Effect van Anti-c-fms antilichaam op Osteoclast vorming en verspreiding van Osteoclast voorloper In Vitro

Samenvatting

Dit protocol omvat dissectie van lymfkliertest lange botten en beenmerg isolatie, voor het genereren van beenmerg macrofagen en produceren van de osteoclasten met behulp van macrofaag kolonie stimulerende factor (M-CSF) en receptor activator van nuclear factor-Kappa-B ligand (RANKL) of Tumornecrosefactor alfa (TNF-α) en hun arrestatie door anti-c-fms antilichaam, M-CSF receptor.

Samenvatting

Het remodelleren van het bot is een complex proces en het gaat om perioden van afzetting en resorptie. Bot resorptie is een proces waarbij bot door osteoclasten in reactie op verschillende stimuli afgebroken wordt. Osteoclast precursoren differentiëren in multinuclear osteoclasten in reactie op macrophage kolonie stimulerende factor (M-CSF) en receptor activator van nuclear factor-Kappa-B ligand (RANKL). Onder pathologische omstandigheden, het profiel van cytokine is anders en gaat om een mengsel van inflammatoire cytokines. Tumornecrosefactor alfa (TNF-α) is één van de belangrijkste cytokines zoals het vlindertje gebieden betrokken bij inflammatoire osteolyse in grote hoeveelheden. Het doel van dit protocol is bedoeld als een methode waarmee lymfkliertest beenmerg is geïsoleerd voor het genereren van de osteoclasten door inductie met M-CSF en RANKL of TNF-α, die vervolgens zal worden geremd doordat doses anti-c-fms antilichaam, de receptor voor M-CB. Dit experiment wijst de therapeutische waarde van anti-c-fms antilichaam in ziekten van inflammatoire bot resorptie.

Inleiding

Osteoclasten zijn gespecialiseerde cellen, en ze onderscheiden van hematopoietische stamcellen door de fusie van meerdere osteoclast precursoren. Ze zijn essentieel voor het remodelleren van gezond bot en bijdragen aan de pathologische bot resorptie osteolytic ontstekingsziekten zoals reumatoïde artritis en Parodontitis¹is gekoppeld.

Osteoclastogenesis en osteoclast functie worden gemedieerd door twee belangrijke factoren; macrophage kolonie stimulerende factor (M-CSF) en receptor activator van nuclear factor-kappa-B ligand (RANKL). Zowel M-CSF en RANKL zijn belangrijk voor osteoclast differentiatie². Een andere factor die heeft aangetoond voor het opwekken van osteoclast vorming van beenmerg macrofagen in vitro is Tumornecrosefactor alfa (TNF-α)^3,4,5. TNF-α gemedieerde osteoclast vorming is aangetoond dat het van doorslaggevend belang voor osteolyse in destructieve bot ziekten zoals reumatoïde artritis⁶, parodontitis⁷en postmenopauzale osteoporose⁸.

C-fms is de receptor membraan van M-CB en bemiddelt haar optreden. De rol van c-fms is goed gedocumenteerd in de literatuur, zoals het werd aangetoond dat de administratie van een antilichaam tegen c-fms (anti-c-fms antilichaam) volledig osteoclastogenesis in een artritis model gearresteerd, alsook in TNF-α geïnduceerde bot erosies terwijl osteoclastogenesis verre van het ontstoken gewricht was nog steeds robuust⁹. Toediening van anti-c-fms antilichaam geremd osteoclast vorming en bot resorptie geïnduceerd door lipopolysaccharide (LPS) in muis calvariae¹⁰ zo goed zoals in LPS-geïnduceerde parodontitis model¹¹. Bovendien, anti-c-fms antilichaam geremd mechanische stress-geïnduceerde wortel resorptie tijdens orthodontische tand verkeer¹², evenals orthodontische tand verkeer en bot resorptie orthodontische tand verkeer¹³zijn gekoppeld.

M-CSF heeft gemeld dat de andere functies die essentieel voor de immuunrespons van de gastheer zijn. Het ontbreken van M-CB in op/op muizen met bacteriële longontsteking leiden tot de toename van bacteriële belasting en bacteriële verspreiding aan de lever met hepatische necrose¹⁴. M-CSF is daarom belangrijk voor immunologische reactie op het gebied van de bescherming tegen infectie.

Deze studie toont het effect van anti-c-fms antilichaam op M-CSF en RANKL of TNF-α geïnduceerde osteoclast vorming in vitro en M-CSF geïnduceerde proliferatie van osteoclast precursoren. Dit protocol toont het isolement van lymfkliertest beenmergcellen van lange beenderen en de stappen voor het genereren van beenmerg macrofagen (BMM), die worden beschouwd als osteoclast precursoren en voor het opwekken van de differentiatie van de BMM in multinuclear osteoclasten door twee methoden; RANKL of TNF-α. Het protocol vergelijkt ook de arrestatie van osteoclastogenesis in beide methoden met behulp van anti-c-fms antilichaam.

Het proces waarbij het beenmerg is geëxtraheerd en vervolgens gebruikt voor het genereren van osteoclast precursoren is betrouwbaar in het produceren van grote hoeveelheden van pure osteoclast culturen die kunnen worden gebruikt in meerdere downstream toepassingen zoals drug testen. Het gebruik van RANKL of TNF-α ertoe osteoclastogenesis in dit protocol onderscheidt osteoclastogenesis als een fysiologische proces (RANKL) van osteoclastogenesis als een pathologische proces (TNF-α), dat op zijn beurt twee alternatieve procedures biedt te begeleiden de beslissing waarvan één is superieur in termen van de reagentia om in downstream toepassingen worden gebruikt. Dit protocol biedt ook een methode waarmee we een geschikte concentratie van anti-c-fms-antilichaam dat veilig kan worden gebruikt voor latere studies deelnemen aan bot resorptie en osteolytic ziekten kunnen bepalen.

Protocol

Alle dierlijke procedures en verzorging van de dieren werden uitgevoerd volgens Universiteit Tohoku regels en voorschriften.

1. lymfkliertest stuk dissectie en behandeling

1. Voordat de dissectie, vul een plaat met ongeveer 50 mL α-MEM afhankelijk van de grootte van de container en plaats deze op het ijs. Dit zal dienen als een collectie container totdat de dissectie van alle beenderen voltooid is. Voor deze en latere experimenten, α-MEM met 10% foetale runderserum (FBS), 100 IU/mL penicilline G en 100 μg/mL streptomycine gebruiken.
2. C57Bl/6J muis bij inademing met een overdosis van 5% Isofluraan euthanaseren.
3. Corrigeer de muis in een liggende positie met behulp van pennen doorboord door de palmen en de voeten en de spray grondig met 70% ethanol.
4. Een insnijding van de huid met behulp van steriele chirurgische schaar en pincet op het niveau van de heup te maken en uit te breiden tot de voeten bloot van de spieren.
5. Snij de pees van de quadriceps spier koppelen en de pees verbonden zijn de hamstring spier aan het bot. Schil weg de spieren bloot zowel heup-en knie. Lokaliseren van deze pezen zal verlichten vrijmaken van beide spieren van hun bijlagen zonder weke tags. Niet gesneden in het bot.
6. Plaats de schaar tussen de kop van het dijbeen en de gewrichtsruimte en snijd in het vrijmaken van het dijbeen, maar het bot intact te houden. Hierdoor zal het detachement van de botten zonder het risico van blootstelling van het beenmerg.
7. Ook knippen weg de spieren die verbonden zijn aan het scheenbeen. Gesneden het scheenbeen vrij van zijn gehechtheid aan het enkelgewricht houden van het bot intact om verontreiniging te voorkomen.
8. Schraap eventuele resterende weke delen van het bovenbeen en onderbeen met behulp van de schaar messen en kimwipe en plaats deze in een bord met α-MEM geplaatst op ijs.

2. lymfkliertest stuk beenmerg isolatie

1. Vul een 30 G naald-spuit met α-MEM.
2. Het verbreken van het scheenbeen en het dijbeen uit de buurt van het kniegewricht.
3. Snij de uiteinden van de lange beenderen van beide zijden met behulp van schaar.
4. Houd het bot van de schacht met pincet, plaats de naald in de ruimte van het merg van het bot en langzaam het spoelen van de inhoud van het beenmerg in een 6 cm cultuur schotel. Het bot zal verschijnen witte, met vermelding van de winning van alle inhoud van het beenmerg. Herhaal voor alle botten.
5. Stam het beenmerg uitpakken met behulp van een 40 μm nylon cel zeef in een tube van 50 mL conische centrifuge en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min.
6. Verwijder het supernatant, wassen met 5 mL van α-MEM en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min. Repeat wassen voor een totaal van 2 keer.
7. Resuspendeer de pellet in 10 mL α-MEM en het uitvoeren van een telling van de cel met behulp van een hemocytometer als volgt:
   1. Een verdunning van 1:1 van de celsuspensie maken door toevoeging van 10 μL van celsuspensie aan 10 μL van 0,4% trypan blauw in een tube van 1,5 mL en Pipetteer eens.
   2. Bedek de hemocytometer kamer met een dia cover en breng de kleurstof de hemocytometer. Het is belangrijk niet te overvulling of underfill van de kamer en de schorsing te vullen van de kamer door capillaire werking.
   3. Plaats de hemocytometer in het werkgebied van een microscoop. Met 10 x doelstelling, focussen op het center-plein. Graaf alle cellen 3 regels gebonden. Om ervoor te zorgen dat cellen niet twee keer worden geteld, tellen de bovenste en juiste hoeken van elk vierkant. Dode cellen verschijnt donkerblauw, deze zijn uitgesloten van de graaf.
8. Afhankelijk van de stroomafwaartse toepassing, zaad de cellen in een vaartuig van de juiste cultuur. Volg voor deze bijzonder experiment, sectie 3.

3. productie van BMM

1. Zaad 1 x 10⁷ cellen/10 mL in een 10 cm schotel cultuur en voeg M-CSF 100 ng/mL. De uiteindelijke concentratie van M-CSF is 100 ng/mL gestolde voedingsbodem. Incubeer de cultuur bij 37 ° C, 5% CO₂ voor 3 dagen.
2. Na 3 dagen, het verwijderen van het kweekmedium, wassen van de cellen krachtig met 10 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) tweemaal naar niet-aanhanger cellen verwijderen, voeg 5 mL van de kamertemperatuur 0,02% trypsine-EDTA in PBS en Incubeer bij 37 ° C, 5% CO₂ voor 5 min.
3. Loskoppelen van de cellen door grondige pipetteren. Zorg ervoor dat de cellen hebben zijn losgemaakt door het observeren van de cultuur onder een microscoop (de cellen moeten verschijnen afgeronde en zwevend in de media). Als de cellen aangesloten blijven, herhaal pipetteren grondig als u wilt loskoppelen van hen. Wanneer de cellen hebben zijn vrijstaand, voeg 5 mL van α-MEM naar de inactivering van de reactie.
4. De cellen in een conische tube van 50 mL en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min. negeren het supernatant verzamelen en wassen met 5 mL van α-MEM.
5. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min en resuspendeer de pellet in 10 mL α-MEM.
6. Het uitvoeren van een aantal van de cellen zoals hiervoor is beschreven in stap 2.7.1.
7. Zaad 1 x 10⁶ cellen/10 mL in een 10 cm schotel cultuur en voeg M-CSF 100 ng/mL. De uiteindelijke concentratie van M-CSF is 100 ng/mL gestolde voedingsbodem. Incubeer de cultuur bij 37 ° C, 5% CO₂ voor 3 dagen.

4. generatie van osteoclasten van BMM als Osteoclast precursoren

1. Na 3 dagen, de gekoppelde cellen die BMM als osteoclast precursoren vertegenwoordigen, stappen 3.2-3.7 na de oogst.
2. Zaad BMM op 5 x 10⁴ cellen/200 μL van α-MEM in een 96 goed bord. Toevoegen RANKL voor een eindconcentratie van 50 ng/mL of TNF-α voor een eindconcentratie van 100 ng/mL. M-CSF voor een eindconcentratie van 100 ng/mL toevoegen aan elk putje.
3. Toevoegen van anti-c-fms antilichaam (eindconcentraties van 0, 1, 10, 100, 1000 ng/mL) aan elk putje.
4. Incubeer bij 37 ° C, 5% CO₂ voor 4 dagen. Wijzigen van media om de andere dag voor 4 dagen.

5. tartraat-resistente zure fosfatase (TRAP) vlek

1. Na 4 dagen incubatie, gecombineerd zachtjes het kweekmedium van elk putje. Was nou eenmaal met 200 μL van kamertemperatuur 1 x PBS.
2. Voeg 200 μl van 10% formaline aan elk putje voor fixatie en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. De formaline gecombineerd en elk goed 3 keer wassen met gedeïoniseerd water.
3. Voeg toe 200 μL van 0,2% Triton X-100 in PBS aan elk goed voor permeabilization en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. De Triton X-100 gecombineerd en elk goed 3 keer wassen met gedeïoniseerd water.
4. Voeg 200 l TRAP vlek oplossing aan elk putje. Visualiseer de vlek onder de Microscoop. Het duurt van 10-30 min voor de vlek goed ontwikkelen.
5. Gecombineerd de vlek en wassen elk goed met gedeïoniseerd water 3 keer, en droge lucht. Bewaren bij kamertemperatuur te gebruiken in verdere observatie.

6. verspreiding Assay

1. Zaad BMM als osteoclast precursoren op 5 x 10³ cellen/200 μL van α-MEM in een 96 goed bord. M-CSF voor een eindconcentratie van 100 ng/mL toevoegen aan elk putje.
2. Toevoegen van anti-c-fms antilichaam (eindconcentraties van 0, 1, 10, 100, 1000 ng/mL) en Incubeer bij 37 ° C, 5% CO₂ voor 3 dagen middellange ongewijzigd.
3. Na 3 dagen, wassen de cellen met 1 x PBS. Voeg 100 μl van α-MEM toe aan elk putje.
4. 10 μL van cel tellen kit oplossing toevoegen en Incubeer bij 37 ° C, 5% CO₂ voor 2 h en bepalen van de extinctie van elk putje bij 450 nm met behulp van een microplate-lezer.

Resultaten

Het doel van dit protocol is te evalueren van het effect van anti-c-fms antilichaam op osteoclast vorming in aanwezigheid van RANKL of TNF-α en voor het bepalen van het effect van M-CSF op osteoclast precursoren proliferatie. In dit protocol, die wij hebben verstrekt een betrouwbaar proces watergasproces waarbij grote hoeveelheden pure osteoclast culturen zijn gegenereerd. Wij hebben ook een manier om te testen de geschikte concentratie anti-c-fms antilichaam voor remming van osteoclast v...

Discussie

In deze studie onderzochten we het effect van anti-c-fms antilichaam RANKL-geïnduceerde osteoclast vorming, TNF-α-geïnduceerde osteoclast vorming en M-CSF-geïnduceerde osteoclast voorloper proliferatie. We vonden dat de effectieve hoeveelheid anti-c-fms antilichaam voor de remming van de osteoclastogenesis tussen RANKL geïnduceerde osteoclast vorming, TNF-α geïnduceerde osteoclast vorming en M-CSF-geïnduceerde proliferatie van osteoclast precursoren anders is.

RANKL bemiddelt osteoclastogenesi...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Anti-c-Fms antibody			AFS98, een rat monoclonal, antimurine, c-Fms-antilichaam (IgG2a)
TNF-α			Recombinant muur muis TNF-α bereid in ons laboratorium. TNF-α cDNA-fragment geklond door RT-PCR en gekloneerd in een pGEX-6P-I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) om een GST-fusie-eiwit te genereren. GST-TNF-α werd tot expressie gebracht in Escherichia coli BL21 cellen (Stratagene, La Jolla, CA). De cellen werden onder niet-denaturerende omstandigheden gelyseerd en GST-TNF-α werd gezuiverd over een glutathion-Sepharose kolom. GST werd afgesneden door PreScission Protease (Amersham Biosciences) volgens de richtlijnen van de fabrikant en verwijderd door een glutathion-Sepharose kolom.
RANKL	PEPROTECH	315-11	Recombinant Muur muis sRANK Ligand, Bron: E. coli
M-CSF			Recombinant menselijke M-CSF. 1/10 vol van CMG14–12 cellijn cultuur supernatant bij 5x106 cellen in een 10 cm suspensiecultuur schaal.
α-MEM	Wako		met L-Glutamine en fenolrood
Fetal Bovine Serum	Biowest	s1820-500	Fetal Bovine Serum Franse Oorsprong
Cultuur schaal	Corning		100 mm x 20 mm stijl schaal
96-well plate	Thermofischer Scientific		Nun clon Delta oppervlak
Celtelling kit-8	Dojindo, Kumamoto, Japan
Microplate reader	Sunrise REMOTE; Tekan Japan, Kawasaki, Japan
Cel zeef	Corning		40 μm Nylon
Centrifugebuis	Corning		50 mL CentriStar dop
Triton X-100	Wako		Polyoxyethyleen (10) Octyfenylether