% EDTA (pH = 8, 0,34 M) toe.
   OPMERKING: Controleer of de oplossing de weefsels volledig bedekt.
3. Ontkalk de weefsels gedurende 48 uur bij 4 °C.
4. Gooi de EDTA-oplossing weg en voeg 1x PBS toe om het weefsel te spoelen.
5. Bewaar de hemi-calvarias in 70% ethanol tot de histologieverwerking.

6. Weefselverwerking

1. Dehydrateer de weefsels met rondes van 96% ethanol, 60 min (3x), gevolgd door 100% ethanol, 60 min (3x).
2. Vervang de ethanol door 100% xyleen, 60 min (3x).
3. Incubeer de cassettes in paraffine was, 60 min (2x).

7. Insluiten

1. Open de cassettes, verwijder voorzichtig het tissuepapier en pak de calvaria uit.
2. Pak elke calvaria zorgvuldig op en stapel alle hemi-calvaria's uit dezelfde groep in dezelfde oriëntatie.
3. Doe wat paraffine in een mal.
4. Pak alle hemi-calvarias met de tangen en plaats ze in de mal met de sagittale hechting naar beneden naar de basis van de mal.
   OPMERKING: Oriëntatie van de hemi-calvarias in de mal tijdens de opname is van cruciaal belang om consistente histologische secties en reproduceerbare resultaten te verkrijgen, omdat deze oriëntatie achterste identificatie van de voorste en pariëtale botten van de calvarias mogelijk zal maken en de coronale hechting die de kwantitatieve beoordeling vergemakkelijkt.
5. Laat de tangen los en controleer of de hemi-calvarias op hun plaats blijven.
6. Plaats de gelabelde cassette op de top van de mal en vul het met meer paraffine om de hemi-calvarias te dekken.
7. Verplaats de mallen naar het koude oppervlak.

8. Sectie

1. Trim 500-600 μm van de sagittale hechting met de microtoom.
2. Snijd 4 μm dikke secties, en verzamel de benodigde secties.
3. Trim nog eens 300 μm.
4. Snijd en verzamel nog eens zes 4 μm dikke secties.
5. Snijd het blok 300 μm verder en verzamel meer secties.
6. Monteer de secties op glazen microscoopdia's.
7. Droog de glijbanen bij RT.

9. Kleuring

1. Dompel de secties 3 min onder in 100% xyleen.
2. Dompel 100% ethanol onder in 1 min.
3. Voeg samen in 96% ethanol voor 1 min.
4. Dompel in 80% ethanol voor 1 min.
5. Dompel onder in 70% ethanol voor 1 min.
6. Spoel in water gedurende 3 min.
7. Dompel 3 min onder in hematoxyline.
8. Spoel in water tot de sectie helder is.
9. Dompel gedurende 10 sec onder in een verzadigde lithiumcarbonaatoplossing.
10. Spoel in water gedurende 3 min.
11. Dompel 96% ethanol onder voor 1 min.
12. Dompel gedurende 3 min onder in eosin.
13. Dompel 96% ethanol onder gedurende 1 min.
14. Dompel 100% ethanol onder in 1 min.
15. Dompel onder in 100% xyleen gedurende 3 min.
16. Voeg wat per montagemedium toe aan de glijbaan en bescherm deze met een coverslip.
    OPMERKING: U de hematoxyline en eosine (H&E) kleuring aanvullen met tartrate-resistente zuurfosfatase (TRAP) kleuring om osteoclast en osteolyse te evalueren.

10. Kwantitatieve beoordeling: bepalingsgebied voor analyse

1. Bestudeer de secties onder laag vermogen (d.w.z. 4x) om de oriëntatie en de hechtingen te identificeren.
2. Definieer de coronale hechting en identificeer het lange botoppervlak aan de ene kant en het korte oppervlak aan de andere kant.
3. Identificeer de coronale hechting onder 40x vergroting en verplaats twee of drie optische velden weg van de hechting langs het lange oppervlak. Leg beelden van dit gebied vast voor analyse.
4. Definieer het oude botgebied en het nieuwe botgebied. De eosin Y met oranje G vlekken het oude bot donkerder en de nieuwe bot lichter.
5. Meet het totale botgebied van het oude en nieuwe bot met Image J-software met behulp van het gereedschap kleurdrempel. Druk de resultaten uit als μm².

11. Gegevensanalyse

1. Analyseer de resultaten met behulp van statistische software. Significante verschillen tussen groepen kunnen worden bepaald aan de hand van passende tests (bijvoorbeeld niet-parametrische Mann-Whitney U-test zoals hier wordt gedaan).

Resultaten

Om botvorming in het calvariële model te evalueren, cultiveerden we de hemi-calvaria's in media met of zonder 50 μg/mL insuline. Weefselsecties werden bereid en bevlekt met H&E. In deze omstandigheden toonde de histologie aan dat de structurele integriteit van het calvariale bot werd gehandhaafd, waardoor de verschillende componenten ervan kunnen worden geïdentificeerd (figuur 1). De calvarias behandeld met insuline presenteerde een toename van de hoeveelheid...

Discussie

Hier beschrijven we het protocol voor een calvarial ex vivo model om botvorming of resorptie te evalueren en om de interacties van kankercellen met calvarial muisbot te bestuderen. De kritieke stappen van deze techniek zijn de dissectie, cultuur, inbedding en histomorfoalanalyse van de calvaria's. Tijdens de dissectie van de calvarias is het cruciaal om de hemi-calvaria's in een trapezium te snijden, omdat het de oriëntatie tijdens de paraffineopname sterk zal vergemakkelijken. Bij het bestuderen van kankercel i...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
24 well cell culture	Corning	CLS3524
24 well non tissue culture	Falcon	15705-060
2 mL cryovial	SSI	2341-S0S
Antibiotics-Antimycotic	Corning	30-004-CI
BSA	Biowest	P6154-100GR
Centrifugue	Eppendorf	22628188	Centrifuge 5810R
Coverslips	Corning	2935-24X50
Cytoseal resin	Richard Allen	8310-10
DMSO		D2650-100ML
Dulbecco's Modification of Eagles Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate	Corning	10-017-CV
Dulbecco's PBS (10X)	Corning	20-031-CV
Ebedding Cassettes	Sigma	Z672122-500EA
EDTA	Golden	26400
Embedding Workstation	Thermo Scientific	A81000001
Eosin	Golden	60600
Ethanol absolute	JALMEK	E5325-17P
Fetal Bovine Serum	Biowest	BIO-S1650-500
Filters	Corning	CLS431229
Forceps and scissors	LANCETA HG	74165
Formalin buffered 10%	Sigma	HT501320
Glass slides 25 x 75 mm	Premiere	9105
Harris's Hematoxylin	Jalmek	SH025-13
High profile blades	Thermo Scientific	1001259
Histoquinet	Thermo Scientific	813150	STP 120
Insulin from bovine pancreas	Sigma	16634
Microscope	ZEISS	Axio Scope.A1
Microtome	Thermo Scientific	905200	MICROM HM 355S
Mouse food, 18% prot, 2018S	Harlan	T.2018S.15
Neubauer	VWR	631-0696
Orange G	Biobasic	OB0674-25G
Paraffin	Paraplast	39601006
Paraffin Section Flotation Bath	Electrothermal	MH8517X1
Petri dish	Corning	CLS430167
Phloxin B	Probiotek	166-02072
Trypan Blue	Sigma	T8154
Trypsin-EDTA	Corning	25-051-CI
Wax dispenser	Electrothermal	MH8523BX1
Xylene	Golden	534056-500ML