Controle van de neuronale overleven via longitudinale fluorescentie microscopie

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om te controleren van de overleving op basis van de eencellige en identificeren van variabelen die aanzienlijk celdood voorspellen.

Samenvatting

Standaard cytotoxiciteit testen, waarvoor de collectie lysates of vaste cellen op meerdere tijdstippen, hebben beperkte gevoeligheid en capaciteit te beoordelen factoren die van invloed zijn neuronale lot. Deze tests vereisen de waarneming van afzonderlijke populaties van cellen in discrete tijd punten. Dientengevolge, kunnen niet afzonderlijke cellen prospectief na verloop van tijd ernstig beperken het vermogen om te discrimineren of subcellular gebeurtenissen, zoals de vorming van de puncta of eiwit mislocalization, pathogene bestuurders van ziekte, homeostatische reacties, worden gevolgd of louter toeval verschijnselen. Eencellige longitudinale microscopie overwint deze beperkingen, waardoor de onderzoeker om te bepalen van verschillen in overleving tussen populaties en tekenen van causale relaties met verbeterde gevoeligheid. Deze video-gids zal schetsen een representatieve workflow voor experimenten eencellige voortbestaan van rat primaire corticale neuronen uitdrukken van een fluorescente proteïne marker te meten. De kijker leert hoe bereiken hoogrenderende transfections, verzamelen en verwerken van beelden, waardoor de potentiële tracking van afzonderlijke cellen en vergelijken van de relatieve overleving van neuronale populaties met behulp van Cox proportionele gevaren analyse.

Inleiding

Abnormale celdood is een drijvende factor in vele ziekten, waaronder kanker, neurodegeneratie en lijn¹. Robuust en gevoelige testen voor de dood van de cel zijn essentieel voor de karakterisatie van deze aandoeningen, evenals de ontwikkeling van therapeutische strategieën tot verlenging of vermindering van de cellulaire overleven. Er zijn momenteel tientallen technieken voor het meten van celdood, ofwel rechtstreeks ofwel via surrogaat markeringen². Bijvoorbeeld, kan celdood visueel worden beoordeeld met behulp van vitale kleurstoffen die selectief vlek dode of levende cellen³, of door de controle van het uiterlijk van specifieke fosfolipiden op het plasmamembraan^4,5,6 . Metingen van intracellulaire componenten of cellulaire metabolieten vrijkomen van de media bij cellulaire ontbinding kunnen ook worden gebruikt als proxy's voor^7,8van de dood van de cel. U kunt ook kan cellulaire levensvatbaarheid worden benaderd door metabole activiteit^9,10te beoordelen. Al deze methoden snelle middel om de beoordeling overleving van de cel bieden, zijn zij niet zonder voorbehoud. Elke techniek merkt de cultuur als een enkele populatie, waardoor het onmogelijk is om te onderscheiden tussen afzonderlijke cellen en hun unieke tarieven van overleving. Bovendien zijn deze gehaltebepalingen bevolking gebaseerde kunnen factoren die belangrijk voor de dood van de cel zijn kunnen, met inbegrip van cellulaire morfologie, eiwit expressie of lokalisatie gemeten. In veel gevallen, deze tests zijn beperkt tot discrete tijd punten, en sta niet voor de continue waarneming van cellen na verloop van tijd.

In tegenstelling, is longitudinale fluorescentie microscopie een zeer flexibele methodologie die rechtstreeks en continu het risico van overlijden op een eencellige basis^{11 monitoren}. Kortom, kunt longitudinale fluorescentie microscopie duizenden afzonderlijke cellen worden bijgehouden op regelmatige tijdstippen gedurende langere perioden van tijd, waardoor nauwkeurige metingen van celdood en de factoren die het versterken of onderdrukken van celdood. Aan de basis wordt bij deze methode de voorbijgaande transfectie of signaaltransductie van cellen met vectoren codering van fluorescente proteïnen. Een unieke fiduciaire is dan vastgesteld en de positie van elke transfected cel met betrekking tot deze mijlpaal kan de gebruiker image & bijhouden van afzonderlijke cellen in de loop van uren, dagen of weken. Als deze beelden opeenvolgend worden weergegeven, wordt celdood gekenmerkt door karakteristieke wijzigingen in fluorescentie, morfologie en versnippering van het lichaam van de cel, waardoor de toewijzing van een moment van overlijden voor elke cel. Het berekende percentage van de dood, bepaald door de gevaar-functie, kan vervolgens worden kwantitatief vergeleken tussen voorwaarden, of aan het selecteren van cellulaire kenmerken met behulp van univariate of multivariate Cox proportionele gevaren analyse¹²gerelateerde. Deze benaderingen kunnen samen de correcte en objectieve discriminatie van tarieven van celdood onder mobiele bevolkingsgroepen, en de identificatie van variabelen die aanzienlijk celdood en/of survival (Figuur 1 voorspellen).

Hoewel deze methode kan worden gebruikt om te overleven in een post mitotische celtype in een verscheidenheid van formaten plating controleren, zal dit protocol voorwaarden voor transfecting en corticale neuronen rat gekweekt in een 96-wells-plaat imaging beschrijven.

Protocol

Alle gewervelde dieren werk werd goedgekeurd door de Commissie op het gebruik en de verzorging van dieren aan de Universiteit van Michigan (protocol # PRO00007096). Experimenten zijn zorgvuldig gepland om te minimaliseren van het aantal dieren geofferd. Zwangere vrouwen wild-type (WT), niet-transgene lange Evans ratten (Rattus norvegicus) zijn afzonderlijk ondergebracht in kamers uitgerust met milieu verrijking en verzorgd door de eenheid voor laboratorium dier geneeskunde (ULAM) aan de Universiteit van Michigan, in komstig de NIH-ondersteunde gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren. Alle ratten werden gehouden in routine huisvesting voor zo weinig mogelijk voorafgaand aan de euthanasie, conform de aanbevelingen van de richtsnoeren inzake euthanasie van de Amerikaanse veterinaire medische vereniging en de Universiteit van Michigan tijd methoden van euthanasie door Soorten richtsnoeren.

1. materiële voorbereiding

1. Ontleden van corticale neuronen van embryonale dag die 19 – 20 rat pups en cultuur corticale neuronen op 0,5 x 10⁶ cellen per milliliter op poly-D-lysine gecoate platen voor 4 dagen in vitro, rat zoals eerder beschreven^{13,14, 15,16,17,18,19}.
2. Voorbereiden van de plasmide DNA van belang na de stappen door een endotoxine-vrije plasmide DNA isolatie kit (Zie Tabel van materialen). Kwantificeren van de resulterende DNA met een spectrofotometer.
3. Bij in vitro dag 4 (DIV4), aliquoot, filter steriliseren en Incubeer de volgende media op 37 ° C: 6 mL verminderd serum media (RSM; bijvoorbeeld., OptiMEM), 25 mL neuronale basale media (NBM), 40 mL NBKY (NBM + 1 mM kynurenic zuur + 10 mM MgCl₂, aangepast aan een pH van 7. 4), 10 mL NBC (NBM + 1 x neuronale cel cultuur supplement + 1 x L-glutamine supplement + 1 x Pen Strep).
   Opmerking: Volumes vermeld zijn voldoende voor transfecting een 96-wells-plaat. Verwijzen naar de Tabel van de materialen voor specifieke reagentia.

2. de transfectie van Rat corticale neuronen

1. Het gegeven voorbeeld transfectie blad wijzigen (Zie aanvullende bestand 1) door het aanpassen van de plaat type, plaat, kaart, aantal Ani, DNA-concentratie en aantal wells ("groene dozen").
   Opmerking: Het totale DNA bedragen naar 0,2 µg per putje, ongeacht of men (bijv.., DNA-A) of meerdere (bijvoorbeeld DNA B en C) DNA-constructies worden toegevoegd aan elk putje.
2. Werken vanuit de spreadsheet, combineren de juiste hoeveelheid RSM en DNA in één buis. Het combineren van de juiste hoeveelheid RSM en transfectie reagens (bijvoorbeeld Lipofectamine) in een aparte buis.
3. Incubeer bij kamertemperatuur (RT) gedurende 5 minuten.
4. Combineren van het DNA en transfectie reagens RSM mengsels en Incubeer bij RT gedurende 20 min.
5. Tijdens deze stap van de incubatie, gebruik maken van een meerkanaalspipet en steriele kunststof troggen te wassen 2 x met 100 µL per putje van NBM cellen. De geconditioneerde media (CM) reserveren en op te slaan bij 37 ° C. Voor dit en stappen uit te voeren, zorgen om te minimaliseren van de hoeveelheid tijd die neuronen worden blootgesteld aan lucht.
6. Verwijder de NBM-media en vervang met 100 µL per putje van NBKY.
7. Na 20 minuten verstreken zijn, voeg toe 50 µL van het mengsel van transfectie reagens/DNA ontkleuring aan elk putje.
8. Incubeer de cellen met de transfectie reagens/DNA complexen gedurende 20 minuten bij 37 ° C.
9. Spoel 2 x met NBKY en vervangen door 100 µL van CM en NBC 100 µL per putje.
10. Succesvol transfected cellen moeten zichtbaar door fluorescentie microscopie binnen 16 – 24 h van transfectie zijn. Te meten van efficiëntie, een fluorescente microscoop te gebruiken om te controleren van de transfectie na overnachting incubatie bij 37 ° C.
    Opmerking: Deze techniek resulteert in een totaal rendement van de transfectie van 5 tot 10%.

3. beeldvorming

1. Plaats de plaat op een fluorescente microscoop met een gemotoriseerde stadium, en stellen een fiduciaire (bijvoorbeeld een merk aan de onderkant van de plaat), waarmee de gebruiker naar het uitlijnen van de plaat telkens wanneer die het image is gemaakt. Een afbeelding van dit fiduciaire voor verwijzing opslaan.
2. Navigeer naar een gebied van belang en Let op de x-en y-coördinaten ten opzichte van de fiduciaire.
3. Focus op transfected cellen, uiting geven aan een fluorescerende label.
4. Deelnemen aan fluorescerende afbeeldingen het juiste kanaal of kanalen (bijv. rood fluorescerende eiwit [RFP], groen fluorescent proteïne [GFP], 4, 6-diamidino-2-phenylindole [DAPI] '), handmatig of op een geautomatiseerde manier. Door verschillende opnamen tussenpozen regelmatig regelafstand, een montage van de put tijdens beeldverwerking kan worden gemonteerd (zie stap 4).
   Opmerking: De afstand is afhankelijk van verschillende factoren, zoals de vergroting, de optica van de Microscoop, en de grootte van de detector. In het algemeen zullen de optische afstand tussen aangrenzende afbeeldingen tussen 90-95% van de grootte van elke afzonderlijke afbeelding, voorzien van een kleine mate van overlapping van de afbeelding te voorzien van uitlijning.
5. Herhaal dit proces zo vaak als nodig, aanpassing aan de oorspronkelijke fiduciaire telkens. Voor de analyse van de overleving plaatsvindt imaging elke 6-24 h, afhankelijk van het celtype en het doel van het experiment.

4. de beeldverwerking

Opmerking: Na overname van de afbeelding moeten een reeks stappen worden verwerkt vóór beeldanalyse. Deze omvatten, maar zijn niet beperkt tot, stiksels, stapelmogelijkheden en achtergrond aftrekken (Figuur 1). Het doel van deze stappen is een afbeeldingsstapel, of tijdreeksen, waarin cellen zijn duidelijk waarneembaar is vanuit hun achtergrond en makkelijk te volgen over meerdere tijdstippen te produceren. Een toegewijde FIJI macro (Image_Processing.ijm, Zie aanvullende bestand 2) voert basic stiksels, stapelen, en achtergrond van aftrekken. Een uitleg van elke stap en de parameters te overwegen bij het uitvoeren van beeldverwerking vindt u in de sectie discussie.

1. Pas de onbewerkte gegevens of input map overeenkomen met de opmaak die is afgebeeld in Figuur 2.
2. Als tijdstippen niet aaneengesloten (dat wil zeggen, T1, T2, T3), deze namen van mappen wijzigen zodat ze zijn. Deze stap is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de Image_Processing macro niet crasht tijdens het stapelen.
3. Dubbelklik op het pictogram van de Fiji open het programma, vervolgens klikt u op en sleep de macro Image_Processing naar de Fiji. Hiermee opent u de macro in Fiji.
4. Lijnen 2-7 van de Image_Processing macro opgeven van de input map met afbeeldingen, de folder van de gewenste output voor gestikte en gestapelde afbeeldingen, aantal imaging timepoints, aantal fluorescerende kanalen en plaat-indeling aanpassen.
5. Bepaalt de volgorde waarin de beelden werden verworven. Om dit te testen, steek handmatig een montage van beelden in FIJI door manoeuvreren naar de Plugins vervolgkeuzemenu | Binddraad | Raster/collectie stiksel. Pas de instellingen binnen de dropdown menu's Type en volgorde totdat een nauwkeurig gestikte afbeelding wordt geproduceerd.
6. Aanpassen van de variabelen van het GRID_TYPE en STITCH_ORDER in de regels 8 en 9 van de Image_Processing macro die overeenkomen met deze selecties.
7. Geef het aantal beelden per putje door metrolijn 10 in de Image_Processing macro aan te passen.
   Opmerking: Voor de montage van een 2 x 2 van beelden, deze regel zou luiden DIM = 2.
8. Als achtergrond aftrekken vereist is, passen lijn 14 van de macro Image_Processing BGSUB = true.
9. Stel de rolstraal van de bal door lijn 15 in de Image_Processing macro aan te passen.
   Opmerking: Stel de straal in te stellen op ten minste het voor optimale resultaten, diameter van de grootste object op de voorgrond in de afbeelding.
10. Klik op uitvoeren om te starten van de macro Image_Processing . Eenmaal gestart, zal de Image_Processing automatisch vooraf via stiksels, stapelmogelijkheden en achtergrond aftrekken.

5. scoren celdood

Opmerking: Zie de sectie discussie voor meer informatie over scoren celdood en censureert gegevens.

1. Zoek de afbeeldingsstapels geproduceerd door het Image_Processing script. Open deze in FIJI.
2. Kunt de wijs hulpprogramma binnen FIJI afzonderlijk label elke cel met een getal. Op t te drukken na elke punt de cel-id aan de ROI (regio-of-interest) Manager toevoegen zal.
   Opmerking: De id's kunnen worden gevisualiseerd door te klikken op de etiketten en Toon alle selectievakjes in de Manager van de ROI.
3. Vooruitgang door middel van de timepoints in elke afbeeldingsstapel en record het timepoint wanneer elke cel of sterft of moet worden gecensureerd in het bestand Survival_spreadsheet.csv (Zie aanvullende bestand 3).
   1. Elke cel is gevestigd in één rij in het werkblad, waarin een unieke identificatie (ID) voor elke cel bestaat uit haar goed overeenkomt en ROI getal in dat goed. tp_death is het laatste punt van de tijd dat een cel wordt waargenomen om te leven, terwijl time_death staat voor het werkelijke tijdstip van overlijden in uren. Voor elke cel, deze gegevens invoeren. Het is essentieel voor het handhaven van deze structuur voor latere analyse met behulp van de overleven. R (Zie aanvullende bestand 4).
      Opmerking: De criteria voor het bepalen van de dood van de cel zijn van cruciaal belang en kunnen variëren afhankelijk van het celtype. Drie belangrijkste criteria worden gebruikt bij de identificatie van dode neuronen^11,20 (Figuur 3): verlies van de intensiteit van de fluorescentie (bijvoorbeeld Neuron 1 bij 69 h), afronding van de cel lichaam (bijvoorbeeld Neuron 2 op 188 h), en het verlies van neurite integriteit of blebbing (bijvoorbeeld Neuron 2 op 188 h).
4. De status van de censuur van de cel in de laatste kolom opnemen.
   Opmerking: Hier, als gevolg van de eigenaardige manier censuur wordt behandeld door R, gecensureerde cellen zijn gemarkeerd door 0, terwijl ongecensureerde cellen zijn gemarkeerd door 1. Merk op dat alle cellen die naar het laatste tijdstip leven zijn gecensureerd en daarom gemarkeerd als 0.

6. het uitvoeren van Cox evenredige gevaren analyse en visualiseren van resultaten

1. Indien nodig, R studio op https://cran.r-project.org/mirrors.html downloaden.
2. Open R studio en dubbelklik op het pictogram voor het voortbestaan van de . R script.
3. Plaats de cursor op regel 2 overleven. R en klik op uitvoeren in het hoofdvenster van de R-studio om het laden van de overleving library.
4. Lijn 5 van het voortbestaan van de wijzigen R script om de locatie van het bestand Survival_spreadsheet.csv. Klik op uitvoeren om de gegevens van de overleving als een dataframe te laden.
5. Markeer lijnen 8 en 9 en klik op uitvoeren in het consolevenster van R studio om Cox proportionele gevaren analyses uit te voeren. Resultaten en statistieken van de uitvoer weergegeven in het consolevenster van R-studio.
6. Markeer lijnen 12-16 overleven. R en druk op de knop uitvoeren om te produceren een cumulatieve risico van dood perceel, die op het tabblad van de percelen in R-studio verschijnen zal. Dit bestand kan worden opgeslagen door te klikken op de knop exporteren boven de plot.
7. Zo is het wenselijk om de gegevens van de overleving als een Kaplan-Meier curve uitzetten, markering lijnen 19-24 overleven. R en druk op de knop uitvoeren .

Resultaten

Volgens de procedure van de transfectie hier, waren DIV4 rat corticale neuronen transfected met een plasmide codering van de fluorescente proteïne mApple. Begin 24u na transfectie, werden cellen beeld door fluorescentie microscopie elke 24u voor 10 opeenvolgende dagen. De resulterende afbeeldingen werden georganiseerd zoals aangegeven in Figuur 2, dan gestikt, gestapeld en scoorde voor de dood van de cel (Figuur 1).

Discussie

Hier, wordt methodologie rechtstreeks volgen neuronale overleven op basis van de eencellige gepresenteerd. In tegenstelling tot traditionele testen voor celdood die beperkt tot discrete tijd punten en de hele bevolking van cellen zijn, deze methode die geschikt is voor de continue beoordeling van een aantal factoren, zoals cellulaire morfologie, eiwit expressie of lokalisatie, en kunt bepalen hoe elke factor cellulaire overleving in een prospectieve wijze beïnvloedt.

Deze methode kan worden aa...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Neurobasal Medium	GIBCO	21103-049
Opti-MEM	GIBCO	31985-070
CompactPrep Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12863
Magnesium chloride Hexahydrate	Sigma	M9272
Kynurenic Acid Hydrate	TCI	H0303
Poly D-Lysine	Millipore	A-003-E
Glutamax	GIBCO	35050-061
Lipofectamine 2000	Invitrogen	52887
B27 supplement	Thermo Fisher	A3582801
Penicillin/Streptomycin	GIBCO	15140122
96 well plates	TPP	0876