Een muismodel van cerebrale ischemie-reperfusie is gevestigd te onderzoeken de pathofysiologie van een beroerte. We distally de rechts midden cerebrale slagader en rechts gemeenschappelijke halsslagader afbinden en bloedstroom herstellen na 10 of 40 min van ischemie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Muismodel van twee-schip occlusie van cerebrale ischemie-reperfusie
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
In deze studie is een middelste cerebrale slagader (MCA) occlusie muismodel aangewend om te studeren van cerebrale ischemie-reperfusie. Een reproduceerbare en betrouwbare muismodel is nuttig voor onderzoek naar de pathofysiologie van cerebrale ischemie-reperfusie en het bepalen van mogelijke therapeutische strategieën voor patiënten met een beroerte. Variaties in de anatomie van de cirkel van Willis van C57BL/6 muizen beïnvloedt hun infarct volume na cerebrale ischemie-veroorzaakte schade. Studies hebben aangegeven dat distale MCA occlusie (MCAO) kan dit probleem te verhelpen en leiden tot een stabiele infarct grootte. In deze studie stellen wij een muismodel van de twee-schip occlusie van cerebrale ischemie-reperfusie door de onderbreking van de bloedtoevoer naar de juiste MCA. Wij distally afbinden de juiste MCA en rechts gemeenschappelijke halsslagader (CCA) en doorbloeding te herstellen na een bepaalde periode van ischemie. Deze verwonding ischemie-reperfusie induceert een infarct van stabiele grootte en een gedrags tekort. Perifere immuuncellen infiltreren de ischemische hersenen binnen de 24u infiltratie periode. Daarnaast is de neuronale verlies in de corticale gebied minder voor een langere duur van de reperfusie. Dit twee-schip occlusie model is daarom geschikt voor het onderzoeken van de immuunrespons en neuronale herstel binnen de periode van de reperfusie na cerebrale ischemie.
Inleiding
De cerebrale ischemie-reperfusie muismodel is één van de meest gebruikte experimentele benaderingen voor het onderzoek naar de pathofysiologie van hersenen ischemie-veroorzaakte schade1. Omdat cerebrale ischemie-reperfusie het perifere immuunsysteem activeert, perifere immuuncellen infiltreren in de ischemische hersenen en neuronale schade2veroorzaken. Dus, een betrouwbare en reproduceerbare muismodel dat cerebrale ischemie-reperfusie nabootst is vereist voor het begrijpen van de pathofysiologie van een beroerte.
C57BL/6J (B6) muizen zijn de meest gebruikte stam in lijn experimenten omdat ze kunnen gemakkelijk genetisch gemanipuleerd worden. Twee gemeenschappelijke modellen van MCAO/reperfusie die de toestand van cerebrale ischemie-reperfusie na te bootsen zijn verkrijgbaar. De eerste is de intraluminale gloeidraad model van proximale MCAO, waar een gloeidraad silicon beklede werkzaam is aan intravascularly occlude de bloedstroom in de MCA; de occluding gloeidraad wordt daarna verwijderd om te herstellen van de bloed stroom3. De duur van een korte occlusie resulteert in een laesie van de subcorticale regio, overwegende dat een langere duur van de occlusie infarcten in de corticale en subcorticale gebieden veroorzaakt. Het tweede model is het model van de afbinding van distale MCAO, waarbij extravascular Afbinding van de MCA en CCA te verminderen van de doorbloeding van het MCA, waarna de bloedstroom door de verwijdering van de hechtdraad en aneurysma clip4wordt hersteld. In dit model een infarct wordt veroorzaakt in de corticale gebieden, en het sterftecijfer is laag. Omdat de afbinding van MCAO/reperfusie model craniectomy om de site van de distale MCA bloot te stellen vereist, de site gemakkelijk kan worden bevestigd, en onderzoekt de bloedstroom in de distale MCA wordt verstoord tijdens de procedure is eenvoudig.
B6 muizen vertonen aanzienlijke verschillen in de anatomie van de cirkel van Willis; Dit kan gevolgen hebben voor het volume van de infarct na cerebrale ischemie-reperfusie5,6,7. Op dit moment kan dit probleem worden overwonnen door middel van afbinding van de distale MCA-8. In deze studie stellen we een methode voor de doorbloeding van MCA occluding en het inschakelen van reperfusie na een vooraf bepaalde periode van ischemie. Twee-schip occlusie van de cerebrale ischemie-reperfusie model induceert voorbijgaande ischemie van het grondgebied van de MCA via Afbinding van de juiste distale MCA en de juiste CCA, met bloedstroom hersteld na een bepaalde periode van ischemie. Dit model MCAO/reperfusie induceert een infarct van stabiele omvang, een bulk van hersenen-infiltreren immuuncellen in het ischemische hersenen en een gedrags tekort na cerebrale ischemie-reperfusie4.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De verzorging van de dieren van de institutionele en gebruik commissies van de Academia Sinica en Taipei Medizinische Universität goedgekeurd dit protocol voor het gebruik van proefdieren.
1. MCAO/reperfusie model
- De muizen voorzien van gratis toegang tot water en chow tot de operatie.
- Autoclaaf de chirurgische instrumenten en zuiveren van de operatie tafel en apparatuur met behulp van 70% ethanol. Het dragen van een chirurgisch masker en steriele handschoenen. Gebruik een droge kraal sterilisator om resterilize van de chirurgische instrumenten als veelvoudige chirurgie van de muis in één experiment plaatsvinden zal.
- Anesthetize van een 8 - tot 12-weken oude muis (massa: 25 – 30 g) met behulp van 0,8% chloraalhydraat, via een intraperitoneale injectie. Zorg ervoor dat de narcose muis beschikt niet over een pedaal reflex (zoals getest met behulp van een stevige teen snuifje) na de afstomping.
- Gebruik maken van dierenarts zalf om te voorkomen dat de droogheid van de ogen voor de muis, terwijl het onder verdoving.
- Een noninvasive bloeddruk-systeem gebruiken om te controleren de bloeddruk van de muis.
- Gebruik een fysiologische monitoring systeem om de rectale temperatuur en de arteriële bloed gassen te controleren. Handhaven van de lichaamstemperatuur bij 36.5 ± 0,5 ° C.
- Subcutaan injecteren de muis met een profylactische antibiotica (25 mg/kg cefazolin)8.
- Plaats de muis op de liggende positie van de verwarming pad.
- Met elektrische tondeuse waarmee werkmapberekeningen van de huid door het scheren van de vacht van de muis op de ventrale nek regio, alsmede in de regio tussen het rechter oog en het rechter oor.
- Gebruik epileren crème om te wissen van de vacht van de muis van lichaam en desinfecteren van de chirurgische site afwisselend scrbus met povidione-jodium en 70% ethanol.
- Gebruik iris schaar te snijden een middellijn van 1 cm lange incisie aan de nek.
- Iris pincet gebruiken zorgvuldig ontleden de CCA vrij van de vagus zenuwen zonder lichamelijk letsel opleveren.
- Gebruik 5-0 zijde hechtingen te isoleren van de CCA.
- Maak een incisie 0.3 cm in de hoofdhuid op het middelpunt tussen het rechter oog en het rechter oor.
- Gebruik microscissors te snijden van de musculus temporalis om de buccale en squamosal bot bloot te stellen.
- Onder een stereomicroscoop ontleden, kunt een microdrill maken een 2 mm diameter gat direct boven de rechterkant distale MCA.
- De kofferbak van de rechterkant distale MCA met behulp van een 10-0 hechtdraad afbinden.
- Occlude de rechterkant CCA met behulp van een nontraumatic aneurysma clip.
- Na 10 of 40 min van ischemie, verwijder het aneurysma clips en hechtdraad om te herstellen van de bloedstroom naar de MCA en CCA.
- Een clip van de hechtdraad gebruikt voor het afdichten van de huid incisie op het hoofd.
- Verzegel de sneden van de cervicale huid met behulp van een enkele hechtdraad, gevolgd door het sluiten van de nek huid met hechtdraad of stapelvezels9.
- Subcutaan injecteren buprenorfine (0,1 mg/kg) voor pijn verlichting9.
- Handhaven van de lichaamstemperatuur van de muis bij 36.5 ± 0,5 ° C op de verwarming pad totdat het volledig is hersteld van de narcose. Niet de terugkeer het dier dat heeft ondergaan chirurgie aan het gezelschap van andere dieren tot het volledig is hersteld. Laat niet het dier zonder toezicht totdat het voldoende bewustzijn herwint.
- Plaatst u de muisaanwijzer in de gesteriliseerde met autoclaaf kooi zodat het kan vrij toegang water tot en chow nadat het volledig is hersteld.
2. kleuring met 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride
- Anesthetize de muis met 0,8% Chloraalhydraat via een intraperitoneale injectie.
- Operationele schaar gebruiken om het dier te onthoofden.
- Bloot de schedel met behulp van iris schaar te maken van een incisie in de huid van het hoofd.
- Het gebruik van operationele schaar te snijden de anterior van de voorhoofdsbeen.
- Gebruik iris schaar te snijden van de schedel langs de Sagittaal hechtdraad.
- Gebruik een bot rongeur terzijde schuiven de frontale en het bot van de pariëtale en het blootstellen van de hersenen.
- Iris pincet gebruiken om te ontleden van de hersenen.
- Gebruik een muis hersenen matrix en Scheermesjes verkrijgen van coronale plakjes van 2 mm.
- De segmenten van de hersenen gedurende 10 minuten bij 37 ° C met 2% 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) in 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing vlek.
- Spoel de hersenen 2 x met 10% formaline.
- Het vaststellen van de hersenen in 10% formaline bij kamertemperatuur gedurende 24 uur.
3. meting van de grootte van het infarct
- Regelen van de secties op een schone plastic dia en de secties van rostraal aan caudal oriënteren.
- Scan de dia met behulp van een scanner. Plaats een metrische liniaal en zorg ervoor dat het is zichtbaar in de gescande afbeelding. De dia flipover en scannen van de achterzijde.
- Bereken de oppervlakte van het infarct van elke sectie ImageJ softwarematig.
- Open het afbeeldingsbestand en stel de schaal van de afbeelding.
- U kunt freehand selectie gebruiken om het infarct gebied te selecteren.
- De regio's van belang (ROI) manager gebruiken voor het meten van het interessegebied.
- Som van het infarct gebieden voor elke sectie en vermenigvuldig het resultaat met de dikte van de sectie te schatten van de omvang van de totale infarct.
4. statistische analyse
- GraphPad prisma 6 gebruikt om te bepalen van de statistische significantie van de Student t-test.
Opmerking: De foutbalken op de staafdiagrammen vertegenwoordigen standaardfouten van de gemiddelde (SEMs). - Gebruik G * Power 3.1 de juiste steekproefomvang te berekenen en het uitvoeren van een macht analyse10.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Deze MCAO/reperfusie-procedure een corticale infarct in de nabijheid van de juiste MCA geproduceerd en veroorzaakt een gedrags tekort. Verschillende graden van ischemie-veroorzaakte infarct volume (figuur 1AB) en neuronale verlies (Figuur 1 cD) ontstonden in de hersenschors voor de juiste MCA-omgeving via een toename van de duur van de afbinding. Deze MCAO/reperfusie schade daalde de motorische a...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De muismodel van MCAO/reperfusie is een dierlijk model vaak werkzaam na te bootsen voorbijgaande ischemie bij de mens. Deze diermodel kan worden toegepast op transgene en knockout muizen stammen te onderzoeken de pathofysiologie van een beroerte. Verschillende stappen in het protocol staan vooral kritisch tegenover. (1) de microdrill moet zorgvuldig worden gebruikt bij het maken van een gat in de schedel, met ongepaste actie veroorzaakt gemakkelijk bloeden uit de MCA. (2) het MCA moet niet worden beschadigd, en bloeden m...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door het ministerie van wetenschap en technologie, Taiwan (meest 106-2320-B-038-024, de meeste 105-2221-E-038-007-MY3 en meest 104-2320-B-424-001) en Taipei Medical University Hospital (107TMUH-SP-01). Dit manuscript werd uitgegeven door Wallace academische bewerken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Bone rongeur | Diener | Friedman | |
| Buprenorfine | Sigma | B-044 | |
| Cefazolin | Sigma | 1097603 | |
| Chloraalhydraat | Sigma | C8383 | |
| Dissectiemicroscoop | Nikon | SMZ-745 | |
| Elektrische tondeuses | Petpro | ||
| 10% formaline | Sigma | F5304 | |
| Germinator drogbeade sterilisator | Braintree Scientific | ||
| Iristang | Karl Klappenecker | 10 cm | |
| Irisschaar | Diener | 9 cm | |
| Irisschaar STR | Karl Klappenecker | 11 cm | |
| Microboor | Stoelting | FOREEDOM K.1070 | |
| Micro-schaar-Vannas | HEISS | H-4240 | blad 7mm, 8 cm |
| Muisbreinmatrix | World Precision Instruments | ||
| Niet-invasief bloeddruksysteem | Muromachi | MK-2000ST | |
| Operatieschaar STR | Karl Klappenecker | 14 cm | |
| Fysiologisch monitoringsysteem | Harvard Apparatus | ||
| Scheermessen | Ever-Ready | ||
| Stoelting knaagdierverwarmers | Stoelting | 53810 | Verwarmingskussen |
| Hechtklem | Stoelting | ||
| Pincet | IDEALTEK | Nr. 3 | |
| Vetbond | 3M | 15672 | Chirurgisch lijm |
| 10-0 hechtdraad | UNIK | NT0410 | |
| 2,3,5-Trifenyltetrazoliumchloride | Sigma | T8877 |
Referenties
- Woodruff, T. M., et al. Pathophysiology, treatment, and animal and cellular models of human ischemic stroke. Molecular Neurodegeneration. 6 (1), 11(2011).
- Chamorro, A., et al. The immunology of acute stroke. Nature Reviews. Neurology. 8 (7), 401-410 (2012).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - Middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments. (47), e2423(2011).
- Lee, G. A., et al. Interleukin 15 blockade protects the brain from cerebral ischemia-reperfusion injury. Brain, Behavior, and Immunity. 73, 562-570 (2018).
- Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 13 (4), 683-692 (1993).
- Kitagawa, K., et al. Cerebral ischemia after bilateral carotid artery occlusion and intraluminal suture occlusion in mice: evaluation of the patency of the posterior communicating artery. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 18 (5), 570-579 (1998).
- Wellons, J. C. 3rd, et al. A comparison of strain-related susceptibility in two murine recovery models of global cerebral ischemia. Brain Research. 868 (1), 14-21 (2000).
- Doyle, K. P., Fathali, N., Siddiqui, M. R., Buckwalter, M. S. Distal hypoxic stroke: a new mouse model of stroke with high throughput, low variability and a quantifiable functional deficit. Journal of Neuroscience Methods. 207 (1), 31-40 (2012).
- Doyle, K. P., Buckwalter, M. S. A mouse model of permanent focal ischemia: Distal middle cerebral artery occlusion. Methods in Molecular Biology. , 103-110 (2014).
- Wayman, C., et al. Performing Permanent Distal Middle Cerebral with Common Carotid Artery Occlusion in Aged Rats to Study Cortical Ischemia with Sustained Disability. Journal Of Visualized Experiments. (108), e53106(2016).
- Noor, R., Wang, C. X., Shuaib, A. Effects of hyperthermia on infarct volume in focal embolic model of cerebral ischemia in rats. Neuroscience Letters. 349 (2), 130-132 (2003).
- Florian, B., et al. Long-term hypothermia reduces infarct volume in aged rats after focal ischemia. Neuroscience Letters. 438 (2), 180-185 (2008).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx: The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2 (3), 396-409 (2005).
- Lin, T. N., Te, J., Huang, H. C., Chi, S. I., Hsu, C. Y. Prolongation and enhancement of postischemic c-fos expression after fasting. Stroke. 28 (2), 412-418 (1997).
- Glazier, S. S., O'Rourke, D. M., Graham, D. I., Welsh, F. A. Induction of ischemic tolerance following brief focal ischemia in rat brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 14 (4), 545-553 (1994).
- Tachibana, M., et al. Early Reperfusion After Brain Ischemia Has Beneficial Effects Beyond Rescuing Neurons. Stroke. 48 (8), 2222-2230 (2017).
- Gan, Y., et al. Ischemic neurons recruit natural killer cells that accelerate brain infarction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (7), 2704-2709 (2014).
- Li, M., et al. Astrocyte-derived interleukin-15 exacerbates ischemic brain injury via propagation of cellular immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (3), E396-E405 (2017).
- Wang, S., Zhang, H., Dai, X., Sealock, R., Faber, J. E. Genetic architecture underlying variation in extent and remodeling of the collateral circulation. Circulation Research. 107 (4), (2010).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
