Dit protocol beschrijft een efficiënte methode om een nanoemulsion voor een oliezuurgehalte acids-platinum(II) conjugate gestabiliseerd met een lysine-tyrosine-fenylalanine (KYF)-tripeptide synthetiseren. De nanoemulsion vormen onder zachte synthetische voorwaarden via zelf-assemblage van de KYF en de geconjugeerde.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een Tripeptide-gestabiliseerde Nanoemulsion van oliezuur
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Beschrijven we een methode voor de productie van een nanoemulsion samengesteld uit een oliezuurgehalte acids-Pt(II) kern en een lysine-tyrosine-fenylalanine (KYF) coating (KYF-Pt-NE). De KYF-Pt-NE Pt(II) kapselt op 10 pm %, heeft een diameter van 107 ± 27 nm en een negatieve lading van de oppervlakte. De KYF-Pt-NE is stabiel in water en in serum, en biologisch actief is. De vervoeging van een fluorophore te KYF kunt de synthese van een fluorescerende nanoemulsion die geschikt is voor biologische beeldvorming. De synthese van de nanoemulsion wordt uitgevoerd in een waterige omgeving, en de vormen van de KYF-Pt-NE via zelf-assemblage van een korte KYF peptide en een conjugaat oliezuurgehalte acids-platinum(II). De zelf-assemblage proces hangt af van de temperatuur van de oplossing, de molaire verhouding van de substraten, en het debiet van de toevoeging van het substraat. Cruciale stappen omvatten handhaven van de optimale roeren tarief tijdens de synthese toelaat voldoende tijd voor zelf-assemblage en de nanoemulsion vooraf geleidelijk te concentreren in een centrifugaal concentrator.
Inleiding
In de afgelopen jaren is er een groeiende interesse in de engineering van nanodeeltjes voor biomedische toepassingen zoals drug delivery en bioimaging1,,2,,3,4. De multifunctionaliteit van de nanoparticle gebaseerde systemen vereist vaak meerdere componenten binnen een formulering opnemen. De bouwstenen die zijn gebaseerd op lipiden of polymeren vaak verschillen in hun fysisch-chemische eigenschappen alsmede hun biocompatibiliteit en biologische afbreekbaarheid, die uiteindelijk gevolgen voor de functie van de nanostructuur....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. synthese van de geconjugeerde oliezuurgehalte Acids–Platinum(II)
- Activering van cisplatine
- Schorten 50 mg (0.167 mmol) cisplatine in 4 mL water (bijvoorbeeld nanopure) bij 60 ° C.
- Voeg dropwise 55.2 mg (0.325 mmol) van AgNO3 in 0,5 mL water aan de oplossing van cisplatine en roer de reactie voor ten minste 2 uur bij 60 ° C. Het witte neerslag van AgCl zal vormen die de voortgang van de reactie aangeeft.
- Om te bepalen als de reactie van de activering is voltooid, het uitvoeren van de test met 10% HCl op de aanwezigheid van gratis Ag+ -ion in oplossing. De test moet negatieve (geen extra AgCl neerslag moet....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Vertegenwoordiger TEM afbeelding van KYF-Pt-NE opgesteld op basis van dit protocol wordt getoond in figuur 2A. De KYF-Pt-NEs zijn bolvormig in morfologie, goed verspreid, en uniform in grootte. De kerndiameter van de KYF-Pt-NEs, gemeten vanuit drie TEM beelden met een minimum van 200 metingen gedaan, is 107 ± 27 nm. De hydrodynamische diameter van KYF-Pt-NE, geanalyseerd met behulp van dynamische lichte spectroscopie (DLS), bleek te zijn 240 nm met een polydi.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Kritische stappen in de nanoemulsion synthese omvatten aanpassing van de molaire verhouding van de substraten, temperatuur en debiet tarief controle houden tijdens oliezuurgehalte acids–Pt(II) toevoeging bieden voldoende tijd voor zelf-assemblage en zuiveren met behulp van het product een Centrifugaal concentrator kolom. Deze parameters invloed op de grootte en morfologie van de KYF-Pt-NE; het is dus belangrijk de juiste molaire verhouding te handhaven en de synthetische voorwaarden correct aan te passen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Auteurs hebben niet een belangenconflict openbaar te maken.
Dankbetuigingen
Wij nogmaals mijn dankbaarheid uitspreken financiële steun van de National Cancer Institute, verlenen SC2CA206194. Geen concurrerende financiële belangen worden gedeclareerd.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TBTU) | ANASPEC INC.: | AS-20376 | SPPS |
| 4-well chamber confocal dish | Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific | 154526 | Voor beeldvorming |
| 6-bromohexanoic acid | Chem-Impex INT’L INC. | 24477 | Click modificatie voor peptide |
| A2780 | Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital | Ovariaal kankercel lijn | |
| Barnstead Nanopure | Thermo Fisher | D11901 | waterfiltratie systeem |
| BUCHI rotavapor R-3 | Buchi | Z568090 | Voor verwijdering van oplosmiddelen en het drogen van monsters |
| Centrifuge 5810 R | eppendorf | 5811F | Voor scheiding van platina complexen |
| Cis-dichlorodiamineplatinum (II) 99% | Acros Organics | 19376-0050 | in vitro tests |
| CP70 | Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital | Ovariaal kankercel lijn | |
| Digital water bath | VWR | 97025-134 | Voor het opwarmen van media voor celcultuur |
| Dynamic Light Scattering (DLS) | Brookhaven Instrument Corporation | Voor metingen van de grootte van nanodeeltjes | |
| ES-2 | ATCC | CRL-1978 | ovariaal kankercel lijn |
| Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99.79% | Chem-Impex INT’L INC. | 00493 | SPPS |
| Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alcohol resin (0.382 meq/g), | Chem-Impex INT’L INC. | 01914 | SPPS |
| Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98% | Alfa Aesar | H59730 | SPPS |
| HERACELL 150i CO2 incubator | Thermo Scientific Fisher | incubator | |
| High pressure syringe pump | New Era | 1010-US | Voor toevoeging van platina complexen in de synthese van nanodeeltjes |
| Hotplate/roerder | VWR | 12365-382 | Voor het roeren en verwarmen van monsters |
| LAMP-1 Antilichaam (geconjugeerd met Alexa Fluor 647) | Santa Cruz Biotechnology | sc-18821 AF647 | Voor beeldvorming |
| N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) | Oakwood Chemical | 005027 | SPPS |
| Ninhydrine 99% | Alfa Aesar | A10409 | Kaiser test |
| Oleïnezuur | Chem-Impex INT’L INC. | 01421 | Voor platina complex synthese |
| OV90 | ATCC | CRL-11732 | Ovariaal kankercel lijn |
| PBS | Corning | 21-031-CV | Voor cel wassen |
| Permount montage medium | Fisher Chemical | SP15-100 | Voor beeldvorming |
| Fenol | Fisher Chemical | A92500 | Kaiser test |
| Fosforwolfraamzuur | Fisher Chemical | A248-25 | negatieve kleuring voor TEM |
| Piperidine 99% | BTC | 219260-2.5L | SPPS |
| Platinum AAS standaard oplossing | Alfa Aesar | 88086 | 1000ug/ml voor calibratiecurve |
| Propargyl bromide 97% | Alfa Aesar | L10595 | Voor alkyn modificatie van fluoresceine |
| Wetenschappelijke biologische kast | Thermo Scientific Fisher | 1385 | Bio-hood voor celcultuur |
| Zelfreinigende vacuüm systeem | Welch | 2028 | Vacuumpomp voor rotavapor |
| Zilvernitraat | Acros Organics | 19768-0250 | Cisplatin activering |
| SKOV3 | ATCC | HTB-77 | Ovariaal kankercel lijn |
| Natriumhydroxide | Fisher Scientific | S313-1 | Voor platina complex synthese |
| Tin (II) chloride | Sigma Aldrich | 208256 | Test voor platina aanwezigheid |
| TOV21G | ATCC | CRL-11730 | Ovariaal kankercel lijn |
| Trifluorazijnzuur 99% (TFA) | Alfa Aesar | L06374 | SPPS |
| Triisopropylsilaan (TIPS) | Chem-Impex INT’L INC. | 01966 | SPPS |
| Triton-X | Sigma Aldrich | T8787-100ML | Voor beeldvorming |
| Uranine poeder 40% | Fisher Scientific | S25328A | Voor alkyn modificatie van fluoresceine |
| Vivaspin 20 (10000 MWCO) | Sartorious | VS2001 | Voor Nanoparticle wassen en condensatie |
| VWR Inverted Microscoop | VWR | 89404-462 | Voor celcultuur monitoring |
Referenties
- Agrahari, V., Agrahari, V., Mitra, A. K. Nanocarrier fabrication and macromolecule drug delivery: challenges and opportunities. Therapeutic Delivery. 7 (4), 257-278 (2016).
- Anselmo, A. C., Mitragotri, S. Nanoparticles in the clinic. Bioengineering & Translat....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
