Methodenartikel

Verbetering van de extrusie van de hoge viscositeit van Microcrystals voor Time-resolved seriële femtoseconde kristallografie aan X-ray Lasers

DOI:

10.3791/59087

⸱

28 februari 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Biology and Chemistry - Laboratory for Biomolecular Research, Paul Scherrer Institut, 2Photon Science Division - SwissFEL, Paul Scherrer Institut, 3RIKEN SPring-8 Center, 4Department of Cell Biology, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 5Department of Biology, ETH Zürich

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het succes van een time-resolved seriële femtoseconde kristallografie experiment is afhankelijk van efficiënte monster levering. We beschrijven hier protocollen voor het optimaliseren van de extrusie van de bacteriorhodopsin microcrystals van een hoge viscositeit micro-extrusie injector. De methodologie steunt op monster homogenisering met een roman drieweg koppelstuk en visualisatie met een high-speed camera.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dikvloeibaar micro-extrusie injectoren gedaald dramatisch monster consumptie in seriële femtoseconde kristallografische experimenten (SFX) op X-ray vrije elektron lasers (XFELs). Een reeks van experimenten met behulp van de licht-gedreven proton pomp bacteriorhodopsin hebben verder deze injectoren opgericht als een voorkeursoptie te leveren crystals voor seriële femtoseconde time-resolved kristallografie (TR-SFX) voor het oplossen van de structurele veranderingen van eiwitten na photoactivation. Voor het verkrijgen van meerdere structurele momentopnamen van hoge kwaliteit, is het noodzakelijk te verzamelen van grote hoeveelheden gegevens en Goedkeuringvande kristallen tussen elke pomp laser impuls zorgen. Hier beschrijven we in detail hoe we de extrusie van de bacteriorhodopsin microcrystals geoptimaliseerd voor onze recente TR-SFX experimenten op de Linac Coherent licht bron (LCLS). Het doel van de methode is voor het optimaliseren van 3D-effect voor een stabiele en continue stroom terwijl het handhaven van een hoge dichtheid van kristallen het percentage te verhogen op welke gegevens kunnen worden verzameld in een TR-SFX experimenteren. We bereiken dit doel door het opstellen van lipidic kubieke fase met een homogene verdeling van kristallen met behulp van een roman drieweg spuit koppelinrichting gevolgd door aanpassing van de samenstelling van de steekproef op basis van metingen van de stabiliteit van de extrusie genomen met een high-speed de set-up van de camera. De methode kan worden aangepast aan het optimaliseren van de stroom van andere microcrystals. De setup zal beschikbaar zijn voor gebruikers van de nieuwe faciliteit van de Zwitserse vrije elektron Laser.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Seriële femtoseconde kristallografie (SFX) is een structurele biologie-techniek die gebruik maakt van de unieke eigenschappen van X-ray vrije elektron lasers (XFEL) om te bepalen van de kamertemperatuur structuren uit duizenden kristallen micrometer en middelgrote terwijl outrunning allermeest de schade door straling door de "diffractie vóór vernietiging" beginsel1,2,3.

In een tijd-resolved uitbreiding van SFX (TR-SFX), worden de pulsen van de femtoseconde van de XFEL gebruikt voor het bestuderen van structurele veranderingen in de eiwitten4,5. De proteïne van belang wordt geactiveerd met een optische laser (of een andere activiteit-trigger) vlak voor neergeschoten door de XFEL in een pomp-sonde setup. Door het juist beheersen van de vertraging tussen de pomp en sonde pulsen, kan de doel-eiwit worden vastgelegd in verschillende Staten. Moleculaire films van structurele veranderingen over elf ordes van grootte in tijd tonen de kracht van de nieuwe XFEL-bronnen te bestuderen van de dynamiek van verschillende eiwitten doelen6,7,8,9, 10,11,12,13. Hoofdzakelijk, voegt de methode het dynamische spectroscopische en statische structurele technieken tot een, waardoor een glimp in eiwit dynamiek in de buurt van atomaire resolutie.

Eenvoudige systemen voor TR-SFX kunnen bevatten een endogene trekker van activering met een lichtgevoelig component zoals retinal in109,bacteriorhodopsin (bR), de chromophores in Fotosysteem II12,13, photoactive gele eiwit (PYP)6,7 omkeerbaar photoswitchable TL proteïne11, of een photolyzable koolmonoxide in myoglobine8. Spannende varianten van de techniek nog in ontwikkeling zijn afhankelijk van de mix en injecteren regelingen14,15 te studeren enzymatische reacties of een elektrisch veld gebruikt voor het opwekken van structurele veranderingen16. Gezien het feit dat XFEL bronnen alleen beschikbaar voor een paar jaar zijn en extrapoleren verleden successen in de toekomst, de methode potentieel als een echte game-wisselaar met betrekking tot ons begrip van hoe toont eiwitten functie.

Omdat biologische monsters worden vernietigd door een eenmalige blootstelling aan een hoogvermogen XFEL pulse, waren nieuwe benaderingen van eiwit kristallografie noodzakelijk. Onder deze procedures moest de mogelijkheid om te groeien van grote hoeveelheden van uniforme microcrystals ontwikkelde17,18,19. Opdat het verzamelen van de gegevens op een XFEL, moeten deze kristallen worden geleverd, verwijderd en vervolgens vernieuwd voor elke XFEL pulse. Gezien het feit dat XFELs brand bruikbare pulsen bij 10-120 Hz, moet monster levering snel, stabiel en betrouwbaar is, terwijl ook de kristallen intact en beperkend consumptie. Onder de meest succesvolle oplossingen is een hoge viscositeit micro-extrusie injector, die levert een voortdurend streaming kolom van kamertemperatuur crystal-beladen lipidic kubieke fase (LCP) over de gepulste X-ray lichtbundel20. Willekeurig georiënteerde kristallen, ingebed in de LCP-stroom, die worden onderschept door de XFEL pulsen scatter x-stralen op een detector waar een patroon van diffractie is opgenomen. LCP was een natuurlijke keuze voor een monster levering medium zoals het vaak als een groeimedium voor membraan eiwit kristallen17,21,22,23, nog andere informatiedragers hoge viscositeit gebruikt wordt 24,25,26,27,28,29,30 en31 van de oplosbare eiwitten zijn ook gebruikt in de injector. SFX met de hoge viscositeit injector is geslaagd tijdens de structuurbepaling van membraan eiwitten13,32 met inbegrip van G eiwit-gekoppelde receptoren (GPCRs)33,34, 35,,36,,37, met voldoende voor inheemse phasing38,39 terwijl zowel tijd als monster efficiënt de kwaliteit van de gegevens. Momenteel, deze injectoren zijn meer routinematig wordt gebruikt voor metingen van de kamertemperatuur op synchrotron bronnen28,30,40,41 , zowel als bij de meer technisch veeleisende TR-SFX experimenten op XFELs9,10,13,42.

Vergelijkbare TR-SFX experimenten zijn uitgevoerd met behulp van andere types van de injector zoals vloeibare fase levering in een stroom mondstuk6,7,12 gericht, echter deze methode vereist proteïne bedragen niet beschikbaar voor velen biologisch interessante doelen. Voor de bepaling van de statische structuren met behulp van een gemiddeld verbruik van 0.072 mg eiwit per 10.000 geïndexeerde diffractie patronen in vergelijking met 9.35 mg voor de vloeibare jet viskeuze extrusie hebben sproeiers gemeld (dat wil zeggen, ongeveer 130 keer meer monster efficiënt)20. De hoge viscositeit injector is gebleken te zijn van een levensvatbare monster levering apparaat voor TR-SFX terwijl slechts enkele van deze steekproef efficiëntie43te offeren. In Nogly et al. (2018)10, bijvoorbeeld monster verbruik was ongeveer 1,5 mg per 10.000 geïndexeerde patronen, die gunstig in vergelijking met soortgelijke TR-SFX experimenten met behulp van de PYP waar gemiddeld monster verbruik veel hoger bij 74 mg eiwit per 10.000 was geïndexeerde patronen6. Hoge viscositeit injectoren hebben dus duidelijke voordelen wanneer is het beperken van de hoeveelheid eiwit beschikbaar of kristallen worden geteeld rechtstreeks in LCP.

Voor TR-SFX met hoge viscositeit injectoren naar de meest betrouwbare gegevens opleveren diverse technische problemen moeten worden aangepakt: de snelheid van de stroming moet blijven boven een minimale kritische waarde; de hit-tarief moet worden gehandhaafd op een niveau dat niet weer langzaam het verzamelen van de gegevens (bijvoorbeeld meer dan 5%); en monster moet worden geleverd zonder overmatige storingen. Ideaal, deze voorwaarden is al voldaan lang voordat een geplande TR-SFX experiment zo efficiënt mogelijk gebruik van de beschikbare tijd van de XFEL. Pricipally, een vertraging in de LCP-stroom kan toestaan indringende kristallen die waren geactiveerd met meer dan één optische laser puls en resultaat in gemengde actief Staten, of indringende verpompte materiaal wanneer umpumped materiaal in de bundel wordt verwacht. Een bijkomend voordeel van injectie pre-test is dat downtime tijdens het verzamelen van de gegevens op een XFEL wordt geminimaliseerd als tijd gedegradeerd tot vervanging van verstopte spuitstukken, wijzigen uit niet-diepte monsters, en andere onderhoudstaken is verlaagd.

Hier presenteren we een methode voor het optimaliseren van monster levering voor het verzamelen van de gegevens van de TR-SFX met een hoge viscositeit micro-extrusie injector. Voor de eenvoud vertrouw de beschreven methoden niet op toegang tot een bron van X-ray, hoewel werk aan een synchrotron beamline29 zou nadere informatie over verwachte hit tarieven en kristal diffractie. Onze protocollen werden ontwikkeld om experimenten te vangen retinale isomerisatie in de protonpomp bacteriorhodopsin10 te optimaliseren en worden uitgevoerd in twee fasen, te beginnen met de voorbereiding van crystal monsters voor extrusie gevolgd door controle van de extrusie met behulp van een high-speed camera setup. In de eerste fase, wordt de crystal-beladen LCP gemengd met extra LCP, lage overgang temperatuur lipiden of andere additieven om ervoor te zorgen dat het uiteindelijke mengsel is geschikt voor bezorging binnen de voorbeeldomgeving zonder verstopping of vertragen. Een nieuwe drieweg spuit koppelstuk werd ontwikkeld ter verbetering van mengen prestaties en monster homogeniteit. De tweede fase bestaat uit een test van de extrusie opgenomen door een high-speed camera naar de extrusie snelheid stabiliteit rechtstreeks te meten. Na de analyse van de videogegevens, aanpassingen kunnen worden aangebracht bij het protocol van de voorbereiding van monster experimentele resultaten te verbeteren. Deze procedures ter voorbereiding van de andere eiwitten voor TR-SFX gegevensverzameling, met minimale wijzigingen, kunnen worden aangepast en zal bijdragen tot het efficiënte gebruik van de beperkte XFEL beamtime. Met nieuwe voorzieningen van de XFEL net beginnen hun werking44,45 en de overdracht van seriële gegevens injector gebaseerde vergaringsmethoden aan synchrotrons28,30,40,41 , de komende jaren zal zeker blijven spannende nieuwe inzicht verwerven in de structurele dynamica van een ooit-grotere verscheidenheid van eiwit doelen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. eiwitten Crystal monstervoorbereiding

  1. Ongeveer 30 minuten voordat de steekproef is om te worden geïnjecteerd, belasting 50 µL van crystal-beladen monoolein op basis van LCP in een 100 µL spuit.
  2. Voor injectie bij atmosferische druk: Load 10 µL van vloeibare paraffine in de achterkant van een tweede injectiespuit. Houd de injectiespuit verticaal en verdrijven de luchtbellen uit de spuit.
    1. Voor injectie in vacuüm milieu: belasting 5 µL van MAG 7,9 en 5 µL van vloeibare paraffine in de achterkant van een tweede injectiespuit. Houd de injectiespuit verticaal en verdrijven de luchtbellen uit de spuit.
  3. Verbinding maken met de spuit met paraffine/MAG 7,9 tot een standaard spuit koppelstuk, zuiveren de lucht van het voorste koppelingsvlak door zachtjes op de zuiger te drukken, totdat een klein volume (< 1 µL) van paraffine/lipide is zichtbaar op het puntje van de voorste koppelingsvlak naald.
  4. De monster spuit verbinden met de spuit koppelstuk, verzorgen om niet alle lucht in het monster. Meng in de lipide/paraffine door het passeren van het monstermateriaal door het voorste koppelingsvlak meerdere keren.
  5. 20 µL van voorgemengde LCP (27% PEG, 100 mM Sorensen pH 5.6 + MO) in een andere 100 µL spuit laden. Luchtbellen desgewenst verwijderen.
  6. De lege spuit uit de koppeling verwijderen en de voorgemengde LCP hechten aan het kristal met spuit met behulp van een standaard spuit koppelstuk. Het doorgeven van het monster door het voorste koppelingsvlak 100 keer.
    Opmerking: Het monster Monster mengen kan warmte iets46. Mengen moet gebeuren in een traag tempo waar de temperatuur van het monster redelijk constant kan worden gehouden.
  7. Inspecteer het monster voor transparantie tegen een bron van licht. Als een duidelijk homogeen LCP heeft gevormd, gaat u naar stap 1.9.
  8. Om het monster in de kubieke fase, voeg 3 µL van monoolein en Meng 50 keer (zoals hierboven beschreven). Herhaal deze procedure enkel tot een transparante fase heeft gevormd om te voorkomen dat een teveel aan monoolein.
    Opmerking: De vorming van de LCP is temperatuur afhankelijk47 en beste resultaten zijn behaald, iets boven de 20 ° C. De hoeveelheid extra monoolein nodig zal afhangen van de hoeveelheid residuele precipitant oplossing van kristallisatie overgedragen.
  9. Als een inleiding testen voor monster stijfheid (zoals verwacht van de LCP fase) en extruderen-vermogen, loskoppelen van de lege spuit uit de spuit koppelstuk en, houd de injectiespuit verticaal en knijp een kleine hoeveelheid monster (< 2 µL) via het voorste koppelingsvlak. Als de geëxtrudeerde steekproef een rechtop cilinder vormt, dan is het monster is klaar voor het testen van de extrusie.
  10. Het totale volume van het monster tot 100 µL aanpassen door het toevoegen van meer voorgemengde LCP (zoals in stap 1.5).
  11. De monster spuit en twee lege injectiespuiten koppelen aan het drieweg spuit voorste koppelingsvlak (het zuiveren van de lucht van het voorste koppelingsvlak als vóór). Mix van ten minste 50 keer (of tot homogene) door het passeren van de helft van het monster in de tweede injectiespuit en drukt u op beide helften van het monster in de derde spuit gelijktijdig.
  12. Plaats de injectiespuit met de gemengd monster onder een stereomicroscoop om te controleren of een homogene verdeling van kristallen.

2. testen monster extrusie met behulp van een High-Speed Camera Setup

  1. Het bepalen van experimentele parameters.
    1. Selecteer de grootte van het mondstuk voor de test.
      Opmerking: Mondstuk maten zijn meestal 50 of 75 µm inwendige diameter (ID), maar elke grootte van ongeveer 30-100 µm ID kan worden beschouwd. Selectie is gebaseerd op een evenwicht tussen de gemiddelde tijd van verstopping, achtergrond verstrooiing, monster consumptie en hit-tarief.
    2. Berekenen van optimale flow snelheid gebaseerd op experimentele laser spot grootte (1/e2 diameter), en de gegevens collectie regeling (bijvoorbeeld afwisselende licht en donker) die wordt gebruikt op de XFEL.
    3. Berekenen van het gewenste debiet (figure-protocol-1) van het monster van de optimale flow snelheid (figure-protocol-2) en de diameter van de geselecteerde mondstuk (figure-protocol-3):
      figure-protocol-4
      Bepalen van de stroomsnelheid (figure-protocol-5) die moeten worden ingevoerd bij de pomp van de HPLC gebaseerd op de amplificatie factor (figure-protocol-6) voor de injector.
      figure-protocol-7
      Berekenen van de maximale druk (figure-protocol-8) van de nominale druk van het mondstuk beslag (figure-protocol-9) en de factor van de versterking van de injector (figure-protocol-10):
      figure-protocol-11
  2. Installatie van de hoge viscositeit extrusie injector voor off line gebruik zoals afgebeeld in Figuur 1.
    Opmerking: De injector functies door middel van hydraulische extrusie aangedreven door een HPLC pump, en gebruikt een mede vloeiende helium gas schede gecontroleerd door een gas regulator. De pomp en regelgever setup worden niet besproken in dit protocol. Zie hoofdstuk vier in James (2015)48 voor een gedetailleerde handleiding.
    1. Zuiveren van de pomp en alle water regels om ervoor te zorgen de debieten kloppen. Leegmaken van de hydraulische fase van de injector.
    2. Monteer de injector (of de camera) op een drie-as podium inlijsten en focus voor de high-speed video's te vergemakkelijken. Laat ruimte rond de injectie punt voor het objectief, verlichting, reflecterende scherm en een klein bekerglas te vangen het afgewerkte monster.
    3. Bouwen van een "dummy mondstuk" (een lege reservoir met een mondstuk aangesloten) en installeer het op de injector om positionering, scherpstelling en belichting.
    4. Monteer de high-speed camera met het uiteinde van het mondstuk in de buurt van het brandpunt van de doelstelling.
    5. Plaats van de reflecterende scherm achter de injector en aanpassen van de verlichting om te voorzijde-licht de verstuiver.
    6. Inschakelen en verbinding maken met de camera met de meegeleverde software. Plaats het mondstuk puntje in het midden van het frame met een live video draait voor visuele feedback, en brengen het in beeld met de drie assen-fase.
    7. Pas de verlichting totdat de verstuiver duidelijk zichtbaar is en de achtergrond gelijkmatig brandt.
  3. Configureren van de camera high-speed time-lapse om video te registreren.
    1. Set framerate tot 1000 fps. Resolutie ingesteld op 512 x 512 pixels.
    2. Met de blootstellingstijd nu ingesteld door de framesnelheid, de verlichting niveau aanpassen totdat de verstuiver zichtbaar is (dat wil zeggen, niet onder- of overbelichte). Verplaats de verstuiver tip zodat het wordt gecentreerd van links naar rechts en ligt in het bovenste derde van het frame.
    3. Elke achtergrondcorrectie of witbalans operaties uitvoeren.
    4. Instellen van de camera in de modus time-lapse. Stel interval in te 30 s en herhaalt tot 40 keer, de trigger-modus instelt op willekeurige (of willekeurige reset) en voer het aantal frames opnemen op de 1000.
  4. Laden van het reservoir met 20 µL van het monster, en bevestig de capillaire mondstuk.
  5. Bevestig het gevuld reservoir aan de injector. Sluit de gasleiding aan de poort op het mondstuk en start van de gasstroom.
  6. Handmatig verder de zuiger door openen van de klep in-lijn en druk op de spuit. Sluit de klep als de zuiger solide contact is met het monster in het reservoir maakt.
  7. Program van de pomp met het berekende debiet en stelt u de maximale druk op de berekende waarde (zie stap 2.1.3).
  8. Start gelijktijdig de pomp en de opname van de camera.
  9. Als de extrusie begint, passen de gasdruk te verhogen stabiliteit. Gasdruk verhogen als de vloeistof een druppel aan het uiteinde van de verstuiver in plaats van een kolom vormt. Daling van de druk wanneer het 3D-effect verbroken als gevolg van buitensporige schuintrekken van de gasstroom wordt, of is snel oscillerende zweepslagen ().
  10. Controleren van de extrusie (10 min is meestal genoeg om te erkennen van een homogene stroming voorwaarde) en wanneer de pompdruk scherp omhoog in de buurt van de verwachte eindtijd opritten, opname stoppen, afsluiten van de pomp, en het systeem onder druk door het openen van de ontlastklep vent.
  11. Analyse van de video-bestanden
    Opmerking: Monster extrusie, dat is duidelijk ontoereikend is niet vereist voor een gedetailleerde analyse. Het is echter nog steeds nuttig om te identificeren van de foutmodus zodat het monster kan worden geoptimaliseerd.
    1. Open het videobestand met de software van de analyse (bijvoorbeeld Fiji49) en kalibreren van de meetinstrumenten.
    2. Kalibreer de metingen door het selecteren van een lijn van bekende lengte in de video afbeelding met het lijngereedschap. Open het venster van de Schaal instellen via analyseren | Stel schaal en voer de bekende afstand en de maateenheden.
      Opmerking: De bekende diameter van de verstuiver voorziet in een toereikende kalibratie lengte deze metingen.
    3. Een frame in de video te vinden waar er een traceerbare functie zichtbaar (bijvoorbeeld een kristal) in het 3D-effect. Record het framenummer.
    4. Verder de video naar een frame waarbij de zelfde eigenschap is zichtbaar, maar is verhuisd van zijn standpunt in de vorige stap. Record het framenummer.
    5. Met behulp van het rechte lijn meetgereedschap, meet de afstand van de functie start- en eindpunt via analyseren | Maatregel.
      Opmerking: Hoe langer de trackable afstand, de minder fouten in de meting zal van invloed op de berekeningen
    6. Bereken de snelheid van de straal van de gemeten afstand en de verstreken tijd (het aantal verstreken frames gedeeld door framerate.)
    7. Herhaal stappen 2.11.3-2.11.6 een paar keer voor elk segment van de video.
    8. De gegevensreeksen uitzetten zoals in Figuur 2.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ideale grondstof voor de hier beschreven procedures (Figuur 3) zijn hoge dichtheid van microcrystals opgenomen in viskeuze vervoerder medium voor de injector. De procedure roept voor ongeveer 50 µL van crystal beladen drager voor elk preparaat. Deze kunnen rechtstreeks in de LCP als met de bR9,10 hier gebruikt als voorbeeld (Figuur 4), of opgesteld op basis van kristal...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De TR-SFX-methode met de viskeuze extrusie injector heeft bewezen te zijn van een levensvatbare techniek voor structurele dynamica studies van bacteriorhodopsin9,10 en Fotosysteem II13 en nu lijkt klaar om te studeren eiwitten rijden andere Foto biologische processen zoals ion licht-gedreven vervoer of zintuiglijke waarneming5,50. De hierboven beschreven protocollen werden ontworpe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij erkennen Gebhard Schertler, Rafael Abela en Chris Milne ter ondersteuning van het gebruik van hoge viscositeit injectoren op de PSI. Richard Neutze en zijn team zijn erkend voor discussies over time-resolved kristallografie en monster levering met behulp van hoge viscositeit injectoren. Voor financiële steun, we erkennen de Zwitserse National Science Foundation voor subsidies 31003A_141235, 31003A_159558 (naar J.S.) en PZ00P3_174169 (tot P.N.). Dit project heeft financiering ontvangen van de Europese Unie Horizon 2020 onderzoek en innovatie programma onder de Marie Sklodowska-Curie subsidie overeenkomst No 701646.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Mosquito LCP Syringe CouplingTTP labtech store3072-01050
Hamilton Syringe 1710 RNR, 100 µlHamiltonHA-81065
Hamilton Syringe 1750 RNR, 500 µlHamiltonHA-81265
MonooleinNu-Chek Prep, Inc.M-239
7.9 MAGAvanti Polar Lipids Inc.850534O
50% w/v PEG 2000Molecular DimensionsMD2-250-7
Paraffin (liquid)Sigma-Aldrich1.07162
High speed cameraPhotronPhotron Mini AX
High magnification lensNavitar12X Zoom Lens System
Three axis stageThorLabsPT3/M
Fiber lightThorlabsOSL2
Fused silica fiberMolex/PolymicroTSP-505375
Lite touch ferruleIDEXLT-100
ASU high viscosity injectorArizona State UniversityTe koop bij Uwe Weierstall (weier@asu.edu)
HPLC pumpShimadzuLC-20AD
Electronic gas regulatorProportion AirGP1

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neutze, R., Wouts, R., van der Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses. Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).
  2. Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
  3. Barty, A., et al. Self-terminating diffraction gates femtosecond X-ray nanocrystallography measurements. Nature photonics. 6 (December), 35-40 (2012).
  4. Aquila, A., et al. Time-resolved protein nanocrystallography using an X-ray free-electron laser. Optics express. 20 (3), 2706-2716 (2012).
  5. Panneels, V., et al. Time-resolved structural studies with serial crystallography: A new light on retinal proteins. Structural Dynamics. 2 (4), 041718(2015).
  6. Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
  7. Pande, K., et al. Femtosecond structural dynamics drives the trans/cis isomerization in photoactive yellow protein. Science (New York, N.Y.). 352 (6286), 725-729 (2016).
  8. Barends, T. R. M., et al. Direct observation of ultrafast collective motions in CO myoglobin upon ligand dissociation. Science (New York, N.Y.). 350 (6259), 445-450 (2015).
  9. Nango, E., et al. A three-dimensional movie of structural changes in bacteriorhodopsin. Science. 354 (6319), 1552-1557 (2016).
  10. Nogly, P., et al. Retinal isomerization in bacteriorhodopsin captured by a femtosecond x-ray laser. Science. 0094 (June), eaat0094 (2018).
  11. Coquelle, N., et al. Chromophore twisting in the excited state of a photoswitchable fluorescent protein captured by time-resolved serial femtosecond crystallography. Nature Chemistry. 10 (1), 31-37 (2017).
  12. Kupitz, C., et al. Serial time-resolved crystallography of photosystem II using a femtosecond X-ray laser. Nature. , (2014).
  13. Suga, M., et al. Light-induced structural changes and the site of O=O bond formation in PSII caught by XFEL. Nature. 543 (7643), 131-135 (2017).
  14. Stagno, J. R., et al. Structures of riboswitch RNA reaction states by mix-and-inject XFEL serial crystallography. Nature. 541 (7636), 242-246 (2017).
  15. Wang, D., Weierstall, U., Pollack, L., Spence, J. C. H. Liquid Mixing Jet for XFEL Study of Chemical Kinetics. Journal of synchrotron radiation. , In submiss 1364-1366 (2014).
  16. Hekstra, D. R., White, K. I., Socolich, M. A., Henning, R. W., Šrajer, V., Ranganathan, R. Electric-field-stimulated protein mechanics. Nature. 540 (7633), 400-405 (2016).
  17. Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Nature. 9 (9), 2123-2134 (2014).
  18. Kupitz, C., Grotjohann, I., Conrad, C. E., Roy-Chowdhury, S., Fromme, R., Fromme, P. Microcrystallization techniques for serial femtosecond crystallography using photosystem II from Thermosynechococcus elongatus as a model system. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 369 (1647), (2014).
  19. Falkner, J. C., et al. Generation of Size-Controlled, Submicrometer Protein Crystals. Chemistry of Materials. 17 (10), 2679-2686 (2005).
  20. Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nature communications. 5, 3309(2014).
  21. Landau, E. M., Rosenbusch, J. P. Lipidic cubic phases: a novel concept for the crystallization of membrane proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (December), 14532-14535 (1996).
  22. Caffrey, M. A comprehensive review of the lipid cubic phase or in meso method for crystallizing membrane and soluble proteins and complexes. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (1), 3-18 (2015).
  23. Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Current Opinion in Structural Biology. 21 (4), 559-566 (2011).
  24. Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. IUCrJ. 2 (4), 421-430 (2015).
  25. Sugahara, M., et al. Hydroxyethyl cellulose matrix applied to serial crystallography. Scientific Reports. 7 (1), 703(2017).
  26. Sugahara, M., et al. Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography. Nature Methods. 12 (1), 61-63 (2014).
  27. Sugahara, M., et al. Oil-free hyaluronic acid matrix for serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 6 (1), 24484(2016).
  28. Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (2), 387-397 (2015).
  29. Kovácsová, G., et al. Viscous hydrophilic injection matrices for serial crystallography. IUCrJ. 4 (4), 400-410 (2017).
  30. Martin-Garcia, J. M., et al. Serial millisecond crystallography of membrane and soluble protein microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 4 (4), 439-454 (2017).
  31. Fromme, R., et al. Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase. IUCrJ. 2, 545-551 (2015).
  32. Caffrey, M., Li, D., Howe, N., Shah, S. T. A. "Hit and run" serial femtosecond crystallography of a membrane kinase in the lipid cubic phase. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1647), 20130621(2014).
  33. Liu, W., et al. Serial femtosecond crystallography of G protein-coupled receptors. Science (New York, N.Y.). 342 (6165), 1521-1524 (2013).
  34. Zhang, H., et al. Structure of the Angiotensin Receptor Revealed by Serial Femtosecond Crystallography. Cell. 161 (4), 833-844 (2015).
  35. Fenalti, G., et al. Structural basis for bifunctional peptide recognition at human δ-opioid receptor. Nature Structural & Molecular Biology. (February), (2015).
  36. Kang, Y., et al. Crystal structure of rhodopsin bound to arrestin by femtosecond X-ray laser. Nature. 523 (7562), 561-567 (2015).
  37. Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. Journal of Visualized Experiments. 9 (115), 2123-2134 (2016).
  38. Batyuk, A., et al. Native phasing of x-ray free-electron laser data for a G protein-coupled receptor. Science Advances. 2 (9), e1600292(2016).
  39. Nakane, T., et al. Native sulfur/chlorine SAD phasing for serial femtosecond crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (12), 2519-2525 (2015).
  40. Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 2 (2), 168-176 (2015).
  41. Weinert, T., et al. Serial millisecond crystallography for routine room-temperature structure determination at synchrotrons. Nature Communications. 8 (1), 542(2017).
  42. Tosha, T., et al. Capturing an initial intermediate during the P450nor enzymatic reaction using time-resolved XFEL crystallography and caged-substrate. Nature Communications. 8 (1), 1585(2017).
  43. Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase injector is a viable crystal delivery system for time-resolved serial crystallography. Nature Communications. 7, 12314(2016).
  44. Abela, R., et al. Perspective: Opportunities for ultrafast science at SwissFEL. Structural Dynamics. 4 (6), 061602(2017).
  45. Marx, V. Structural biology: doors open at the European XFEL. Nature Methods. 14 (9), 843-846 (2017).
  46. Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples. Chemistry and Physics of Lipids. 95 (1), 11-21 (1998).
  47. Qiu, H., Caffrey, M. The phase diagram of the monoolein/water system: Metastability and equilibrium aspects. Biomaterials. 21 (3), 223-234 (2000).
  48. James, D. Injection Methods and Instrumentation for Serial X-ray Free Electron Laser Experiments. , (2015).
  49. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  50. Moffat, K. Femtosecond structural photobiology. Science (New York, N.Y.). 361 (6398), 127-128 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Microcrystal DeliveryThree way Syringe CouplerLipidic Cubic PhaseHigh speed Camera AnalysisExtrusion Stability TestingBacteriorhodopsin MicrocrystalsXFEL Sample InjectionLCP Sample Preparation

Gerelateerde artikelen