Een eenvoudige migratie/invasie Workflow met behulp van een geautomatiseerde Live-cel Imager

Summary

Het huidige protocol beschrijft een geïntegreerde methode onderzoek naar kanker cel migratie en invasie op één platform in real-time, het verstrekken van een gemakkelijk reproduceerbaar zijn en tijd-efficiënte optie te bestuderen van de cel mobiliteit en morfologie.

Abstract

Kanker cel mobiliteit is cruciaal voor de opening van metastase. Onderzoek van de cel beweging en invasieve capaciteit is daarom van groot belang. Migratie testen bieden fundamenteel inzicht van cel verkeer op een 2D-niveau, overwegende dat de invasie testen zijn meer fysiologisch relevant, het nabootsen van in vivo kanker cel dislodgment van de oorspronkelijke site en invasie via de extracellulaire matrix. Het huidige protocol biedt een enkele workflow voor migratie en invasie testen. Samen met de geïntegreerde automatische microscopische camera voor real-time HD-beelden en ingebouwde analyse module geeft het onderzoekers een tijd-efficiënte, eenvoudige en reproduceerbare experimentele optie. Dit protocol omvat ook vervangingen voor de verbruiksartikelen en alternatieve analysemethoden voor gebruikers om uit te kiezen.

Introduction

Cel migratie en invasie zijn belangrijke biologische processen waarmee normale functies in het menselijk lichaam, zoals wond sluiting, invasie van placenta in de baarmoeder en de borstklieren morfogenese^1,2,3. Het menselijk lichaam heeft precieze en strikte controle van deze biologische gebeurtenissen; Er zijn echter enkele uitzonderingen. Tumoren, zijn bijvoorbeeld in staat om te ontsnappen aan deze beveiliging, exposeren van abnormale proliferatie en binnenvallen in naburige weefsel, die metastase heet. Metastase is de belangrijkste oorzaak van kanker verband houdende mortaliteit⁴.

Borstkanker is de meest algemeen diagnose van kanker bij vrouwen, en is de tweede hoogste oorzaak van kanker sterfgevallen onder vrouwen in ontwikkelde landen wereldwijd⁵. Borstkanker is afkomstig van leidingen of melkklieren die bestaan uit een of meer lagen van epitheliale cellen. In de normale borst houden de epitheliale cellen aan elkaar en aan het membraan van de kelder door membraaneiwitten zoals E-cadherine en integrins⁶. Echter, invasieve borstkankercellen hebben verloren hun polariteit en cel-cel adhesie, klassiek ondergaan epitheliale mesenchymale overgang (EMT) en krijgen de mogelijkheid om te verplaatsen. Na extravasation, deze cellen bewegen over de extracellulaire matrix (ECM) en voer het bloedvat of het lymfestelsel, dan gevolgd door intravasation en metastatische groei⁷. Inzicht in de mechanismen waarmee dit gebeurt is van groot belang, aangezien metastase de meest voorkomende oorzaak van kanker-gerelateerde sterfte is en nauw aan kanker verwant is cel migratie/invasie. Om te visualiseren het verkeer van kankercellen, zijn migratie en invasie testen ideale modellen te bestuderen van 2D- en 3D-beweging van de cel, respectievelijk. Migratie beoordeelt rechtstreeks de beweging van de cellen overwegende dat invasie interactie met de communicatie en het vermogen vereist om degraderen biologische barrières. De twee processen zijn niet volledig onafhankelijk van elkaar, zoals migratie een eis van de invasie is.

Verschillende methoden hebben ontwikkeld om te bestuderen van migratie en invasie. Als herzien door Kramer et al., migratie testen zoals de wondgenezing, hek en micro-carrier vitrotests genereren een cel-vrije zone zodat cellen verplaatsen naar, beoordeling van de verandering van ruimte; Overwegende dat, met het testen van transwell en capillair zijn gebaseerd op het aantal cellen dat bewegen in de richting een lokstof⁸. Voor invasie testen, heeft een ECM-omgeving worden opgezet met ECM gel of collageen bijvoorbeeld, en 3D-beweging kan worden geëvalueerd door het toezicht op de invasie gebied, afstand en cel graven (bijvoorbeeld transwell-assay, platypus assay)⁸. Een ander soort invasie assay is het combineren van de invasieve cellen met niet-invasieve cellen en beoordelen van het gedrag van de invasieve cellen (bijvoorbeeld sferoïde testen). De bovenstaande methoden hebben hun voors en tegens, en een manier die gemakkelijk te aanpak, gemakkelijk te herhalen en te combineren van de bepaling van de migratie en invasie assay in een soortgelijke werkstroom is preferentieel proefopzet.

Dit protocol beschrijft de meting van cel migratie en invasie met behulp van een live-cel imager. Het is een real-time cel bewakingssysteem geïnstalleerd in een standaard cel cultuur incubator. Duurt het high definition-beelden volgens de set scannen intervallen en metingen door passende maskers toe te passen aan de cellen of fluorescerende doelen. De module van migratie/invasie bepaling bevat gereedschap 96-pins kras, die geschikt is voor het maken van homogene kras wonden op een cel enkelgelaagde in een 96-wells-plaat. Het mechanisme is gebaseerd op in vitro wond genezing testen, monitoring van 2D cel verkeer op een plastic of gecoate oppervlak. Invasie of 3D-beweging over een extra ECM binnen de kras wond kan ook worden beoordeeld. Een korte workflow wordt geïllustreerd in Figuur 1.

Protocol

Opmerking: Twee cellijnen moeten afzonderlijk worden behandeld. De volgende procedures moeten worden toegepast op één enkele cel regel als niet wordt opgegeven.

1. Optimaliseer celdichtheid voorafgaand aan verwonding

1. Cultuur Adherente cellen in T75 cm² weefselkweek kolven tot ongeveer 80% samenvloeiing in fenol-rood gratis Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), 200 mM L-glutamine en 2 µg/mL insuline bij 37 ° C met 5% CO₂ () standaard incubatieomstandigheden voor meeste kanker cellijnen, cultuur formuleringen zijn cel lijn-afhankelijk).
2. Verwijder het medium van de cultuur door pipetteren af in een afvalcontainer. Pipetteer 2 mL 0,1% voorverwarmde trypsine-EDTA te kort de cel enkelgelaagde en Pipetteer af te spoelen. Voeg een andere 2 mL 0,1% trypsine-EDTA en plaats de erlenmeyer onder standaard incubatieomstandigheden bij 37 ° C gedurende 5 minuten.
3. Tik zachtjes op de kolf zodanig detachement van de cellen en voeg vervolgens 10 mL voorverwarmde voedingsbodems om te stoppen met de Proteolytische reactie.
4. Breng de celsuspensie in een centrifuge tube van 15 mL en de spin naar beneden bij 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT). Verwijder het supernatant zonder schudden van de cel pellet voorzichtig en resuspendeer met een ander 10 mL voorverwarmde voedingsbodems.

2. het tellen van het aantal cellen met behulp van een geautomatiseerde cel teller (of tellen methoden)

1. Verdunde 200 µL geresuspendeerde celsuspensie met 800 µL 1 x Dulbecco van fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) in een centrifugebuis 1,5 mL.
2. Hechten van een 60 µm sensor voor de telling van de cel naar de cel teller, houdt u de knevel en samenvoegen van de tip tot de celsuspensie. Langzaam pas vrij op de knevel van de celsuspensie met succes wordt getekend in de sensor. Concentratie van de cel wordt weergegeven in cellen/mL.
3. Bereken het aantal cellen in de 10 mL celsuspensie.

3. cel Plating

1. Plaat cellen in een bereik van cel dichtheden (40.000-90.000 cellen per putje) in drievoud in een 96-wells-plaat.
2. Plaats de plaat in de live-cel imager en plannen scannen elke 2 h gedurende 24 uur.
   1. In de software, klikt u op schema scandering van het taakoverzicht. Klik in het deelvenster lade setup bepaalt u de positie van de plaat en klik op toevoegen schip Kies de plaat type. Kies in het deelvenster Scan Setup of de scan patroon volgens de experimentele plaat-instellingen bewerken en Type Scan instellen als standaard.
   2. Klik met de rechtermuisknop op de tijdlijn en selecteer Instellen intervallen. Ingesteld Scant elke toevoegen op 2 h op een schema van 24 uur. Klik op toepassen.

4. bepalen van de optimale cel dichtheid voor de migratie Assay zaaien

1. Stop scannen na 24 h, toepassen van de samenvloeiing verwerking analysehulpprogramma aan de HD-fase contrast beelden automatisch verzamelde en genereren een cel proliferatie curve tegen de klok.
   1. Bepalen van 3-6 representatieve beelden en plaats ze in een nieuwe Foto collectie.
   2. Een juiste masker bepalen als Verwerking definitie.
   3. Start een job analyse.
   4. Bepalen van geoptimaliseerde celdichtheid volgens samenvloeiing tegen tijd (ongeveer 100% samenvloeiing binnen 6-18 h afhankelijk van wanneer de bepaling van de migratie begint).
      Opmerking: De hoeveelheid tijd die nodig is om de cellen groeien tot samenvloeiing varieert afhankelijk van de seeding verdunning.

5. de dagen 1 en 2: voorbereiding van migratie en invasie Assays

1. Jas op dag 1, de plaat voor invasie assay.
   Opmerking: ECM gel moet altijd worden behandeld op ijs en met tips die 's nachts in de koelkast hebt gelegd.
   1. Verdun ECM gel met ijskoude voedingsbodems tot 100 µg/mL en voeg 50 µL van verdunde ECM gel/media in aangewezen wells.
   2. Plaats de plaat duikt met standaard incubatieomstandigheden overnachting.
2. Op dag 2, moet u voorzichtig de overtollige media gecombineerd. Cellen met geoptimaliseerde cel dichtheden in 2 96-wells-platen aangewezen voor de migratie assay (gestreken) en de bepaling van de invasie in triplicates na secties 1-3 (gecoate) plaat in de late namiddag (in het huidige protocol, geoptimaliseerde seeding dichtheden voor ZR75-1 en MDA-MB-231 waren 90.000 per putje en 50.000 per putje, respectievelijk).
3. Plaats de platen op standaard incubatieomstandigheden 's nachts.

6. dag 3: Wond Scratch

1. Spuiten en veeg de kras tool en 2 boten met 70% ethanol wassen alvorens ze in de bioveiligheid kabinet. Vul de boot wassen 1en 2 respectievelijk met precies 45 mL steriele (gesteriliseerde met autoclaaf) gedestilleerd water en 70% ethanol.
2. Voor sterilisatie, plaatst u het hulpmiddel van de kras pin blok (boven) op de boot 1 en 2 voor elke 5 minuten wassen.
3. Start met de migratie assay plaat.
   1. Verplaatsen van de plaat met cellen uit de incubator en zorg ervoor dat geen goed droog zijn om schade van de kras tool te voorkomen. Verwijder het klepje van de plaat en plaats in de kaarthouder van de grondplaat van de kras tool, en zorgvuldig plaats het bovenste gedeelte op het basisartikel door het begeleiden van stokjes. Houd de zwarte hendel, en ondertussen trek voorzichtig het pin-blok. Hiaten in elk putje zijn meestal zichtbaar met het blote oog en onder de Microscoop.
   2. Snel genieten van de pinnen in water; Dit is voldoende om het reinigen van de kras instrument voorafgaand aan de invasie assay plaat krassen als plaat setup identiek is. Anders, herhaal de sterilisatie met steriel gedistilleerd water en vervolgens 70% ethanol voor elke 5 min.
4. Wash de plaat 1 of 2 keer met voorverwarmde voedingsbodems te vermijden vrijstaande cellen of cel vellen ontkoppeld naar de waterput.
5. Voeg 100 µL van verse warme media in aangewezen putten met of zonder behandelingen.
6. Aanvullende stappen voor invasie assay.
   1. Plaats de invasie assay plaat bij 4 ° C gedurende 5 min equilibreer en zorgvuldig gecombineerd de koude media.
   2. Verdun ECM gel met ijskoude voedingsbodems tot 5 mg/mL, voeg 50 µL van verdunde ECM gel in aangewezen wells, en plaats onder standaard incubatie gedurende 30 min.
   3. Voeg 100 µL van opgewarmde media met of zonder het testen van verbindingen.
7. Plaats de plaat in live-cel imager en laat het equilibreer gedurende 5 min. Kies Type vaartuig als imagelock plaat. Type Scan instellen als Scratch wond, kiezen of Scan patroon bewerken basis van de configuratie van de experimentele plaat (1 beeld per putje en breed modus) en plannen van de 24 uur herhalen scannen elke 1-2 h gedurende 72 uur totdat de wonden worden geheeld.
8. Voor de reiniging van de kras tool, zet de bovenste pin blok in elk van de volgende oplossingen (45 mL in boten wassen) voor 5 min: 0,5% wasmiddel 1 (Zie Tabel of Materials), 1% wasmiddel 2 (Zie Tabel of Materials), steriel gedistilleerd water en 70% ethanol. Plaatst u de kras gereedschap terug op de grondplaat en winkel in een stofvrije omgeving.

7. de gegevensanalyse

1. Stopzetten van het scannen van de aangewezen plaat, nadat alle wonden zijn geheeld door de experimentele plaat op de Lade Setup te kiezen en te klikken op Verwijderen vaartuig.
2. Verzamelen van 3-6 representatieve beelden verspreid over een aantal goede percentages, met inbegrip van beelden recht nadat de wond is aangebracht, wond sluiting met 10% en 50%.
3. Om te bepalen van de definitie van een goede verwerking, Segmentatie aanpassing, opruimen en Filters gebruiken passende Scratch wond masker en Confluence maskertoe te passen. Voorbeeld lopende/all gebruiken om te bekijken de nauwkeurigheid van de maskers.
4. Starten van de analyse-baan.
5. Gegevens kunnen worden geanalyseerd vanuit de software of geëxporteerd voor nadere analyse. Drie statistieken verstrekt door de software kan worden gebruikt voor het evalueren van de HD-fase beelden: wond breedte (µm), wond samenvloeiing (%) en de wond van de relatieve dichtheid (%). Vergelijkingen zal in de volgende sectie worden besproken.

Results

Deze migratie/invasie assay is gebaseerd op de wond genezing assay, die resulteert in het tarief van de cellen verplaatsen in een cel-vrije zone gemaakt door de 96-pins kras tool. Het verschil tussen de migratie en invasie testen zijn dat migratie testen maatstafcellen bewegen op de Weefselkweek behandeld kunststof oppervlak en invasie maatregelen cellen verplaatst naar een ECM gel.

De kras tool is ontworpen om consistent kras w...

Discussion

Migratie en invasie zijn belangrijke parameters voor de beoordeling van de mobiliteit van kankercellen. Met behulp van de 96-pins kras tool, is het mogelijk om uit te voeren van de wond genezing testen in 2D en 3D gelijktijdig. Naast het vergemakkelijken van automatisch scannen, een stabiele cel cultuur omgeving met minimale verstoring, de kras bepaling uitgevoerd met gebruikmaking van de 96-pins kras tool biedt consistente kras wonden, inschakelen van experimenten die robuuster en reproduceerbaar. De 96-wells-plaat form...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% trypsin-EDTA oplossing (10x)	ThermoFisher Scientific	30028-02	Verdunnen tot 2x in DPBS
Countess II FL Geautomatiseerde Celteller	ThermoFisher Scientific	AMQAX1000	Geautomatiseerde celteller
Detergent 1 (Alconox)	Sigma-Aldrich	242985	0.5% werkconcentratie
Detergent 2 (Virkon S)	VetProduct DIRECT		1% werkconcentratie
Dulbecco’s Gemodificeerd Eagle Medium, zonder fenol-rood	ThermoFisher Scientific	21063-045	Aangevuld met 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 μg/ml insuline
ECM Gel (matrigel)	Sigma-Aldrich	E6909	Groeifactor gereduceerd, fenol rood vrij
Essen ImageLock 96-well plaat, platte bodem	Essen	4379
EVE Telslides	BioTools	EVS-50
Fetaal bovien serum (FBS)	Bovogen Biologicals	SFBS-F-500ml
IncuCyte 96-well kraswond celinvasie accessoires	Essen	4444	Inclusief CoolBox, 2x CoolSink
IncuCyte Celmigratie kit	Essen	4493	Inclusief de 96-well pin block, 2x wasboten en de software
IncuCyte ZOOM	Essen		Live celanalyse systeem
Insulin oplossing humaan	Sigma-Aldrich	19278-5ML
L-glutamine oplossing (100x)	ThermoFisher Scientific	25030-091
Weefselkweekkolf, 75 cm2 groeioppervlak	Greiner Bio-One	658175