Karakterisering van Histone posttranslationele wijziging wijzigingen in gist neurodegeneratieve Proteinopathy modellen

Summary

Dit protocol beschrijft experimentele procedures karakteriseren van genoom-brede veranderingen in de niveaus van Histon posttranslationele modificaties (PTM) die zich voordoen in verband met de overexpressie van eiwitten ALS en Parkinson in zijn gekoppeld Saccharomyces cerevisiae modellen. Na SDS-pagina de scheiding, worden individuele Histon PTM niveaus gedetecteerd met wijziging-specifieke antilichamen via het westelijke bevlekken.

Abstract

Neurodegeneratieve ziekten, zoals Amyotrofische laterale sclerose (ALS) en de ziekte van Parkinson (PD), leiden tot het verlies van honderden duizenden levens per jaar. Effectieve behandelingsopties kunnen stoppen progressie van de ziekte ontbreken. Ondanks de inspanningen van de uitgebreide rangschikken in grote populaties van de patiënt blijven de meeste ALS en PD gevallen onverklaarbare door genetische mutaties alleen. Epigenetica mechanismen, zoals de posttranslationele wijziging van Histon eiwitten, kunnen worden betrokken in de etiologie van neurodegeneratieve ziekte en de progressie en leiden tot nieuwe streefcijfers voor farmaceutische interventie. Zoogdieren in vivo en in vitro modellen van ALS en PD zijn duur en vereisen vaak langdurige en moeizame experimentele protocollen. We schetsen hier, een praktische, snelle en kosteneffectieve aanpak bij de vaststelling van genoom-brede wijzigingen in Histon wijziging niveaus met behulp van Saccharomyces cerevisiae als een modelsysteem. Dit protocol voorziet in uitgebreide onderzoeken naar de epigenetische veranderingen verbonden met neurodegeneratieve proteinopathies die eerdere bevindingen in verschillende modelsystemen bevestigen terwijl aanzienlijk uitbreiden van onze kennis van de neurodegeneratieve ziekte epigenome.

Introduction

Neurodegeneratieve ziekten zijn verwoestende ziekten met weinig tot geen behandelingsopties beschikbaar. Onder deze zijn Amyotrofische laterale sclerose (ALS) en de ziekte van Parkinson (PD) bijzonder verschrikkelijk. Ongeveer 90% van de gevallen van ALS en PD worden beschouwd als sporadisch, die zich zonder familiegeschiedenis van de ziekte, terwijl de resterende gevallen uitgevoerd in gezinnen en in het algemeen zijn gekoppeld aan een specifiek gen mutatie^1,2. Interessant, zijn beide van deze ziekten geassocieerd met de eiwitten mislocalization en aggregatie^3,

Protocol

1. het transformeren van S. cerevisiae met neurodegeneratieve proteinopathy-geassocieerde proteïne constructies

1. Groeien wild type (WT) 303 gist in gist extract pepton dextrose (YPD) Bouillon overnachting met schudden (200 rpm) bij 30 ° C.
2. Na 12−16 h van groei, Verdun gist om een optische dichtheid bij 600 nm (OD₆₀₀) van 0,25 met YPD. Zoals 10 mL vloeibare gist-cultuur nodig zal zijn voor elke transformatie, 50 mL vloeibare gist-cultuur voorbereiden op vijf transformaties overeenkomt met FUS, TDP-43, a-synuclein, en vector enige (ccdB) constructies, evenals een transformatie van de negatieve controle zonder DNA.
3. Groeien....

Results

Ter illustratie van deze methode, zullen we gebruik maken van de onlangs gepubliceerde resultaten³⁰. WT menselijke FUS en TDP-43 waren overexpressie voor 5 h, terwijl WT α-synuclein was overexpressie gedurende 8 uur. Een ccdB constructie werd gebruikt als een vector negatieve controle. Figuur 2 toont groei onderdrukking in vaste en vloeibare culturen. Gist is gekapt zoals beschreven en westelijke bevlekken met wijziging-specifieke anti.......

Discussion

Het protocol hier beschreven biedt een eenvoudige, doelmatige en kosteneffectieve manier van het categoriseren van genoom-brede Histon PTM wijzigingen gecorreleerd met neurodegeneratieve proteinopathies. Hoewel er andere modellen van ALS en PD, zoals in vitro modellen menselijke cellijnen en RattenUitrustingen³², S. cerevisiae blijft aantrekkelijk vanwege haar gebruiksgemak. Bijvoorbeeld, gist modellen vereisen geen gebruik van een steriele kap, noch hoeven zij de intensieve ople.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
-His DO Supplement	Clontech	630415
10x Running Buffer			Mix: 141.65 g glycine (ThermoFisher BP381-1), 30.3 g Tizma base (Sigma-Aldrich T6066), 10 g sodium dodecyl sulfate (Sigma-Aldrich L3771), and 1 L deionized water, pH 8.8.
12% Polyacrylamide Gels	BIO-RAD	456-1041
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Anti-acetyl-Histone H3 (Lys14) Primary Antibody	MilliporeSigma	07-353 (Lot No. 2762291)	Dilution: 1/1000
Anti-acetyl-Histone H4 (Lys 16) Primary Antibody	Abcam	ab109463 (Lot No. GR187780)	Dilution: 1/2000
Anti-acetyl-Histone H4 (Lys12) Primary Antibody	Abcam	ab46983 (Lot No. GR71882)	Dilution: 1/5000
Anti-dimethyl-Histone H3 (Lys36) Primary Antibody	Abcam	ab9049 (Lot No. GR266894, GR3236147)	Dilution: 1/1000
Anti-Histone H3 Primary Antibody	Abcam	ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335)	Nuclear Loading Control; Dilution: 1/2000
Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) Primary Antibody	Abcam	ab188292 (Lot No. GR211874)	Dilution: 1/1000
Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Primary Antibody	Abcam	ab5176 (Lot No. GR264582, GR192662, GR3217296)	Dilution: 1/1000
BioPhotometer D30	Eppendorf	6133000010
Cell Culture Dish (100 x 20 mm)	Eppendorf	30702118
Cell Culture Plate, 96 well	Eppendorf	30730011
Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R	Eppendorf	22625501
Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW	LI-COR	926-32212 (Lot No. C60301-05, C61116-02, C80108-05)	Dilution: 1/5000
Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD	LI-COR	926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07)	Dilution: 1/2500
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Extra thick blot paper (filter paper)	BIO-RAD	1703968
Galactose	Sigma-Aldrich	G0750	Prepare 20% w/v stock solution.
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Prepare 20% w/v stock solution.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Prepare 50 % w/v solution.
Immobilon-FL Transfer Membranes	MilliporeSigma	IPFL00010
Lithium acetate dihydrate (LiAc)	Sigma-Aldrich	L4158	Prepare a 1 M solution.
Loading Dye			Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL glycerol, 1.2 mL 0.5M Trizma base pH 6.8, 0.93 g DL-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich D0632), and 2.1 mL deionized water.
Methanol	ThermoFisher	A412-4
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell	BIO-RAD	1658004
Multichannel pipet	Eppendorf	2231300045
NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10x	New England Bio Labs	102855-152
Nhe I Restriction Enzyme	New England Bio Labs	101228-710
Nuclease Free Water	Qiagen	129114
Odyssey Fc Imaging System	LI-COR Biosciences	2800-03
OmniTray Cell Culture Treated w/Lid Sterile, PS (86 x 128 mm)	ThermoFisher	165218
pAG303GAL-a-synuclein-GFP	Gift from A. Gitler
pAG303GAL-ccdB	Addgene	14133
pAG303Gal-FUS	Addgene	29614
pAG303GAL-TDP-43	Gift from A. Gitler
Poly(ethylene glycol) (PEG)	Sigma-Aldrich	P4338	Prepare a 50% w/v solution.
Ponceau S Stain	Sigma-Aldrich	P3504	Mix: 0.5 g 0.1% w/w Ponceau S dye, 5 mL 1% v/v acetic acid (Sigma-Aldrich 320099), and 500 mL deionized water.
PowerPac Basic Power Supply	BIO-RAD	164-5050
Raffinose pentahydrate	Sigma-Aldrich	R7630	Prepare 10% w/v stock solution.
Salmon Sperm DNA	Agilent Tech	201190
SD-His plates			Mix: 20 g Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids (ThermoFisher 291920), and 900 mL deionized water.
SGal-His plates			Mix: 20 g Agar, 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids, 100 mL galactose solution, and 900 mL deionized water.
Sodium dodecyl sulfate Loading Buffer			Store at -20 oC. 6X, Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue, 0.93 g DL-Dithiothreitol, 2.1 mL deionized water, 4.7 mL glycerol, and 1.2 mL 0.5 M Trizma base, pH 6.8.
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	221465	Prepare 0.2 M solution.
Sucrose	Sigma-Aldrich	84097	Prepare 20% w/v stock solution.
TBS + 0.1% Tween 20 (TBST)			Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949), and 900 mL deionized water.
TBS Blocking Buffer	LI-COR	927-5000
Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell	BIO-RAD	170-3940
Transfer Buffer			Mix: 22.5 g glycine, 4.84 g Tizma base, 400 mL methanol, 1 g sodium dodecyl sulfate, and 1.6 L deionized water.
Tris-Buffered Saline (TBS)			10X, 7.6 pH, Solution: Mix 24 g Trizma base, and 88 g sodium chloride (Sigma-Aldrich S7653). Fill to 1 L with deionized water.
WT 303 S. cerevisiae yeast	Gift from J. Shorter
Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD)	Sigma-Aldrich	Y1375