Methodenartikel

Verbetering van de extrusie van de hoge viscositeit van Microcrystals voor Time-resolved seriële femtoseconde kristallografie aan X-ray Lasers

DOI:

10.3791/59087

⸱

28 februari 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Biology and Chemistry - Laboratory for Biomolecular Research, Paul Scherrer Institut, 2Photon Science Division - SwissFEL, Paul Scherrer Institut, 3RIKEN SPring-8 Center, 4Department of Cell Biology, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 5Department of Biology, ETH Zürich

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het succes van een time-resolved seriële femtoseconde kristallografie experiment is afhankelijk van efficiënte monster levering. We beschrijven hier protocollen voor het optimaliseren van de extrusie van de bacteriorhodopsin microcrystals van een hoge viscositeit micro-extrusie injector. De methodologie steunt op monster homogenisering met een roman drieweg koppelstuk en visualisatie met een high-speed camera.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dikvloeibaar micro-extrusie injectoren gedaald dramatisch monster consumptie in seriële femtoseconde kristallografische experimenten (SFX) op X-ray vrije elektron lasers (XFELs). Een reeks van experimenten met behulp van de licht-gedreven proton pomp bacteriorhodopsin hebben verder deze injectoren opgericht als een voorkeursoptie te leveren crystals voor seriële femtoseconde time-resolved kristallografie (TR-SFX) voor het oplossen van de structurele veranderingen van eiwitten na photoactivation. Voor het verkrijgen van meerdere structurele momentopnamen van hoge kwaliteit, is het noodzakelijk te verzamelen van grote hoeveelheden gegevens en Goedkeuringvande kristallen tussen elke pomp laser impuls zorgen. Hier beschrijven we in detail hoe we de extrusie van de bacteriorhodopsin microcrystals geoptimaliseerd voor onze recente TR-SFX experimenten op de Linac Coherent licht bron (LCLS). Het doel van de methode is voor het optimaliseren van 3D-effect voor een stabiele en continue stroom terwijl het handhaven van een hoge dichtheid van kristallen het percentage te verhogen op welke gegevens kunnen worden verzameld in een TR-SFX experimenteren. We bereiken dit doel door het opstellen van lipidic kubieke fase met een homogene verdeling van kristallen met behulp van een roman drieweg spuit koppelinrichting gevolgd door aanpassing van de samenstelling van de steekproef op basis van metingen van de stabiliteit van de extrusie genomen met een high-speed de set-up van de camera. De methode kan worden aangepast aan het optimaliseren van de stroom van andere microcrystals. De setup zal beschikbaar zijn voor gebruikers van de nieuwe faciliteit van de Zwitserse vrije elektron Laser.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Seriële femtoseconde kristallografie (SFX) is een structurele biologie-techniek die gebruik maakt van de unieke eigenschappen van X-ray vrije elektron lasers (XFEL) om te bepalen van de kamertemperatuur structuren uit duizenden kristallen micrometer en middelgrote terwijl outrunning allermeest de schade door straling door de "diffractie vóór vernietiging" beginsel1,2,3.

In een tijd-resolved uitbreiding van SFX (TR-SFX), worden de pulsen van de femtoseconde van de XFEL gebruikt voor het bestuderen van structurele veranderingen in de eiwitten

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. eiwitten Crystal monstervoorbereiding

  1. Ongeveer 30 minuten voordat de steekproef is om te worden geïnjecteerd, belasting 50 µL van crystal-beladen monoolein op basis van LCP in een 100 µL spuit.
  2. Voor injectie bij atmosferische druk: Load 10 µL van vloeibare paraffine in de achterkant van een tweede injectiespuit. Houd de injectiespuit verticaal en verdrijven de luchtbellen uit de spuit.
    1. Voor injectie in vacuüm milieu: belasting 5 µL van MAG 7,9 en 5 µL van vloeibare paraffine in de achterkant van een tweede injectiespuit. Houd de injectiespuit verticaal en verdrijven de luchtbellen uit de spuit.
  3. Verbinding maken met....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ideale grondstof voor de hier beschreven procedures (Figuur 3) zijn hoge dichtheid van microcrystals opgenomen in viskeuze vervoerder medium voor de injector. De procedure roept voor ongeveer 50 µL van crystal beladen drager voor elk preparaat. Deze kunnen rechtstreeks in de LCP als met de bR9,10 hier gebruikt als voorbeeld (Figuur 4), of opgesteld op basis van kristal.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De TR-SFX-methode met de viskeuze extrusie injector heeft bewezen te zijn van een levensvatbare techniek voor structurele dynamica studies van bacteriorhodopsin9,10 en Fotosysteem II13 en nu lijkt klaar om te studeren eiwitten rijden andere Foto biologische processen zoals ion licht-gedreven vervoer of zintuiglijke waarneming5,50. De hierboven beschreven protocollen werden ontworpe.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij erkennen Gebhard Schertler, Rafael Abela en Chris Milne ter ondersteuning van het gebruik van hoge viscositeit injectoren op de PSI. Richard Neutze en zijn team zijn erkend voor discussies over time-resolved kristallografie en monster levering met behulp van hoge viscositeit injectoren. Voor financiële steun, we erkennen de Zwitserse National Science Foundation voor subsidies 31003A_141235, 31003A_159558 (naar J.S.) en PZ00P3_174169 (tot P.N.). Dit project heeft financiering ontvangen van de Europese Unie Horizon 2020 onderzoek en innovatie programma onder de Marie Sklodowska-Curie subsidie overeenkomst No 701646.

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Mosquito LCP Syringe CouplingTTP labtech store3072-01050
Hamilton Syringe 1710 RNR, 100 µlHamiltonHA-81065
Hamilton Syringe 1750 RNR, 500 µlHamiltonHA-81265
MonooleinNu-Chek Prep, Inc.M-239
7.9 MAGAvanti Polar Lipids Inc.850534O
50% w/v PEG 2000Molecular DimensionsMD2-250-7
Paraffin (liquid)Sigma-Aldrich1.07162
High speed cameraPhotronPhotron Mini AX
High magnification lensNavitar12X Zoom Lens System
Three axis stageThorLabsPT3/M
Fiber lightThorlabsOSL2
Fused silica fiberMolex/PolymicroTSP-505375
Lite touch ferruleIDEXLT-100
ASU high viscosity injectorArizona State UniversityTe koop bij Uwe Weierstall (weier@asu.edu)
HPLC pumpShimadzuLC-20AD
Electronic gas regulatorProportion AirGP1

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neutze, R., Wouts, R., van der Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses. Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).
  2. Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
  3. B....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Time resolved Serial Femtosecond CrystallographyHigh Viscosity ExtrusionMicrocrystal DeliveryThree way Syringe CouplerLipidic Cubic PhaseHigh speed Camera AnalysisExtrusion Stability TestingBacteriorhodopsin MicrocrystalsXFEL Sample InjectionLCP Sample Preparation

Gerelateerde artikelen