Volledig autonoom karakterisering en het verzamelen van gegevens van kristallen van biologische macromoleculen

Summary

Hier beschrijven we hoe het gebruik van de geautomatiseerde screening en mailopties voor gegevens verzamelen beschikbaar op sommige synchrotron straallijnen. Wetenschappers verzenden de synchrotron, cryocooled monsters en de diffractie eigenschappen worden gescreend, de verzamelingen gegevens worden verzameld en verwerkt en, waar mogelijk, de oplossing van een structuur wordt uitgevoerd — allemaal zonder menselijke tussenkomst.

Abstract

Hoog-glans X-ray balken gekoppeld aan automatisering hebben geleid tot het gebruik van de straallijnen synchrotron gebaseerde macromoleculaire röntgendiffractie (MX) voor zelfs de meest uitdagende projecten in de structurele biologie. Meeste faciliteiten vereisen echter nog steeds de aanwezigheid van een wetenschapper ter plaatse uit te voeren van de experimenten. Een nieuwe generatie van geautomatiseerde straallijnen gewijd aan de volautomatische karakterisering van, en het verzamelen van gegevens uit kristallen van biologische macromoleculen is onlangs ontwikkeld. Deze straallijnen vertegenwoordigen een nieuw instrument voor structurele biologen op het scherm van de resultaten van de eerste kristallisatie proeven en/of de collectie van grote aantallen diffractie datasets, zonder gebruikers hebben om te controleren de beamline zelf. Hier laten we zien hoe u een experiment voor automatische screening en het verzamelen van gegevens, hoe een experiment wordt uitgevoerd bij de beamline, hoe is de resulterende gegevenssets worden verwerkt, en hoe, indien mogelijk, de kristalstructuur van de biologische macromolecule is opgelost.

Introduction

Bepaling van de driedimensionale structuur van specifieke proteïnen is van cruciaal belang in de biologie. De informatie die is afgeleid van doen zo werpt licht op de biologische functie en over de vorm en de specificiteit van actieve en/of bindende sites opgenomen in het molecuul onder studie. In veel gevallen, hierdoor mechanismen voor actie worden vastgesteld of, in voorkomend geval, potentiële therapeutische moleculen worden ontwikkeld. MX is de techniek die het meest gebruikt om structurele informatie te verkrijgen, maar een knelpunt is de bepaling van de optimale voorwaarden voor het verkrijgen van goed diffracting kristallen. Daarom, kristallisatie proeven zijn uitgevoerd in vele verschillende omstandigheden en worden vervolgens gescreend, om te zoeken naar de beste kristallen moet worden gebruikt voor het verzamelen van de gegevens van diffractie. De automatisering van de installatie van kristallisatie proeven¹ heeft in dit opzicht duidelijk geholpen. Echter worden de volgende stappen (dat wil zeggen, crystal montage diffractie screening en verzamelen van de gegevens van de diffractie) meestal uitgevoerd handmatig toegang tot een hoop tijd, inspanning en middelen. De automatisering van diffractie screening en gegevensverzameling zou dus betekenen een enorme tijdwinst en efficiëntie.

Diffractie screening en gegevensverzameling in MX wordt meestal uitgevoerd op synchrotron MX straallijnen waartegen automatisering grotendeels dit proces vergemakkelijkt heeft. In de meeste gevallen is het echter nodig zijn voor de wetenschapper aanwezig te zijn bij de beamline tijdens een experiment of om hem te bedienen op afstand. Een nieuwe generatie van volledig geautomatiseerde MX straallijnen heeft onlangs ontwikkelde². Gebruikers hoeven hier niet aanwezig te zijn, hetzij fysiek of op afstand, tijdens een experimentele sessie. Hierdoor kunnen wetenschappers meer tijd te besteden aan minder routinetaken, in plaats van de uitgaven hele dagen, en vaak nachten, screening kristallen en verzamelen gegevens van diffractie. werelds eerste volledig geautomatiseerde beamline is de massaal geautomatiseerde Sample selectie geïntegreerde faciliteit (massief-1, ID30A-1)^2,3 op de Europese Synchrotron Radiation Facility (ESRF). Het heeft een unieke sample-omgeving waarin een hoge capaciteit monster-bevattende dewar opereert in tandem met een robot monster-wisselaar die ook als de beamline de goniometer^{4,5 fungeert}. MASSIEF-1 is een undulator beamline uitgerust met een single-photon-tellen hybride pixel detector⁶, die bij een vaste golflengte van 0.969 werkt Å (12,84 keV) met een intense X-ray-balk (2 x 10¹² fotonen/s). De grootte van de straal op de positie van het monster kan aangepast worden tussen een minimum van 10 µm (ronde lichtbundel) tot een maximum van 100 µm x 65 µm (horizontaal door de grootte van de verticale balk). Gemiddeld, kan het beamline proces, in een volledig automatische mode (zie hieronder), 120 kristallen in 24 h. De werking van de beamline is gebaseerd op een reeks van werkstromen⁷, die elk intelligente besluiten op basis van de uitkomsten van voorgaande stappen in de workflow neemt, om ervoor te zorgen de meting van de best mogelijke gegevens uit de steekproef in onderzoek. Met name de evaluatie van de diffractie kenmerken van een afzonderlijke monster houdt rekening crystal volume en flux en zorgt ervoor dat, waar het kristal is groter dan de X-ray-balk, dat alleen de beste regio van het kristal wordt gebruikt voor latere data collectie. Diffractie datasets zijn, dus, geoptimaliseerd voor maximale resolutie met geminimaliseerde straling schade^2,3. Veeleisende gegevens verzameling protocollen, zoals pseudo-spiraalantennes (multi-positie) data collectie strategieën voor de gegevensverzameling van zowel inheemse en één golflengte abnormale diffractie (SAD), zijn ook beschikbaar⁸.

Volledig automatische experimenten op massief-1 betrekken cryocooling en montage van de kristallen op een magnetische monster mount geschikt voor de gewenste beamline apparatuur standaard stiften WERVELKOLOM⁹, invoeren van de gewenste experimentele parameters in de ' diffractie plan' tabel in het geïntegreerd systeem voor eiwit kristallografie straallijnen (ISPyB)¹⁰, een web-gebaseerd informatie managementsysteem voor MX experimenten, en verzenden van de monsters naar de beamline. Op de ESRF, alle kosten van het transport van de monsters naar/van de beamline worden ondersteund door het Bureau van de gebruiker ESRF (Zie de website van het ESRF¹¹ voor meer informatie). MASSIEF-1, zijn geen beperkingen op de grootte van de lus of crystal kwaliteit. Bij het kiezen van een diffractie-plan voor een bepaald kristal, de gebruiker kan standaardinstellingen gebruiken of kiezen uit specifieke werkstromen, die kunnen worden aangepast voor elk monster. Diverse voorgeprogrammeerde werkstromen zijn beschikbaar. In de MXPressE³ workflow, wordt de lus monster-bevattende eerst uitgelijnd met de positie van de monster met behulp van optische centreren. Vervolgens, X-Vleug gebaseerde centreren zorgt ervoor dat de beste regio van het kristal is gecentreerd op de X-ray-balk. Data collectie strategieën worden vervolgens berekend met behulp van eEDNA, een kader voor de ontwikkeling van plugin gebaseerde toepassingen vooral voor online data-analyse in het veld X-ray experimenten rekening account crystal volume en de real-time flux op de beamline. Dit wordt vervolgens verwerkt met behulp van een reeks van automatische gegevensverwerking pijpleidingen¹² na de inzameling van de gegevensset van een volledige diffractie, en de resultaten zijn beschikbaar gesteld voor inspectie en download in ISPyB. De workflow van de³ MXPressE SADis gericht op selenomethionine-bevattende kristallen van het target-eiwit en exploiteert het feit dat de operationele energie van massief-1 net boven de rand van de Se K is. Hier, de MXPressE eEDNA gegevens collectie strategie is geoptimaliseerd voor triest gegevensverzameling (dat wil zeggen, hoge redundantie, en met de resolutie ingesteld op waar de R_samenvoegen tussen Bijvoet paren minder dan 5 is %). Om het scherm van de eigenschappen van de diffractie van een reeks van kristallen zonder verdere gegevensverzameling, kan de MXScore³ -werkstroom worden gebruikt voor de productie van een volledige kwaliteitsbeoordeling van de kristallen geanalyseerd. In de MXPressI³ workflow, 180 ° rotatie gegevens verzameld behulp van 0,2 ° oscillaties en de beginhoek van phi en de resolutie die bepaald door een strategie van de eEDNA. MXPressO ³ bevat een preobserved resolutie in de workflow (standaard: d_min = 2 Å). Om een eerste evaluatie van de kristallen die voortvloeien uit een kristallisatie proces, wordt de MXPressM³ -werkstroom aangeboden. Dit voert een hoge dosis net scannen via de breedste stand van monster ondersteuning met geen gegevensverzameling of centreren. Onlangs zijn twee nieuwe experiment workflows, MXPressP en MXPressP_SAD, die pseudohelical gegevensverzamelingen vervullen, geïmplementeerde⁸geweest. De uitvoering van alle maatregelen in alle workflows online en in realtime kan worden gevolgd door de gebruiker, via ISPyB.

Hier laten we zien hoe voor te bereiden van een volledig geautomatiseerde MX-experiment op massief-1 en hoe u kunt ophalen en analyseren van gegevens als gevolg van het experiment. Als voorbeeld gebruiken we menselijke mitochondriale glycine decollete systeem eiwit H (GCSH). Deze lipoic acid-bevattende eiwitten is onderdeel van het glycine decollete systeem verantwoordelijk voor de afbraak van glycine. Dit systeem verder omvat het P-eiwit, een pyridoxal fosfaat-afhankelijke glycine decarboxylase, de T-eiwit, een enzym tetrahydrofolate-eisen en de L-proteïne, een lipoamide-dehydrogenase. GCSH brengt de groep methylamine glycine uit de P-eiwitten naar de T-eiwit. Defecten in het H-eiwit zijn de oorzaak van nonketotic hyperglycinemia (NKH) in mens¹³.

Protocol

Opmerking: De productie, zuivering en kristallisatie van GCSH worden beschreven in aanvullende bestand 1.

1. korte beschrijving van de off line voorbereiding en crystal montage

1. Standpunt een nylon lus of een andere crystal montage steun al bevestigd aan een pin van de WERVELKOLOM onder een of meer kristallen en hen te bevrijden van de neerslag oplossing (20 µL van 0,5 M natriumhydroxide formate pH 4.0 + 25 µL van eiwit oplossing).
   1. Verwijder de bulk vloeistof rond de crystal(s) door het aanraken van de zware montering met een papier-wick te zuigen uit alle overtollige vocht.
2. Geniet van de crystal(s) in de oplossing van de cryoprotective met de neerslag oplossing plus 30% glycerol; Verwijder vervolgens de crystal steun én de crystal(s).
   1. Verwijder de bulk vloeistof rond de crystal(s) door het aanraken van de zware montering met een papier-wick te zuigen uit alle overtollige vocht.
3. Duik van de berg in een flesje van de WERVELKOLOM gevuld met vloeibare stikstof en op te slaan, samen met eventuele andere kristallen die op dezelfde manier bereid, in een Europees laboratorium voor moleculaire biologie (EMBL) / ESRF sample wisselaar puck⁹ bij temperatuur van vloeibare stikstof.
   Opmerking: De crystal(s) zijn stabiel in deze toestand tot het beamtime beschikbaar is.

2. beamtime op massief-1 opvragen

1. Aanvragen beamtime zo spoedig mogelijk op de startpagina van de ESRF (op http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying).
   Opmerking: Er zijn een aantal mogelijke toestanden van de toegang tot de straallijnen ESRF MX. Laboratoria kunnen toepassen collectief als onderdeel van een blok toewijzing groep (zak), dat beamtime toegewezen voor 2 jaar. Als groepen individueel van toepassing wilt, kunnen zij toepassen voor het rollen van toegang, die hen in staat snel toegang tot de straallijnen na "peer review stelt". Voorstel van de Fractie van zal worden herzien en goedgekeurd door de ESRF veiligheidsgroep die aanvullende gegevens verzoeken. Indien het voorstel wordt aangenomen, zal een experiment nummer en paswoord worden meegedeeld. Eigen onderzoek kan worden uitgevoerd door de aankoop van beamtime.
2. Vul de vereiste veiligheid online opleiding (op http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/SafetyTraining).
3. Boek beamtime op de kalender van massief-1.
   Opmerking: Het is mogelijk om te boeken omhoog tot een maximum van 50 monster houders te analyseren per werkperiode.
4. Vul in de A-poot te verklaren van een post-in experiment (http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form), samen met de vereiste veiligheidsinformatie, voor de monsters die dienen te worden gemeten.

3. het creëren van een plan voor diffractie in ISPyB

Opmerking: Het diffractie-plan bevat alle informatie die nodig is voor een steekproef in ISPyB en aanvullende informatie die u op maat van het experiment uitgevoerd voor elk monster kan bevatten.

1. Open ISPyB (op https://exi.esrf.fr/).
2. Kies MX experimenten.
3. Meld u aan met het experiment nummer en wachtwoord.
4. Klik op verzending | Nieuwe toevoegen en de nodige gegevens verstrekken. Klik op Opslaan.
5. Klik op Add perceel en vul de gevraagde informatie. Klik op Opslaan.
6. Klik vervolgens op toevoegen container, geven de puck streepjescode als de naam en kies WERVELKOLOM puck. Klik op Opslaan.
7. Klik op de container symbool en bewerken, en vul de nodige informatie, zoals de naam van het eiwit, voorkeur werkstroom, crystal positie in de puck, enz., betreffende de monsters.
8. Kies het eiwit (bijvoorbeeld GCSH of lysozym) dat is goedgekeurd door de groep van de veiligheid ESRF.
9. Geef een unieke sample identificeren van elke individuele monster. Het is mogelijk om eventueel de pin barcode scannen. De rest van de onderstaande informatie is optioneel.
10. Geef de optionele gegevens.
    1. Voor elke individuele monster, voert u het type experiment (dat wil zeggen, MXPressE_SAD, SCORE, of MXPressO, enz., standaard MXPressE) onder Exp. Type. Dit bepaalt welke automatische workflow zal worden gebruikt voor het verwerken van elke crystal. Gezien het feit dat de GCSH kristallen naalden zijn, kies MXPressP.
    2. Voer een ruimtegroep (bijvoorbeeld C2, P1 en P2₁2₁2₁), indien bekend. Indien aanwezig, zal deze worden gebruikt voor gegevensberekeningen collectie strategie en door de automatische gegevensverwerkende pijpleidingen beschikbaar.
    3. Voert u de gewenste resolutie (standaard: d_min 2.0 Å =). Dit bepaalt de afstand van de crystal-naar-detector voor de initiële mesh scans, karakterisering en verzamelen van de gegevens van de standaard.
    4. Stel de gewenste drempel resolutie (bijvoorbeeld 1,5 Å of 2.3Å), om te voorkomen dat de collectie van volledige datasets van kristallen die niet aan deze limiet doen diffract. Dit kan sneller gegevens opslag ruimte en analyse.
    5. De vereiste volledigheid instellen (standaard: 0.99). De vereiste multipliciteit instellen (standaard: 4). als meer dan één crystal is opgenomen op de steun van het monster, stelt het maximum aantal kristallen te analyseren. De standaardwaarde is 1 of 5 voor MXPressP.
    6. Selecteer de juiste lichtbundel formaat (standaard: 50 µm). Als een specifieke waarde is niet is geselecteerd, zal de X-Vleug-centreren en gegevensberekeningen collectie strategie worden uitgevoerd met de grootte van een straal van 50 µm.
       Opmerking: Tijdens de daaropvolgende verzameling van volledige datasets, de grootte van de bundel zal worden automatisch aangepast.
    7. Zet in de ruimtegroep, indien bekend, in de kolom ' groep ' gedwongen ruimte. Stel de straling-gevoeligheid van de kristallen (0,5 – 2,0 voor lage tot hoge gevoeligheid, met een standaardwaarde van 1).
11. Indien gewenst, de totale rotatiehoek te worden verzameld voor de volledige dataset-collectie instellen (standaard: de totale rotatiehoek bepaald door eEDNA).
12. De waarden opslaan. Klik op terug naar zendingen. Druk op de verzending naar ESRF verzenden.
13. Het verzendlabel afdrukken en verzenden van de monsters. Gebruikers moeten een pick-up regelen met een koerier, gebruik van het ESRF accountgegevens.
    Opmerking: Het is zeer belangrijk om te selecteren opnemen retour label om de naadloze terugkeer van monsters (zie https://www.esrf.eu/MXDewarReimbursement).

4. gegevens verzamelen, weergeven en ophalen

Opmerking: Op de dag van het experiment, monsters worden overgebracht naar de massief-1 hoge capaciteit Dewar (HCD). Beamline wetenschappers dan lancering het verzamelen van gegevens, die door gebruikers op afstand kan worden gevolgd. Voor elk type verschillende Monster ontvangen gebruikers een e-mail hen te informeren dat de gegevensverzameling is begonnen. Zoals eerder opgemerkt, de uitvoering van alle maatregelen in alle workflows online en in realtime kan worden gevolgd door de gebruiker via ISPyB, waaruit de resultaten kunnen worden bekeken en gedownload.

1. Voor elk monster geanalyseerd, bekijkt u de resultaten van de automatische experiment in ISPyB (https://exi.esrf.fr/).
   1. Log in, met behulp van het experiment aantal en wachtwoord, en klik op de gewenste experimentele sessie op ID30A-1.
   2. Selecteer de voorkeur (top-scoren) autoprocessing pijpleiding (bijvoorbeeld granaten of XDS_APP) en het downloaden van de gegevens in de juiste ruimtegroep met de hoogste volledigheid en hoogste resolutie heeft uitgeschreven door te klikken op de Laatste resultaten van het verzamelen en, vervolgens, downloaden.
      Opmerking: Alle mesh-, lijn- en karakterisering afbeeldingen zijn in een submap voor elk monster, genaamd /MXPressE_01. De ESRF loopt automatisch vijf afzonderlijk te verwerken pakketten, namelijk EDNA_proc¹², granaten¹², XDS_APP¹⁴, autoPROC¹⁵en¹⁶van de XIA2. Data-integratie is gebaseerd op XDS, met uitzondering van XIA2, die is gebaseerd op de WIJZERPLATEN. Alle pakketten worden ook uitgevoerd in abnormaal en nonanomalous modi, waardoor de automatische detectie van een anomalie signaal, indien aanwezig in de gegevens, in SAD geleidelijke protocollen moeten worden gebruikt. Elk pakket maakt gebruik van verschillende parameters en beslissingsstructuren, wat betekent dat sommige pakketten beter met bepaalde steekproeven uitgevoerd. Echter kan dit zorgen voor een groot aantal resultaten wanneer het aantal pakketten en mogelijke ruimte groepen wordt administratief verwerkt. De resultaten zijn, daarom gerangschikt ruwweg gebaseerd op resolutie en andere kwaliteit statistieken, zoals R_samenvoegen in de laagste resolutie shell, CC(1/2) en volledigheid. Dit is gericht op het begeleiden van de gebruiker naar de beste datasets, maar alle mogelijke ruimte groepen en resultaten moeten zorgvuldig worden geïnspecteerd.
2. Unzip de gedownloade map, waarin ook alle log-bestanden en niet-samengevoegde XDS_ASCII. HKL en samengevoegde en geschaald .mtz bestanden.
   Opmerking: In het geval dat de structuur (in PDB-formaat) van de proteïne van belang of een nauwe homolog is geüpload naar de ISPyB aan het begin van het experiment, de pijpleiding van de autoprocessing op ESRF zal automatisch uitvoeren een moleculaire vervanging (MR) uitgevoerd met behulp van deze structuur als de model op de best scorende oplossing zoeken. De resultaten van de heer pijpleiding worden weergegeven in ISPyB en kunnen worden gevonden in de verwerkte gegevens-map (bijvoorbeeld, /data/visitor/mx2112/id30a1/20180711/PROCESSED_DATA/GCSH/GCSH-x5/autoprocessing_GCSH-x5_run1_1/grenades_fastproc/user_nohet.pdb_ mrpipe_dir /). Hier, het uiteindelijke model zal de naam coot1.pdb en de reflectie gegevens sidechains.mtz. Merk op dat de pijpleiding de symmetrie van de cel (de vermindering van de primitieve cel) teneinde de waarschijnlijkheid van het vinden van een oplossing zou kunnen verminderen. In het geval hier schreef de heer pijpleiding uit de oplossing in een monoklien cel (C2) in plaats van in een orthorhombisch cel (C222₁). Details over het uitvoeren van een moleculaire vervanging handmatig uitvoeren (geïllustreerd voor de tweede oplossing voor het best scorende autoprocessing) zijn opgenomen in de Aanvullende bestanden.

Results

De werkstroom MXPressP gewend was op de ESRF beamline massief-1, volautomatisch, mount, midden in de X-ray-balk, karakteriseren en volledige diffractie datasets verzamelen uit een groot aantal kristallen van menselijke GCSH. De monsters werden gemonteerd en de lus geanalyseerd voor een gebied om te scannen (Figuur 1, links). Na de analyse van de diffractie, werden vier punten geselecteerd binnen het kristal voor gegevensverzameling (Figuur 1, rechts). Een latere verwerking door geautomatiseerde data analyse pijpleidingen, met inbegrip van de heer pijpleiding, leverde kwalitatief hoogwaardige datasets (tabel 1) waarvoor een heer oplossing is gevonden. De laatste kan gebruikers snel beoordelen of de verkregen dataset en de gebruikte Zoek model geschikt zijn voor geleidelijke door moleculaire vervanging. Daarnaast kan de aanwezigheid van liganden worden beoordeeld, dus het toelaat van de gebruiker zich alleen richten op de meest veelbelovende datasets voor verdere analyse. Handmatige structuurbepaling van de heer leverde een kwalitatief hoogwaardige elektronen dichtheid kaart na een honkslag geautomatiseerd verfijning cyclus (Figuur 2a). Voor deze dataset Knip de geautomatiseerde pijpleiding de gegevens op een 1,32 Å resolutie; gebruikers kunnen echter nog steeds beslissen om te snijden van de gegevens op een lagere resolutie te komen tot de statistieken van verschillende kwaliteit (CC_1/2, < I/σ(I) >, R_MEA's) in de hoogste resolutie shell. De kristalstructuur van menselijke GCSH structuur is vergelijkbaar met die van de boviene eiwit (3KlR)¹⁶.

Continu elektronen dichtheid is zichtbaar voor de gehele aminozuur-keten, afgezien van de N-terminale histidine-tag. De vier vervangingen die het onderscheiden van menselijke en boviene GCSH, zijn drie duidelijk herkenbaar in de dichtheid van de elektron (Ile/Val66, Asp/Glu98 en Leu/Phe149; Figuur 2b -d). Dit is minder duidelijk voor de vervanging van de ASP-/ Lys125 waarvoor de elektronen dichtheid van de zijketen slechts ten dele als gevolg van de flexibiliteit (1e cijfer opgelost is). De momenteel verkregen model heeft R_werken en_gratis R-waarden van 20,4% en 23,8%, respectievelijk, en verder kan worden geoptimaliseerd door verdere cycli van automatische en handmatige model gebouw en verfijning.

	GRANATEN pijpleiding	XDS_APP pijpleiding
Gegevensverzameling en -verwerking
X-Ray bron / Beam lijn	ESRF / MASSIEF-1
Golflengte (Å)	0.966
Resolutie (Å)	41.88-1,48 (1.53-1.48)	41.86-1.32 (1.39-1.32)
Totaal/uniek reflecties	127670 / 28644	177332 / 40134
	(12178 / 2775)	(23772 / 5714)
Ruimtegroep voor het indexeren, schalen en samenvoegen	C222	C2221
Afmetingen van de cel
a, b, c (Å)	42,20, 83.75, 95.85	42.19, 83.72, 95,82
Mosaicity	0,05	0,05
Rmeas (%)	10,0 (110.7)	11.1 (198,2)
< I/σ(I) >	9.6 (1.3)	7,6 (0.7)
CC1/2 (%)	99,7 (53,9)	99,7 (19.1)
Volledigheid (%)	99,6 (99,6)	99,5 (98,6)
Veelheid	4.5 (4.4)	4.4 (4.2)
Moleculaire vervanging en verfijning van de voorlopige model
Ruimtegroep voor geleidelijke afschaffing	C2	C2221
Afmetingen van de cel
a, b, c (Å)	83.74, 42.18, 95,82	42.19, 83.72, 95,82
Α, Β, Γ (°)	90.03, 90, 90	90, 90, 90
Zoek model voor MIJNHEER (VOB)	3KLR	3KLR
Eiwitmolecules / ASU	2	1
Eiwit residuen	250	125
Rwerken/rgratis (%) na 1e verfijning	24,3 / 26,5	20.4 / 23.8
RMSD bindingslengte (Å) na 1e verfijning	0,01	0,01
RMSD bond hoek (°) na 1e verfijning	1.2	1,83
Rotamer uitbijter (%) na 1e verfijning	1.07	4.29
Ramachandran begunstigde/toegestaan/niet toegestaan (%) na 1e verfijning	95.93 / 4.07 / 0	95.12 / 4.88 / 0

Tabel 1: röntgendiffractie gegevens verzamelen, verfijning en validatie statistieken. Waarden voor de hoogste resolutie shell tussen haakjes.

Figuur 1: analyse voor gegevensverzameling Sample. (A) de regio die is geselecteerd voor scannen wordt weergegeven met een rood vakje. (B) de analyse van diffractie beelden wordt weergegeven als een warmte-kaart. Vier posities binnen het gelegen kristal werden geselecteerd voor gegevensverzameling. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2: visuele validatie van elektronen dichtheid kaarten verkregen na verfijning. Elektronen dichtheid kaarten contouren op 2 x r.m.s. niveau rond (een) Trp143, (b) Val66 (Ile in menselijke GCSH), en (c) Glu98 (Asp in menselijke GCSH) en kaarten met werklastbeschrijving op 1 x r.m.s niveau rond (d) Phe149 (Leu in menselijke GCSH) en (e) Lys125 (Asp in menselijke GCSH). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Volautomatische straallijnen bieden geautomatiseerde karakterisering en gegevensverzameling van grote aantallen macromoleculaire kristallen zonder de aanwezigheid van een wetenschapper, hetzij op de beamline op afstand, vereist. Met behulp van volledig geautomatiseerde straallijnen heeft vele voordelen ten opzichte van handmatige bediening. Voor bijvoorbeeld het geautomatiseerde monster centreren, gebaseerd op de X-ray mesh en line scant, is nauwkeuriger dan die uitgevoerd met het menselijk oog als wordt het niet beïnvloed door thermische of optische effecten. Inderdaad, deze mazen en lijn scans bieden aanvullende gegevens (dat wil zeggen, gedetailleerde afmetingen van het kristal en de beste buigingsinrichting van de regio van het kristal) die belangrijk zijn in het bepalen van de grootte van de juiste lichtbundel om te gebruiken voor gegevensverzameling — met name voor kleine kristallen ¹⁸— en vaak resulteren in een verbetering van de kwaliteit van de gegevens verkregen diffractie. Bovendien, door te profiteren van de door de gebruiker gedefinieerde parameters in de setup van automatische experimenten, de stappen in specifieke werkstromen kunnen worden aangepast meest geschikt zijn voor het systeem onder studie, dus verder optimaliseren van het slagingspercentage van het experiment.

Tezamen, de betrouwbaarheid van de werkstromen beschikbaar zijn, de eenvoudige toegang tot de beamline (gebruikers zelf plannen, met behulp van een kalender [zie hierboven]), en de volledig geautomatiseerde aanpak van massief-1 biedt een rigoureuze, high-throughput en tijdbesparende alternatief voor de klassieke hands-on MX experimenten en het potentieel om meer geavanceerde procedures en toepassingen in automatische werkstromen te implementeren. In de nabije toekomst, worden crystal cartografie in 3D¹⁹ toegepast ter verbetering van de nauwkeurigheid van X-ray centreren, terwijl complexere protocollen, zoals crystal uitdroging experimenten²⁰, zal worden geautomatiseerd. Gehoopt wordt dat volledig autonoom gegevensverzameling een standaardmethode in MX, kwalitatief hoogwaardige gegevens verstrekken voor kleine-molecuul fragment schermen, optimaliseren van het screenen van grote aantallen slecht buigingsinrichting kristallen en automatisch fase zal worden informatie om te lossen crystal structuren DOVO. In combinatie met ontwikkelingen in de automatische opruiming van kristallen²¹, zou de mogelijkheid van eiwit kristal structuur oplossing als een geautomatiseerde service goed een realiteit geworden.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beamline MASSIF-1	ESRF
BL21DE3	New England Biolabs	C2527I
chloramfenicol	Roth	3886.1
Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K	Merck Millipore	UFC803024
Dialyzing membraan	Spectrumlabs	132655
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Dnase	Roche	11284932001
DTT	Euromedex	EU0006-B
EDTA-vrije proteaseremmers	Roche	4,693,159,001
glycerol	VWR Chemicals Prolabo	14388.29T
His-trap HP	GE healthcare	17-5247-01
imidazol	Sigma-Aldrich	56750-500G
IPTG	Euromedex	EU0008-B
LB medium	Sigma-Aldrich	L3022
lipoic zuur	Sigma-Aldrich	T5625
loop	Hampton Research	HR8-124
lysozym	Roche	10 837 059 001
MonoQ 5/50 GL	GE healthcare	17-5166-01
NaCl	Fisher Chemical	S/3160/60
Sonicator vibra cell 75/15	SONICS
SPINE pucks	MiTeGen	SKU: M-CSM003-0001A
Tris-basis	Euromedex	26-128-3094-B
Natriumformiaat	Sigma-Aldrich	1064430500
GCSH-zuiveringbuffer	20 mM TRIS pH 8, 200 mM NaCl
GCSH cryo-beschermingsbuffer	0,25 M natriumformiaat pH 4, 30% glycerol
Programma's:
MxCube		Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010)	lokale ontwikkeling
ISPyB	ESRF	Solange Delagenière, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, Stéphanie Veyrier, José Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Seán M. McSweeney, Stéphanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186-3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535	lokale ontwikkeling
MXCube2	ESRF	Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24-226 (2014).	lokale ontwikkeling
BES workflow server		Brockhauser, S. et al. The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984, doi: 10.1107/S090744491201863X (2012).
DOZOR	ESRF	Bourenkov and Popov, ongepubliceerd	lokale ontwikkeling
BLISS beamline control		Guijarro, M. et al. BLISS - Experiments Control for ESRF EBS Beamlines. Proceedings of the 16th Int. Conf. on Accelerator and Large Experimental Control Systems, ICALEPCS2017, Barcelona, Spain. doi: 10.18429/jacow-icalepcs2017-webpl05 (2018).	lokale ontwikkeling
AUTO verwerking van beelden		Monaco, S. et al. Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF. Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810, doi: 10.1107/S0021889813006195 (2013)	lokale ontwikkeling
BEST en EDNA		Incardona, M.-F., Bourenkov, G.P., Levik, K., Pieritz, R.A., Popov, A.N., Svensson, O. EDNA : a framework for plugin-based applications applied to X-ray experiment online data analysis. Journal of Synchrotron Radiation. 16 (6), 872-879, doi: 10.1107/S0909049509036681 (2009).	lokale ontwikkeling
CCP4		Winn, M.D. et al. Overview of the CCP 4 suite and current developments. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 235-242, doi: 10.1107/S0907444910045749 (2011).
Phaser MR		McCoy, A.J., Grosse-Kunstleve, R.W., Adams, P.D., Winn, M.D., Storoni, L.C., Read, R.J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674, doi: 10.1107/S0021889807021206 (2007).
Coot		Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60