Methodenartikel

Confocale beeldvorming van Double-Stranded RNA en patroon erkenning receptoren in negatief-Sense RNA-virusinfectie

DOI:

10.3791/59095

⸱

26 januari 2019

 ,  , 
1Department of Pathology and Institute for Human Infections and Immunity, University of Texas Medical Branch

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Double-stranded RNA geproduceerd tijdens de replicatie van RNA-virus kan worden herkend door patroon erkenning receptoren voor het opwekken van een aangeboren immuunrespons. Voor negatieve-gevoel van RNA-virussen blijft de interactie tussen de low-level dsRNA en PRRs onduidelijk. We hebben een confocale microscopie methode ontwikkeld om visualiseren Arenavirussen dsRNA en PRR in afzonderlijke cellen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Double-stranded (ds) RNA wordt geproduceerd als Dr. intermediair tijdens de RNA-virusinfectie. Erkenning van dsRNA door gastheer patroon erkenning receptoren (PRRs) zoals de retinoïnezuur (RIG-ik) als receptoren (RLRs) RIG-ik en melanoom differentiatie-geassocieerde eiwit 5 (MDA-5) leidt tot de inductie van de aangeboren immuunrespons. De vorming en de intracellulaire distributie van dsRNA in positieve-zin RNA-virusinfectie was ook gekenmerkt door microscopie. Veel negatieve-gevoel van RNA-virussen, met inbegrip van sommige arenaviruses, activeren de ingeboren immune reactie tijdens infectie. Echter werden negatief-gevoel van RNA-virussen verondersteld om het produceren van lage niveaus van dsRNA, die de beeldvorming studie van PRR erkenning van virale dsRNA belemmert. Bovendien moeten de infectie experimenten met hoogpathogene arenaviruses in hoge insluiting bioveiligheid niveau voorzieningen (BSL-4) worden uitgevoerd. De interactie tussen virale RNA en PRRs voor hoogpathogene RNA-virus is grotendeels onbekend als gevolg van de extra technische uitdagingen dat onderzoekers moeten onder ogen zien in de BSL-4 faciliteiten. Onlangs, een monoklonaal antilichaam (Mab) (kloon 9D 5) oorspronkelijk gebruikt voor pan-enterovirus detectie is gebleken dat specifiek dsRNA detecteren met een hogere gevoeligheid dan de traditionele J2 of K1 anti-dsRNA antilichamen. Hierin, door gebruik te maken van de 9D 5 antilichaam, beschrijven we een confocale microscopie-protocol dat met succes heeft gebruikt om te visualiseren dsRNA, virale eiwitten en PRR gelijktijdig in afzonderlijke cellen besmet door Arenavirussen. Het protocol is ook geschikt voor imaging studies van dsRNA en PRR distributie in pathogene Arenavirussen geïnfecteerde cellen in BSL4 faciliteiten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De eerste stap van de inductie van de aangeboren immuunrespons is host erkenning van double-stranded RNA (ds) door de patroon erkenning receptoren (PRRs) zoals de retinoïnezuur (RIG-ik) als receptoren (RLRs) RIG-ik en melanoom differentiatie-geassocieerde eiwit 5 (MDA-5)1. Voor positieve-gevoel van RNA-virussen, kan dsRNA meestal worden gemakkelijk opgespoord met behulp van de J2 of K1 anti-dsRNA monoclonal antilichamen (Mab)2. Interactie tussen dsRNA en PRRs in positieve-onderdeel van RNA-virussen, zoals picornavirus, heeft gekenmerkt met behulp van de confocal microscopie3. Echter voor negatieve verstand RNA-virus, werd visualisatie en karakterisering van PRR en dsRNA interactie belemmerd door het ontbreken van gevoelige antilichamen tegen dsRNA. RNA Fluorescente kruising in situ (vissen) is toegepast op de visualisatie van virale RNA en PRRs4. Niettemin, de vis-methodologie vereist de kennis van de doelgroep opeenvolging van RNA en is mogelijk niet compatibel met PRR mede kleuring. Onlangs, de 9D 5 Mab, die oorspronkelijk werd ontwikkeld voor de diagnose van pan-enterovirus infectie, bleek te zijn gevoeliger dan de J2 Mab en kan gemakkelijk detecteren dsRNA in negatief-zin RNA-virus infectie5,6. Mab 9D 5 is dus een roman en een nuttig instrument om te studeren van virale replicatie en de interactie tussen PRR en virale RNA voor negatieve-sense RNA-virus.

Arenaviruses is een familie van single-stranded, negatief-gevoel van RNA-virussen, waaronder verschillende menselijke pathogenen, zoals Lassa-virus (LASV), Junín virus (JUNV) en Machupo-virus (MACV), waardoor ernstige hemorragische koorts ziekten in mens7. Klinische gegevens uit ernstige en dodelijke gevallen van Argentijnse hemorragische koorts veroorzaakt door de nieuwe wereld Arenavirussen JUNV vertonen ongewoon hoge niveaus van serum IFN-α8,9. We hebben aangetoond dat de pathogene NW-arenaviruses (JUNV en MACV), maar niet de pathogene vliegenvangers Arenavirussen, LASV, een type veroorzaken ik interferon (IFN) antwoord in menselijke monocyt-afgeleide dendritische cellen10. Bovendien, RIG-behoort van de sensoren bemiddelen typ ik IFN antwoord in JUNV-geïnfecteerde cellen11. We vonden ook dat de proteïne kinase R (PKR) receptor, die traditioneel bekend voor dsRNA erkenning staat, wordt geactiveerd in pathogene NW Arenavirussen infectie12. Om verder te begrijpen het mechanisme van virus-specifieke IFN reactie tijdens Arenavirussen infectie, we gericht op het ontwikkelen van een protocol om de interactie tussen virale dsRNA en de cytoplasmatische PRRs visualiseren.

Infectie experimenten met pathogene JUNV, MACV en LASV moeten worden uitgevoerd in de bioveiligheid niveau 4 (BSL-4) voorzieningen. Dus, naast het vermoedelijk lage niveau van dsRNA gevormd in Arenavirussen infectie, voldoen aan de eisen van de bioveiligheid is een andere techniek uitdaging bij het uitvoeren van imaging studies voor deze hoogpathogene virussen. Door gebruik te maken van de 9D 5 antilichaam en de Candid1 # vaccinstam van JUNV, een confocal microscopie gebaseerde protocol wordt beschreven in dit verslag, dat met succes heeft gebruikt om te visualiseren dsRNA, virale eiwitten en PRR gelijktijdig in cellen besmet door Arenavirussen in BSL2 labs. Het protocol is ook geschikt voor de visualisatie van intracellulaire distributie van dsRNA en PRR tijdens pathogene Arenavirussen infectie in BSL4 faciliteiten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. bereiding van A549 cellen en JUNV infectie

  1. Zaad 2 x 105 menselijke longen epitheliale A549 cellen op poly-D-lysine (PDL) gecoat glas coverslips in 12-Wells-platen 24 uur voorafgaand aan de infectie.
  2. Bereiden aliquots van 150 mL JUNV13 op een vermenigvuldiging van de infectie (MOI) van 1,0 plaque die eenheid vormen per cel verdund in Dulbecco van bewerkt Eagle's Medium (DMEM) media, aangevuld met 2% foetale runderserum (FBS) en 1% penicilline en streptomycine (P/S ).
  3. Media verwijderen van celkweek. Virus entmateriaal toevoegen op elke goed met dekglaasje aan en incubeer gedurende 1,5 uur bij 37 ° C. Schud de platen elke 15 min.
  4. Verwijderen van het virus entmateriaal, voeg 1 mL DMEM aangevuld met 5% FBS en 1% P/S. Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende het gewenste tijdstip.

2. fixatie en immunokleuring

  1. De media gecombineerd. Spoel de cellen door toevoeging van 1 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) aangevuld met calcium en magnesium aan elk putje.
  2. Verwijderen van PBS. Voeg 1 mL methanol (MeOH) vooraf bij-20 ° C worden gekoeld en Incubeer bij-20 ° C of op droog ijs gedurende 15 minuten.
  3. Verwijder MeOH.
  4. Voeg 1 mL PBS toe aan elk putje en wassen monsters bij 4 ° C met zachte rockende voor 5 min. Herhaal de wash voor totaal 4 keer.
  5. De vaste cellen op coverslips in 1 mL 0,2% t-octylphenoxypolyethoxyethanol voor 5 min bij 4 ° C, met zachte rockende wassen.
  6. Voeg 1 mL PBS toe aan elk putje. Wassen monsters bij 4 ° C gedurende 5 min met zachte rockende. Herhaal de stap wassen voor totaal 4 keer.
  7. U wilt opsporen dsRNA en MDA5, incubeer monsters in 200 mL primaire antilichamen verdund in 3% bovien serumalbumine (BSA). Het antilichaam van de anti-dsRNA 9D 5 bij een verdunning 1:2 verdunnen en Verdun het antilichaam van de anti-MDA-5 bij 1:250. Incubeer met zachte rockende bij 4 ° C's nachts.
  8. Primaire antilichamen te verwijderen en te wassen elk goed met 1 mL PBS voor 5 min met zachte wiegen op RT. Herhaal deze wassing viermaal meer.
  9. Voeg 200 mL van secundaire antilichamen (1:2, 000 verdunning) verdund in 3% BSA en Incubeer bij RT gedurende 1 h.
  10. Verwijderen van secundaire antilichamen en wassen elk goed met 1 mL PBS voor 5 min met zachte wiegen op RT. Herhaal deze wassing viermaal meer.
  11. Te detecteren JUNV nucleoproteïne (NP) en RIG-ik, voeg 200 mL van geconjugeerde antilichamen verdund in 3% BSA. Verdun de geconjugeerd anti-JUNV NP (AG-12) op 1:1,000 en monsters voor 2 h op RT met zachte rockende uit te broeden. Verdun het geconjugeerd anti-RIG-ik antilichaam op 1:500 en Incubeer bij 4 ° C's nachts met zachte rockende.
  12. Verwijderen van geconjugeerde antilichamen en wassen elk goed met 1 mL PBS voor 5 min met zachte wiegen op RT. Herhaal deze wassing viermaal meer.
  13. Counterstain de coverslips met de DAPI (1:1, 000) voor 3 min met zachte rockende op RT.
  14. Wassen van de coverslips 3 keer, telkens gedurende 5 minuten in 1 mL van 0,5% t-octylphenoxypolyethoxyethanol met zachte rockende op RT.
  15. Wassen tweemaal in 1 mL PBS voor 5 min telkens met zachte rockende op RT.
  16. Eenmaal in 1 mL van ddH2O voor 1 min op RT, rocking voorzichtig wassen.
  17. Mount coverslips in glas-dia's met behulp van de media van de montage. Laat genezen overnachten.
  18. Zegel van de dia's met nagellak en lucht droog gedurende 1 uur.
  19. Afbeelding op confocal microscoop met de 60 x / 1.42 lens van de onderdompeling van de olie van de numerieke opening met behulp van dezelfde laser emissies voor elk monster.
  20. Wanneer het analyseren van de gegevens, indien nodig, aanpassingen voor de helderheid en het contrast met de dezelfde lineaire aanpassing voor alle monsters maken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol werd toegepast om het onderzoek naar de distributie en de colocalization tussen de RLRs (RIG-ik en MDA-5) en dsRNA in JUNV-geïnfecteerde cellen. Zoals blijkt uit Figuur 1 en Figuur 2, verhoogt de accumulatie van dsRNA na verloop van tijd als virale infectie voortschrijdt. Geconcentreerd MDA-5 (Figuur 1) en RIG-I (Figuur 2) signalen werden gevonden colocalize...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voor positieve-gevoel van RNA-virussen en dsDNA virussen, is dsRNA gemakkelijk met het gebruikte J2 anti-dsRNA antilichaam ontdekt. Echter, negatief-gevoel van RNA-virussen worden verondersteld te produceren dsRNA op een laag of onder het niveau van de detectie met behulp van de dezelfde antilichaam-2. Dus zijn veel aspecten van de virale RNA en PRR interactie grotendeels onduidelijk voor negatieve-gevoel van RNA-virussen. We geprobeerd om vlek voor dsRNA in Arenavirussen infectie met behulp van h...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij wil bedanken de UTMB imaging core faciliteiten en Maxim Ivannikov voor de bijstandsverlening van de Microscoop.

Dit werk werd gesteund door de Public Health Service verlenen RO1AI093445 en RO1AI129198 toegekend aan SP, UTMB inzet Fonds P84373 aan CH en T32 AI007526 naar EM.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
APEX Alexa Fluor 647 antibody labeling kitInvitrogenA10475
BSASigma AldrichA4503
DAPICell Signaling40831:1,000 verdunning
Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 594InvitrogenA-110581:2,000 verdunning; Lot #: 1454437
Dulbecco's modified Eagle's mediumCorning10-013-CV
Fetal Bovine SerumAtlanta BioS11150
Glass microscope slidesFisher12-550-15
Goat-anti mouse Alexa Fluor 488InvitrogenA-110291:2000 verdunning; Lot #: 1874804
Human lung epithelial A549 cellsATCCCCL-185
MethanolFisherA412Bewaard bij -20 °C
Mouse MAb anti-JUNV NPBEINA05-AG12Geconjugeerd met Alexa-647 bij 1:1,000 verdunning
Mouse MAb pan-Enterovirus 9D5 ReagentMillipore Sigma3361Klaar voor gebruik; verdund tot 1:2; Lot #: 3067445
PBS aangevuld met Ca en MgCorning21-030-CV
PDL Gecoate dekglasjesNeuvitroH-12-1.5-pdl
ProLong Gold antifadeInvitrogenP10144
Rabbit MAb MDA-5Abcamab1266301:250 verdunning; Lot #: GR97758-7
recombinant Candid#1 stam van JUNVLab gegenereerdLab gegenereerdZoals eerder beschreven in referentie 13.
RIG-I muis MAb geconjugeerd met Alexa-594Santa Cruzsc-3768451:1000 verdunning; Lot #: AO218
Triton X-100Sigma AldrichT8787 

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jensen, S., Thomsen, A. R. Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion. Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).
  2. Weber, F., Wagner, V., Rasmussen, S. B., Hartmann, R., Paludan, S. R. Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 80, 6(2006).
  3. Triantafilou, K., Vakakis, E., Kar, S., Richer, E., Evans, G. L., Triantafilou, M. Visualisation of direct interaction of MDA5 and the dsRNA replicative intermediate form of positive strand RNA viruses. Journal of Cell Science. 125, 4761-4769 (2012).
  4. Onomoto, K., et al. Critical role of an antiviral stress granule containing RIG-I and PKR in viral detection and innate immunity. PLoS One. 7, e43031(2012).
  5. Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. Double-stranded RNA is detected by immunofluorescence analysis in RNA and DNA virus infections, including those by negative-sense RNA viruses. Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).
  6. Mateer, E. J., Paessler, S., Huang, C. Visualization of double-stranded RNA colocalizing with pattern recognition receptors in arenavirus infected cells. Frontiers Cellular and Infection Microbiology. 8, 251(2018).
  7. Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J. Arenavirdae: The viruses and their replication. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams & Wilkins. (2006).
  8. Levis, S. C., et al. Endogenous interferon in Argentine hemorrhagic fever. The Journal of Infectious Diseases. 149, 428-433 (1984).
  9. Levis, S. C., et al. Correlation between endogenous interferon and the clinical evolution of patients with Argentine hemorrhagic fever. Journal of Interferon Research. 5, 383-389 (1985).
  10. Huang, C., et al. Highly pathogenic new world and old world human arenaviruses induce distinct interferon response in human cells. Journal of Virology. 89, 7079-7088 (2015).
  11. Huang, C., et al. Junin virus infection activates the type I interferon pathway in a RIG-I-dependent manner. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6, e1659(2012).
  12. Huang, C., Kolokoltsova, O. A., Mateer, E. J., Koma, T., Paessler, S. Highly pathogenic new world arenavirus infection activates the pattern recognition receptor protein kinase R without attenuating virus replication in human cells. Journal of Virology. 91, 20(2017).
  13. Emonet, S. F., et al. Rescue from cloned cDNAs and in vivo characterization of recombinant pathogenic Romero and live-attenuated Candid#1 strains of Junin virus, the causative agent of Argentine hemorrhagic fever disease. Journal of Virology. 85 (4), 1473-1483 (2011).
  14. Child, S. J., et al. Antagonism of the protein kinase R pathway in human cells by Rhesus Cytomegalovirus. Journal of Virology. 92, 6(2018).
  15. Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Double Stranded RNA DetectionConfocal Microscopy ProtocolMonoclonal Antibody 9D5Viral Nuclear ProteinHost PRR InteractionMultiplex ImmunofluorescenceA549 Cell InfectionBSL4 Facility Imaging

Gerelateerde artikelen