Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Gedrags Tracking en Neuromast beeldvorming van Mexicaanse Cavefish

7.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59099

⸱

6 april 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Hawai'i at Mānoa, 2Department of Anatomy, Biochemistry and Physiology, University of Hawai'i at Mānoa, 3Pacific Biosciences Research Center, University of Hawai'i at Mānoa

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we methoden voor high-throughput onderzoek naar een reeks van de Mexicaanse cavefish gedrag en vitale kleuring van een mechanosensory systeem. Deze methoden maken gebruik van vrije-software en op maat gemaakte scripts, bieden een praktische en kosteneffectieve methode voor de studie van gedrag.

Samenvatting

Grot-woning dieren geëvolueerd uit een reeks van morfologische en gedrags eigenschappen aan te passen aan hun permanent donker en voedsel-sparse omgevingen. Onder deze eigenschappen is foerageren gedrag een van de nuttige windows in functionele voordelen van gedrags trait evolutie. Hierin gepresenteerd zijn bijgewerkte methoden voor het analyseren van de attractie trillingsgedrag (VAB: een adaptieve foerageren gedrag) en imaging van bijbehorende mechanosensors van grot-aangepast tetra, Astyanax mexicanus. Daarnaast zijn methoden voor high-throughput bijhouden van een aantal extra cavefish gedrag met inbegrip van hyperactiviteit en slaap-verlies gepresenteerd. Cavefish Toon ook asocialiteit, repetitief gedrag en hogere angst. Daarom, cavefish dienen als een dierlijk model voor geëvolueerd gedrag. Deze methoden maken gebruik van vrije-software en op maat gemaakte scripts die kunnen worden toegepast op andere soorten gedrag. Deze methoden praktisch en kostenbesparend alternatieven bieden voor verkrijgbare opsporingssoftware.

Inleiding

De Mexicaanse tetra, Astyanax mexicanus (Teleostei: Characidae), is uniek onder de vissen voor het feit dat twee radicaal verschillende alternatieve morphs - een morph slechtzienden, oppervlakte-woning en een blinde, grot-woning morph bestaat uit verschillende afzonderlijke bevolking:1. Hoewel verschillend in de morfologie en fysiologie, zijn ze nog steeds interfertile2,3. Deze interfertile morphs lijken te snel (~ 20.000 jaar)4, waardoor ze een ideale modelsysteem voor de studie van snelle aanpassing geëvolueerd. Cavefish is bekend dat er een suite van uiteenlopende morfologische en gedrags eigenschappen met inbegrip van grotere dichtheid van de smaakpapillen, toegenomen aantal mechanosensors, foerageren gedrag afgestemd op een bepaalde frequentie van een trillend stimulus, hyperactiviteit, en slapeloosheid. Veel van deze problemen waarschijnlijk geëvolueerd gelijktijdig, waarvan sommige hebben gesuggereerd gunstig in de duisternis van de grotten voor foerageren5 en behoud van energie in de donkere en voedsel-sparse omgevingen6,7.

In vele evolutionaire modelsystemen is het moeilijk te verwerven van geïntegreerde kennis over hoe dieren morfologie en gedrag veranderen in antwoord op het milieu, omdat de meeste soorten zijn verdeeld over een continu verloop in complexe omgevingen. Het schril contrast tussen de grot en de oppervlakte morph Astyanax die geëvolueerd in zeer uiteenlopende omgevingen afgebakend door een scherpe ecotone heeft echter geleid tot Astyanax ontpopt zich als een uitstekend model om dierlijke evolutie te begrijpen. Dit maakt het mogelijk maken gemakkelijker genen en ontwikkelings processen met adaptieve karaktertrekken en selectie in de omgeving. Bovendien heeft de recente biomedisch onderzoek van deze eigenschappen in Astyanax aangetoond dat deze eigenschappen kunnen parallel menselijke symptomen8,9,10. Bijvoorbeeld zijn verlies van socialiteit en slaap, en aanwinst van hyperactiviteit, repetitief gedrag en cortisol niveau vergelijkbaar met wat is waargenomen bij de mens met autisme spectrum stoornis8.

Om aan te pakken de complexe Co-evolutie van veel gedragingen en morfologische kenmerken, is het voordelig om velen van hen wil onderliggende genetische en moleculaire pathways assay. Hierin gepresenteerd zijn methoden voor het karakteriseren van de mate van grot-type gedrags fenotypes van oppervlak, grot, en hybride morphs van Astyanax. De focal gedrag geanalyseerd om te karakteriseren fenotype zijn grot-aangepast foerageren gedrag (attractie trillingsgedrag, genoemd voortaan VAB) en hyperactiviteit/slaap duur11,12. Ook gepresenteerd, is een imaging methode voor het zintuigstelsel VAB13zijn gekoppeld. Onlangs, zijn veel open-source tracking software voor het uitvoeren van gedrags assays beschikbaar14,15geworden. Deze werken heel goed voor korte video's, op minder dan 10 minuten lang. Nochtans, wordt het problematisch als de video langer vanwege de tijd van de intensief berekening/bijhouden is. Staat verkrijgbare software kunnen duur zijn. De methoden gepresenteerd hoofdzakelijk gebruik van freeware en daarom worden beschouwd als kosteneffectieve en high-throughput methoden. Ook inbegrepen zijn representatieve resultaten op basis van deze methoden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures worden uitgevoerd volgens de richtlijnen beschreven in "Beginselen van Laboratory Animal Care" (National Institute of Health publicatie nr. 85-23, herzien 1985) en de goedgekeurde door de Universiteit van Hawaï in Manoa institutionele Animal Care en gebruik Comité dierlijke protocol 17-2560-3.

1. trillingen attractie gedrag (VAB) assay (≤ 10 min. voor volledige opname procedure)

Opmerking: Gebruik een infrarood gevoelige camera of een infrarood camera te bouwen door het wijzigen van een USB-webcam. Zie een gedetailleerde beschrijving, gepresenteerd door de Keene Lab in cavefish dezen op JoVE (uit deze kwestie van A. mexicanus ), of een korte beschrijving in de aanvullende materialen wijzigen van een USB-webcam.

  1. Opname-instelling
    1. Om ervoor te zorgen dat de camera in positie blijft, nog steeds, en op de juiste brandpuntsafstand van het onderwerp(en) wordt opgenomen, bouwen een vlakkevloertheater frame uit polyvinylchloride (PVC) leidingen, meten van 120 cm H x 45 L x 90 cm cm W.
    2. Na de bouw van het frame, bedek het met een plastic blackout gordijn zoals de ene bestemd voor hydrocultuur landbouw.
    3. Op de top van het frame, zet een zwart acryl bord met een venster voor de infrarood camera in het midden meten van dezelfde diameter als de C gemonteerde Verstelbare zoom lens. In deze doos, plaatst u de VAB assay apparatuur (Figuur 1).
  2. Trillingen toestellen
    Opmerking: Trillingen worden geproduceerd met behulp van een kleine functiegenerator.
    1. Voor de volgende methoden, tune trillingen met een amplitude van 0,15 mm en een frequentie van 40 Hz, die is de frequentie die een maximale respons attractie5,16 lokt.
    2. De functiegenerator verbinden met een horizontale geconfronteerd met spreker.
    3. Een roerstaaf van 7,5 mm diameter 14 cm in lengte aan de stofkap op het gezicht van de spreker koppelt met behulp van de hot-lijm of een pakking lijm.
    4. Loodrecht op deze staaf en naar beneden, hechten een andere 7.5 mm diameter glasstaafje 4 cm in lengte (Figuur 1).
  3. Gedrags test
    1. Acclimatiseren een experimentele A. mexicanus voor 4 dagen in een cilindrische assay kamer gevuld met geconditioneerde water (pH tussen 6,8-7.0, geleidbaarheid ca. 700 µS, temperatuur ca. 22 ˚C) met een 12/12 L/D-cyclus. Controleer of de vis door het observeren van hun latency voedergewassen hebben gewend. Langere latentie dan bij hun thuis tank geeft meer acclimatisering tijd nodig is. Gedurende de acclimatisatie, feed één keer per dag met levende Artemia naupliën.
    2. De dag vóór de dag van de test (na 3 dagen van de acclimatisering), vervangen water in de test kamer met geconditioneerde zoetwater.
    3. Op de dag van de test (na 4 dagen van acclimatisering), beroven experimentele vis van voedsel tot nadat de test voltooid is. Verzadiging zal veranderen hun reactie op trillingen.
    4. Instellen van de opnameparameters in de VirtualDub freeware17: 15 frames/s, codec: x264vfw, opname duur: 3 min 30 s.
    5. De trillingen-emitting apparaat (zie stap 1.2) voor te bereiden door tuning tot 40 Hz. Zie afbeelding 1 voor de uitleg van de toestellen. Spoel de trillende Glasstaafje met gedeïoniseerd water te verwijderen van een in water oplosbare chemicaliën.
    6. Werken in het donker, plaats van de cilinder assay in het werkgebied van de opname verlicht door een infrarood verlichting in de zwarte doos en laat vissen om te acclimatiseren gedurende 3 minuten.
      1. Na de 3 min acclimatisering, opnemen 3 min 30 s van video. Bij het begin van de opname, plaatst u de trillende roerstaaf in de waterkolom (ca. 0,5 cm diepte).
      2. Storingen maken lawaai of trillingen tijdens het positioneren van de trillende roerstaaf in het water als de vis zin kan zelfs de meest kleine.
      3. Voltooien van deze procedure binnen 30 s van het starten van de video-opname om ervoor te zorgen dat meer dan 3 min van het gedrag wordt geregistreerd.
    7. Controleren de video tijdens het opnemen om ervoor te zorgen dat er geen fouten tijdens deze etappe optreden.
    8. Na het beëindigen van de opname, het trillende glazen staafje verwijderen uit de cilindrische assay-zaal en verwijder de test kamer uit het werkgebied van de opname. Herhaal vanaf 1.3.5 voor de volgende vissen.
  4. Video-analyse
    Opmerking: De codec te converteren naar een indeling die ImageJ kunt laden werkt alleen op Windows besturingssysteem18 (tabel 1).
    1. De gecomprimeerde avi-video converteren naar een leesbare indeling voor ImageJ en ingestelde analyse gebruikte parameters.
      1. Installeren AviSynth_260.exe (https://sourceforge.net/projects/avisynth2/), pfmap bouwen 178 (http://pismotec.com/pfm/ap/), en avfs ver1.0.0.5 of ver1.0.0.6 (https://sourceforge.net/projects/avf/). Merk op dat deze methode/programmaversie gevoelig. De geleverde website links zal begeleiden naar de juiste versies (tabel 1).
      2. Batchbestand uitvoeren door te dubbelklikken op avs_creater.bat (aanvullende bestand). Klik met de rechtermuisknop op het avs-videobestand te worden geanalyseerd (Selecteer de avs-bestanden die door avs_creater.bat).
      3. Als video-analyse met behulp van de plugin Tracker in ImageJ vereist laden van de ImageJ macro (aanvullende bestand Macro_VAB_moko.txt), laad de macro door slepen en neerzetten in de GUI shell voor ImageJ. Deze macro kan bepaalde sneltoetsen voor de volgende analyse.
      4. In de werkmap, maak een nieuwe map genaamd "Process_ImageJ".
      5. Klik met de rechtermuisknop op het bestand .avs om te worden geanalyseerd (Selecteer de avs-bestanden die door avs_creater.bat). Selecteer de optie Quick mount . Nadat het avs-bestand wordt als een externe schijf gemonteerd, het avi bestand openen in ImageJ (het avi-bestand heeft de naam eindigt met ".avi").
      6. Als u wilt instellen van de omvang van de afstandsmeting, selecteert u de diameter van de test kamer door een rechte lijn te trekken in de kamer met het lineaire selectiegereedschap, Klik analyseren > Stel schaal functie. Bijvoorbeeld, ingang 9,4 cm als met behulp van een cilindrische schotel met een 9.4 cm-binnendiameter. Vink het vakje van de radio van Global oog op de standaardisering van de schaal voor alle van de volgende video analyses.
    2. Converteren naar binaire stapel en analyse uitvoeren.
      1. Het kopieergebied assay kamer met behulp van het gereedschap ovaal en vervolgens vlak tikken en uitgezocht Afbeelding > dupliceren. Geef de reeks frames te houden voor verdere analyse, bijvoorbeeld, de eerste 2.700 frames te houden nadat de trillende staaf ingevoerd het water (bij 15 fps, die dit precies 3 minuten van de video is) op dit moment.
      2. Schakel de buitenkant van de test kamer en converteren naar een binaire afbeelding door te raken van de sneltoets voor de 7 op het nummer balk van het toetsenbord.
      3. Nadat de achtergrond gewist en verschijnt er een prompt toevoegen een zwarte stip in het midden om aan te geven van de positie van de trillende Glasstaafje met behulp van het gereedschap ovaal al ingesteld op zwart met de functie van de vulling . Klik op OK en verschijnt er een melding naar de aanpassing drempel.
      4. Stel de drempel om een binaire (alle zwart-wit) afbeelding van de vis te maken. De drempel zodanig aanpassen dat de vis in hele videoclips te zien, en selecteer vervolgens toepassen.
      5. De "Tracker" plugin door het raken van de hete sleutel 8 op de nummer bar uitvoeren De minimale pixelgrootte ingesteld op 100 wanneer gevraagd en druk op OK, het genereren van de afstand tussen de trillende staaf en de vis per frame voor alle 3 min van de binaire video.
      6. De mis tracking gegenereerd door lawaai in video aanpassen. Om dit te doen, Controleer het resultatenvenster om aan te geven welke frames terug van het objectnummer 3 of hoger-vermelding extra objecten in die frames (bijvoorbeeld deeltjes in het water of de schaduw van de transparante arm van de staaf) naast de "stok" en "vis" in de frame. Verwijder eventuele extra voorwerpen met behulp van het gereedschap Penseel.
      7. Hit van de hete sleutel 9 op het aantal bar een binaire stapel van beelden van de hele video te exporteren (in geval het nodig is om opnieuw analyseren) en een xls-bestand met coördinaten en afstand gegevens (aanvullende bestanden , CF01.xls, Threshold_CF01.tif en, Trac_CF01.tif ). Hete sleutel 9 zal ook sluit alle bestanden die zijn gekoppeld aan de huidige video. Herhaal stap 1.4.2.1 via 1.4.2.6 voor alle replicatieonderzoeken.
      8. De macroscript uitvoeren (aanvullende bestand JoVE_2cmVAB_template_15fps.xlsm) om te consolideren van meerdere Tracker resultaat bestanden (.xls) in een werkblad en het tellen van het aantal en de duur van de benaderingen in een ruimte van 1,5 cm van de staaf. Benaderingen niet blijvend ten minste 0.5 s zal niet worden meegeteld. Het wijzigen van de parameters van afstand en tijd gerekend als een benadering volgens bepaalde kwesties van belang.
    3. Laat de PC-ruimte op de schijf na het beëindigen van alle analyses. Verwijderen van gekoppelde bestanden aan het vrijmaken van schijfruimte - avi.avi en. avi.avs bestanden (extensies die door de software gegenereerd)-door het uitvoeren van een batch bestand multiunmountdel.bat in de zelfde omslag waar avs_creater.bat werd uitgevoerd in de sectie 1.4.1.2.

2. slaap en hyperactiviteit assay (24u opname)

  1. Gedrags test
    1. Acclimatiseren vijf experimentele vis voor 4 dagen of meer in elke kamer van een douane-ontworpen acryl opname van 10 L aquarium (45.9 x 17,8 cm x 17,8 cm; lengte x breedte x diepte, respectievelijk) gevuld met geconditioneerde water (zie stap 1.3.1).
      1. Scheiden van elke individuele kamer met zwart acryl panelen maken de kamers gelijk in grootte, het meten van 88,9 mm × 177.8 mm × 177.8 mm (Figuur 2). Zorg ervoor dat ter dekking van elke tank om te voorkomen dat vis springen tussen kamers.
      2. De programmeerbare macht timer automatisch inschakelen van witte LED licht voor 12u, en uitgeschakeld voor 12u elke dag tijdens de periode van de acclimatisering (bijvoorbeeld, het lampje op instellen om 7 uur en uit om 7 uur). Dit zal het circadiane ritme van vis later (als het is gevoelig voor entrainment).
      3. Gebruik dekkende, witte acryl planken van soortgelijke dimensie aan de 10 L tank als diffusoren geschiedde wit en infrarood licht door zodat diffuus licht met zelfs intensiteit over alle tanks.
      4. Gedurende de acclimatisatie, voeden zodra een dag met Artemia naupliën wonen en beluchting verstrekt via spons filters in elk aquarium.
        Opmerking: Zorg ervoor vis worden gevoed consistente tijde (dat wil zeggen, 1 x per dag om 9:00 uur) als Voedertijd kan ook invloed hebben op meevoeren van circadiane ritmen19.
      5. Controleer of de vis acclimated hebben worden door het observeren van hun latency voedergewassen. Een langere latentie dan bij hun thuis tank geeft meer acclimatisering tijd nodig is.
    2. De dag voorafgaand aan de dag van de test (3 dagen of meer van de acclimatisering), vervangen water in de kamer van de test met vers geconditioneerd water (zie stap 1.3.1).
    3. Stel de parameter van de opname in de VirtualDub software17: 15 frames/s, codec: x264vfw, opname duur: 86,400 s (24 h).
    4. De infrarood verlichting achter de opname fase inschakelen (Zie Figuur 2). Pas door het observeren van de VirtualDub live beeld op het scherm, de positie van elke aquarium te laten staan van de USB-camera.
    5. Op de dag van opname, voeden elke vis met levende Artemia naupliën, verwijder alle filters van de spons, en de infrarood verlichting inschakelen.
    6. Start 24 uur opname in de ochtend (bijvoorbeeld de begintijd is 9 uur en de eindtijd is 9 uur de volgende dag). Begint met het opnemen van de video en veilig de locatie om te voorkomen dat een verstoring. Periodiek controleren dat de opname wordt uitgevoerd.
    7. Na 24u, door ervoor te zorgen dat de video correct worden opgeslagen. De video overbrengen naar de PC workstation voor het bijhouden en analyseren van de vis gedrag.
  2. Video-analyse
    1. Controleer eerst de video kwaliteit door te kijken naar de verlichting. Controleren of er is een vis in elke sectie, en als er vreemde bewegingen die kunnen leiden tot mis tracking.
    2. Het masker om te voorkomen dat mis tracking buiten het aquarium te bereiden. Twee maskers maken: één voor 'zelfs' en één voor 'oneven' vis, op basis van de volgorde van hun volgorde in de tanks.
    3. Maak twee mappen genaamd "vreemd" en "zelfs" voor de maskers hierboven beschreven. Verplaatsen van de tracking parameter bestand van SwisTrack in elk van deze mappen.
    4. Open de tracking parameter bestand van SwisTrack voor het bijhouden van software (aanvullende bestand Tracking_odd.swistrack of Tracking_even.swistrack). Specificeer het pad naar het video bestand en het masker bestand, vervolgens opslaan en afsluiten van de tracking parameter bestand. Blob nummer en maximale pixels parameters in aanpassen "Blob detectie" en "Dichtstbijzijnde buurman Tracking" componenten, respectievelijk, volgens de experimenten.
    5. Dubbelklik op het uitvoeren van een script van win-automatisering software die automatisch wordt SwisTrack software geopend (aanvullende bestand swistrack_1.exe, swistrack_2.exe, swistrack_3.exe of swistrack_4.exe- dit zijn alle hetzelfde uitvoerbare bestanden), die AIDS in het bijwerken van de adaptieve achtergrond aftrekken in SwisTrack.
    6. Open Tracking_odd.swistrack of Tracking_even.swistrack in de SwisTrack software voor het laden van de tracking parameter bestand. Na het laden van de parameters, klik op uitvoeren om te beginnen met het bijhouden.
    7. Binnen de eerste 9000 frames (600 s, dat wil zeggen, eerste 10 min van de opgenomen video), controleren of vis bijhouden door te kijken naar de adaptieve achtergrond aftrekken, binair masker, werkt en dichtstbijzijnde buurman bijhouden van wijzigingen in de lijst met onderdelen van SwisTrack (Zie begeleidende video). Selecteer vervolgens adaptieve achtergrond aftrekken in de materiaallijst.
    8. Druk op de R -toets op het toetsenbord te hervatten win-automatisering en laat de PC om bij te houden. Tracking duurt 5-7 h per 24 h video voor een desktop met 4-CPU-cores en 8 GB geheugen. Volgens behoeften, uitvoeren van meerdere SwisTrack processen (met inbegrip van de even en oneven arena's van een enkel videobestand) tot het aantal kernen in de CPU. Bijvoorbeeld aankan 4-cores 4 video's tegelijk.
    9. Vermijd het gebruik van deze PC voor andere doeleinden, omdat win-automatiseringsprogramma automatisch de muisaanwijzer beweegt tijdens deze tracking. De eerste 9000 frames worden genegeerd in de volgende procedure.
    10. 3 Perl scriptbestanden (1.fillupGaps2.pl, 2.Calc_fish_id_moko_robust, en 3.pl, 3.Sleep_summary_4cm_movingWindow.pl) toewijzen aan de map met de tracking-bestanden gegenereerd door SwisTrack in de mappen van het 'even' en 'oneven' (zie stap 2.2.3).
    11. Clip van één frame van de video van het FLV-bestand met behulp van VirtualDub en deze clip importeren als een foto in ImageJ. Selecteer de lengte van het aquarium (45.9 cm) in ImageJ en berekenen van pixels/cm verhouding. De verhouding tussen de pixels/cm schrijven in 1.fillGaps2.pl in een teksteditor en sla.
    12. Barkas CygWin programma, een Unix-emulator. Ga naar de map SwisTrack de 3 Perl-scripts bevat met behulp van de cd op de opdrachtregel.
    13. Het perlmanuscript uitvoeren door te typen Perl 1.fillGaps.pl. Deze drie Perl scripts zal elk tracking-bestand toewijzen aan een unieke zaal van het aquarium en analyseren van de slaap duur en zwemmen afstand, terwijl de vis wakker was. Het duurt 1-2 h te voltooien van de analyse.
    14. Beoordelen van het tekstbestand met de naam Summary_Sleep.txt om te bepalen of het aantal frames gedaald van de analyse aanvaardbaar laag is; ontbreken van minder dan 15% van frames wordt beschouwd als aanvaardbaar.
    15. Kopieer en plak de geanalyseerde resultaten van Summary_Sleep.txt naar een werkblad met de macro (aanvullende bestand Sleep_12hr12hr_TEMPLATE.xlsm).
    16. Voer de macro als u wilt uitpakken de samenvattingsgegevens van trackingsbestanden.

3. DASPMI of DASPEI verkleuring van de mechanosensory neuromasten

Opmerking: DASPMI en DASPEI vlekken lichtgevoelig is en moet worden gedaan in donkere omstandigheden. Volgens protocol is voor zowel DASPMI en DASPEI met behulp van DASPMI als voorbeeld.

  1. Kleuring protocol
    1. Voor een totaal van 1 L voorraad kleurstofoplossing (25 µg/mL), Voeg 0,025 g van DASPEI of DASPMI kristallen tot 1 L voor dH2O en laat het 's nachts los. Bewaar de oplossing bij 4 ° C bewaard en beschermd tegen licht.
    2. Dompel de vis in 2,5 µg Mo/mL DASPMI of DASPEI opgelost in geconditioneerde water (zie stap 1.3.1) gedurende 45 min. in een donkere omgeving bij 22 ° C.
    3. Na 45 min, verwijderen van vis uit de DASPMI of DASPEI oplossing en anesthetize door onderdompeling in een ijsbad van geconditioneerde water met 66,7 µg/mL gebufferd-ethyl 3-aminobenzoaat methaan sulfonaat zout (MS222).
    4. Mount vis in een petrischaal plaat en foto onder een fluorescente microscoop. Z-stack beelden maken en opslaan als .tif-bestanden voor de volgende analyse.
  2. Beeldanalyse met behulp van ImageJ
    1. Binnen de map met .tif-bestanden, plakken een sjabloon van het ImageJ macro bestand (Neuromast_ImageJ.txt) en maak een nieuwe map genaamd "Process_ImageJ". Stel in de ImageJ-bestand voor macrofuncties, het pad naar de huidige map.
    2. Start van ImageJ en open de macro door de macro-bestand in de GUI te slepen of door te klikken op bestand > Open en het macro-bestand te selecteren.
    3. De macro uitvoeren door te klikken op macro's > Macro uitvoeren. De macro zal dan automatisch het openen van een afbeeldingsbestand te analyseren. Als het afbeeldingsbestand niet wordt geopend, klikt u op Macro > bestand halen.
    4. Kies voor Neuromast de kwantificering, de regio van belang met behulp van Gereedschap Veelhoek.
    5. Sloeg de hete sleutel 5 dubbele regio van belang.
    6. Gebruik het Gereedschap te verwijderen of dots voor extra of ontbrekende neuromast uit de vorige afbeelding toevoegen en daarna sloeg 6. Na het raken van 6, twee nieuwe Vensters zullen verschijnen: regeling van genummerde neuromasten punten en een tafel met totale neuromasten gekwantificeerd.
    7. Hit 7 om op te slaan van beide bestanden: één bestand wordt opgeslagen als een TIF-afbeeldingsbestand en de andere wordt opgeslagen als een xls-bestand. Nadat deze bestanden zijn opgeslagen, verschijnt er een nieuw afbeeldingsbestand voor analyse.
    8. De graven van de neuromast van elke vis in één werkblad samenvoegen door het uitvoeren van de macroscript (SN_Number_Diameter.xlsm).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De hier vermelde resultaten zijn representatieve voorbeelden van wat kan worden verkregen met de gepresenteerde methoden. Resultaten kunnen daarom afwijken iets van degene die hier gepresenteerd voor zowel cavefish en oppervlakte vissen afhankelijk van de experimentele omstandigheden.

Attractie trillingsgedrag

Representatieve resultaten voor VAB kunnen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Deze voorgestelde methoden zijn gemakkelijk te bereiken maar kunnen ingewikkeld om uit te voeren vanwege de aard van zijn freeware oorsprong. Daarom is het sterk aanbevolen om het proces testen en analyses voor een werkelijke experimenten uit te voeren.

Het tarief van gegevens generatie kunnen snelle zodra het experimentele en analytische kader worden vastgesteld. Zodra vastgesteld, is het mogelijk record twee vis in 7 min voor de VAB-assay, 30 vis in 24 uur voor de activiteit/slaap assay en é...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken alle leden van de Yoshizawa lab met inbegrip van N. Cetraro, N. Simon C. Valdez, C. Macapac, J. Choi, L. Lu, J. Nguyen, S. Podhorzer, H. Hernandes, J. Fong, J. Kato en I. Lord voor vis verzorging op de experimentele vis gebruikt in dit manuscript. Wij danken ook A. Keene lab leden met inbegrip van P. Mašek om te trainen mijn te monteren IR CCD-camera. Tot slot bedank we het Media Lab - College voor sociale wetenschappen - School of Communications aan de Universiteit van Hawaï Mānoa voor hun onschatbare hulp bij het maken van de video, vooral B. Smith, J. Lam en S. White. Dit werk werd gesteund door Hawaiian Gemeenschap Foundation (16CON-78919 en 18CON-90818) en nationaal instituut van gezondheid NIGMS (P20GM125508) geeft aan MY.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
4-Di-1-ASP (4-(4-(dimethylaminostyryl)-1-methylpyridinium iodide)MilliporeSigmaD3418
880 nm wave length black lightAdvanced IlluminationBL41192-880
avfsfreewareVersie 1.0.0.6http://turtlewar.org/avfs/
AvisynthfreewareVersie 2.6.0http://avisynth.nl/index.php/Main_Page
CygwinfreewareVersie 2.11.0https://www.cygwin.com/
Cilindrische testkamer (Pyrex 325 ml glazen schaal)Corning3140-10010 cm diameter 5 cm hoog
Ethovision XTNoldus Information  Technology, Wageningen, NederlandVersie 14https://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt
Vis Aquarium Cilinder Zachte Spons Steen Waterfilter, ZwartJardin (via Amazon.com)NASponzenfilter voor slaap/hyperactiviteitsrecordersysteem
Grade A pekelgarnaal eierenPekelgarnaal directBSEA16Z
ImageJfreewareVersie 1.52ehttps://imagej.nih.gov/ij/
macro 1.8/12.5-75mm C-mount zoomlensToyoNAAansluiten op USB webcam door c-mount te gebruiken, die is geprint in 3-D printer
Neutrale regulatorSeachemNA
Optische gegoten kunststof IR lange-doorlaatfilterEdmund optics43-948Snijden in een klein stuk om in de CCD van USB webcam te passen
pfmapfreewareBuild 178http://pismotec.com/download/ (bij “Download Archive” link onderaan)
Reef Crystals Reef ZoutInstant OceanRC15-10
SwisTrackfreewareVersie 4https://en.wikibooks.org/wiki/SwisTrack
USB webcam (LifeCam Studio 1080p HD Webcam)MicrosoftQ2F-00013Snijden 2-2,5 cm van de voorkant
WinAutomationfreewareVersie 8https://www.winautomation.com/ (gratis standalone app voor deze procedure)
Windows besturingssysteemMicrosoft7, 8 of 10https://www.microsoft.com/en-us/windows
x264vfwfreewareNAhttps://sourceforge.net/projects/x264vfw/

Referenties

  1. Keene, A. C., Yoshizawa, M., McGaugh, S. E. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , Elsevier Inc. Amsterdam. (2015).
  2. Mitchell, R. W., Russell, W. H., Elliott, W. R. Mexican eyeless characin fishes, genus Astyanax: Environment, distribution, and evolution.Special publications the museum Texas Tech University. (12), Texas Tech Press. Texas. (1977).
  3. Wilkens, H. Evolution and genetics of epigean and cave Astyanax-fasciatus (Characidae, Pisces) - Support for the neutral mutation theory. Evolutionary Biology. 23, 271-367 (1988).
  4. Fumey, J., Hinaux, H., Noirot, C., Thermes, C., Rétaux, S., Casane, D. Evidence for late Pleistocene origin of Astyanax mexicanus cavefish. BMC Evolutionary Biology. 18 (1), 1-19 (2018).
  5. Yoshizawa, M., Gorički, S., Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Current Biology. 20 (18), 1631-1636 (2010).
  6. Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican cavefish save energy by eliminating the circadian rhythm in metabolism. PloS One. 9 (9), e107877(2014).
  7. Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. The energetic cost of vision and the evolution of eyeless Mexican cavefish. Science Advances. 1 (8), e1500363(2015).
  8. Yoshizawa, M., et al. The Evolution of a Series of Behavioral Traits is associated with Autism-Risk Genes in Cavefish. BMC Evolutionary Biology. 18 (1), 89(2018).
  9. Riddle, M. R., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555 (7698), 647-651 (2018).
  10. Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature Genetics. 38 (1), 107-111 (2006).
  11. Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13 (1), 15(2015).
  12. Duboué, E. R., Keene, A. C., Borowsky, R. L. Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations. Current Biology. 21 (8), 671-676 (2011).
  13. Fernandes, V. F. L., Macaspac, C., Lu, L., Yoshizawa, M. Evolution of the developmental plasticity and a coupling between left mechanosensory neuromasts and an adaptive foraging behavior. Developmental Biology. 441 (2), 262-271 (2018).
  14. Pérez-Escudero, A., Vicente-Page, J., Hinz, R. C., Arganda, S., de Polavieja, G. G. idTracker: tracking individuals in a group by automatic identification of unmarked animals. Nature Methods. 11, 743(2014).
  15. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
  16. Yoshizawa, M., Jeffery, W. R., Van Netten, S. M., McHenry, M. J. The sensitivity of lateral line receptors and their role in the behavior of Mexican blind cavefish (Astyanax mexicanus). Journal of Experimental Biology. 217 (6), (2014).
  17. Lee, A. Virtualdub. , http://www.virtualdub.org/ (2014).
  18. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  19. Cavallari, N., et al. A blind circadian clock in cavefish reveals that opsins mediate peripheral clock photoreception. PLoS Biology. 9 (9), e1001142(2011).
  20. Swimmer, B., Lang, H. H. Surface Wave Discrimination between Prey and Nonprey by the Back Swimmer Notonecta glauca L. (Hemiptera , Heteroptera ). 6 (3), Springer Stable. https://www.jstor.org/stable/4599284 233-246 (1980).
  21. Montgomery, J. C., Macdonald, J. A. Sensory Tuning of Lateral Line Receptors in Antarctic Fish to the Movements of Planktonic Prey. 235 (4785), American Association for the Advancement of Science Stable. https://www.jstor.org/stable/1698962 195-196 (1987).
  22. Prober, D. A., Rihel, J., Onah, A. A., Sung, R. J., Schier, A. F. Hypocretin/orexin overexpression induces an insomnia-like phenotype in zebrafish. The Journal of Neuroscience. 26 (51), 13400-13410 (2006).
  23. Zhdanova, I. V., Wang, S. Y., Leclair, O. U., Danilova, N. P. Melatonin promotes sleep-like state in zebrafish. Brain Research. 903 (1-2), 263-268 (2001).
  24. Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (95), e52321(2015).
  25. Rasband, W. S. Object Tracker. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/tracker.html (2000).
  26. Ferreira, T., Rasband, W. Create Shortcuts. ImageJ User Guide. , https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-31.html#sub:Create-Shortcuts... (2012).
  27. Lochmatter, T., Roduit, P., Cianci, C., Correll, N., Jacot, J., Martinoli, A. SwisTrack. , https://en.wikibooks.org/wiki/SwisTrack (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Trillingsaantrekkingsgedragtracking van grottenvissenAstyanax mexicanusDASPEI-kleuringSwisTrack-analysecreatie van binaire maskersverwerking met Perl-scriptsinfrarood tegenlichtbeeldvorminghigh-throughput gedragstracking
Gedrags Tracking en Neuromast beeldvorming van Mexicaanse Cavefish
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.